基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接研究桂芍葛芎湯治療偏頭痛的作用機(jī)制

徐利飛 陸素琴 李 慧 董秋平

南京中醫(yī)藥大學(xué)鎮(zhèn)江附屬醫(yī)院 鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000

偏頭痛是以反復(fù)發(fā)作的單側(cè)搏動性頭痛為主要臨床表現(xiàn)，常合并有惡心嘔吐、畏聲光電刺激等伴隨癥狀[1]。偏頭痛常見于青春期起病，女性居多，發(fā)病年齡在35 ～39 歲達(dá)到高峰[2]。近年來偏頭痛呈逐年增高的趨勢，有研究顯示[3]，約50%的患者長期受偏頭痛困擾，患者正常生活和工作效率發(fā)生改變，而30%的患者頭痛發(fā)作時(shí)根本無法生活和工作。目前西醫(yī)治療偏頭痛以藥物緩解疼痛癥狀為主，長期使用療效不佳，易造成藥物過度性偏頭痛。中醫(yī)藥治療偏頭痛歷史悠久，長期的臨床實(shí)踐以及臨床試驗(yàn)研究肯定了中醫(yī)藥的療效和安全性[4]。

桂芍葛芎湯是由鎮(zhèn)江市名中醫(yī)陸素琴教授在經(jīng)典名方桂枝加葛根湯的基礎(chǔ)上化裁而成，臨床上常用于血瘀寒凝型偏頭痛的治療，并取得滿意療效。鑒于該組方藥物多、活性成分復(fù)雜，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對桂芍葛芎湯治療偏頭痛的“藥物活性成分-潛在靶標(biāo)-作用通路”進(jìn)行預(yù)測性分析，并將靶點(diǎn)基因進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，旨在為桂芍葛芎湯治療偏頭痛的深入研究提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 桂芍葛芎湯活性成分靶點(diǎn)和偏頭痛靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP 對桂芍葛芎湯進(jìn)行活性成分檢索篩選。篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。利用GeneCards、GEO、DisGenet 以及OMIM 數(shù)據(jù)庫，篩選條件：檢索詞設(shè)置為“migraine”進(jìn)行靶點(diǎn)檢索，獲取偏頭痛的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.2 桂芍葛芎湯治療偏頭痛靶點(diǎn)篩選

將所得到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別輸入Venny 2.1 軟件，并制作韋恩圖，得到桂芍葛芎湯和偏頭痛的共有靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將藥物和疾病的共有靶點(diǎn)輸入數(shù)據(jù)庫（STRING）進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，制作PPI 的網(wǎng)絡(luò)圖譜。將STRING 數(shù)據(jù)庫獲得的TSV 文件導(dǎo)入到CytoScape 3.7.2 軟件，將得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，進(jìn)而篩選出化合物作用于疾病的關(guān)鍵靶基因。

1.4 中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了解中藥、化合物和相應(yīng)靶點(diǎn)之間作用關(guān)系，構(gòu)建中藥- 化合物- 靶點(diǎn)- 通路- 疾病網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入CytoScape 3.7.2 軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的制作。

1.5 交互靶點(diǎn)基因本體（gene ontology，GO）和京都基因組與基因組百科全書通路（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將藥物與疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，富集條件為默認(rèn)原始設(shè)置，靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析，以P＜ 0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.6 分子對接

將桂芍葛芎湯各藥物的核心靶點(diǎn)與關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對接，驗(yàn)證兩者的結(jié)合能力，采用Discovery Studio 軟件對Docking Score 絕對值≥5的對接分子構(gòu)建3D 模型。

2 結(jié)果

2.1 桂芍葛芎湯成分靶點(diǎn)和偏頭痛靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過對桂芍葛芎湯成分靶點(diǎn)篩選，共得到中藥活性成分共104 個(gè)。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫對104個(gè)活性成分分別進(jìn)行檢索，篩選得到藥物靶點(diǎn)958個(gè)。通過對偏頭痛靶點(diǎn)篩選，對檢索到的疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重，得到疾病靶點(diǎn)3736 個(gè)。

2.2 桂芍葛芎湯治療偏頭痛靶點(diǎn)韋恩圖繪制

對篩選出的疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩圖的繪制，得到416 個(gè)共有靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 化合物-疾病共有靶點(diǎn)可視化

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選結(jié)果

藥物和疾病共有靶點(diǎn)繪制的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其中416 個(gè)節(jié)點(diǎn)，6492 條邊，平均度值為31.2。將PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，依?jù)Degree 值排名篩選出桂芍葛芎湯作用于疾病的關(guān)鍵靶基因。見圖2 ～3、表1。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選結(jié)果

圖2 中藥-疾病共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 中藥-疾病共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以中藥、化合物和作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了中藥- 化合物- 靶點(diǎn)- 通路- 疾病網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。

圖4 中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點(diǎn)的功能及通路分析

2.5.1 GO 富集功能分析 GO 富集功能分析共有924個(gè)條目。其中包括細(xì)胞成分（cellular component，CC）142 個(gè)，生物學(xué)過程（biological processes，BP）1053個(gè)，分子功能（molecular function，MF）252 個(gè)。運(yùn)用微生信對排名前十的富集條目進(jìn)行可視化分析，見圖5。其中橫坐標(biāo)表示靶點(diǎn)數(shù)，P值越大則越偏向藍(lán)色，左側(cè)表示BP、CC、MF，P值越小顏色越偏向紅色。

圖5 交互靶點(diǎn)GO 功能富集分析

2.5.2 KEGG 富集功能分析 KEGG 富集功能分析共有180 條信號通路。運(yùn)用微生信對排名前十的富集條目進(jìn)行可視化分析。主要與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、鈣信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、癌癥的途徑、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染、內(nèi)分泌抵抗、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染、胰腺癌、氮代謝、膀胱癌、化學(xué)致癌作用-受體激活、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、Rap1 信號通路、FoxO 信號通路、急性髓系白血病等過程相關(guān)，見圖6，其中橫坐標(biāo)表示基因的數(shù)量，左側(cè)表示各通路名稱，顏色表示P值，P值越小越偏向紅色，P值越大則越偏向綠色。

圖6 KEGG 通路富集分析結(jié)果

2.6 分子對接

為檢驗(yàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵活性成分結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。兩者結(jié)合能力的強(qiáng)弱用Affinity 值表示，配體和受體的結(jié)合越穩(wěn)定，則結(jié)合能力越低。表2 和圖7 ～8 顯示了核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力及ALB 的結(jié)合模式。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能力（kcal/mol）

圖8 基于分子對接ALB 和formononetin 的結(jié)合模式

3 討論

中醫(yī)關(guān)于偏頭痛早有記載，《內(nèi)徑》稱之為“頭風(fēng)”“腦風(fēng)”等，中醫(yī)認(rèn)為偏頭痛病因不外乎內(nèi)感和外傷兩大類。頭為“精明之府”“諸陽之會”，外邪可以直接侵襲頭部，經(jīng)脈痹阻而發(fā)為頭痛；內(nèi)傷久病，正氣虛衰，腦脈失于濡養(yǎng)，則不榮則痛。本病中醫(yī)治療原則以溫經(jīng)散寒，活血化瘀為大法。相比西醫(yī)治療而言，中醫(yī)療法能明顯減少頭痛發(fā)作頻次，顯著改善頭痛程度，具有安全性高，副作用小的優(yōu)勢[5]。桂芍葛芎湯是在經(jīng)典名方桂枝加葛根湯的基礎(chǔ)上加減配伍而成，臨床療效頗豐，現(xiàn)將該組方治療偏頭痛可能的作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，研究結(jié)果如下。

通過本研究得到桂芍葛芎湯藥物靶點(diǎn)958 個(gè)，涉及活性成分共104 個(gè)。偏頭痛靶點(diǎn)3736 個(gè)，桂芍葛芎湯治療偏頭痛的潛在作用靶點(diǎn)416 個(gè)。在桂芍葛芎湯諸多活性成分中，花旗松素、β-谷甾醇、谷甾醇、兒茶酚、過氧麥角甾醇等活性成分在治療偏頭痛的過程中發(fā)揮了重要作用。花旗松素（toxifolin）又名二氫槲皮素、紫葉杉素，是一種天然抗氧化劑，被稱為“清基之王”，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理活性[6]。研究表明，花旗松素可降低血液的黏稠度，改善毛細(xì)血管微循環(huán)，從而達(dá)到改善頭痛的作用[7]。β-谷甾醇具有顯著的抗氧化性、抗炎性，可使細(xì)胞中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-1β 等因子減少，進(jìn)而減輕頭痛的炎癥反應(yīng)[8]。

通過相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，桂芍葛芎湯治療偏頭痛排名前五的核心靶點(diǎn)基因包括白蛋白（albumin，ALB），腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），IL-6，蘇氨酸蛋白激酶（threonine protein kinase，AKT1），甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。炎細(xì)胞因子TNF、IL-6 參與偏頭痛的病理生理學(xué)過程，并且與中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛覺關(guān)系緊密[9-10]。有研究表明，由于頭痛患者體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答吞噬和殺傷能力降低，引起體內(nèi)細(xì)菌脂多糖增加，進(jìn)而誘導(dǎo)TNF 和IL-6 的釋放過量，引發(fā)神經(jīng)源性炎癥，參與神經(jīng)源性疼痛[11]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1 存在于人外周血單核細(xì)胞中，為評價(jià)炎癥的重要指標(biāo)之一，與炎癥密切相關(guān)，通常是炎癥各種通路的一份子[12]。由此表明，通過相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析可以看出桂芍葛芎湯治療偏頭痛具有多靶點(diǎn)特點(diǎn)。

通過對桂芍葛芎湯治療偏頭痛的通路富集分析可以得出，在諸多通路中，癌通路是其中復(fù)雜且重要的通路之一，包含了IL-6、核因子（nuclear factor，NF）-κB、MAPK 和PI3K/AKT 等通路。有研究顯示，通過激活PI3K/AKT 通路可以提高神經(jīng)保護(hù)功能，從而抑制氧化應(yīng)激神經(jīng)元的自噬[13]。神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)是偏頭痛發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)，而抑制NF-κB 和MAPK 通路的激活可減輕神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生[14-15]。本研究進(jìn)一步從分子對接的角度闡述蛋白和配體的結(jié)合活性，選取了ALB 和IL-6 的兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，結(jié)果表明，桂芍葛芎湯的主要活性成分與關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)均具有良好的對接活性，進(jìn)一步證實(shí)了桂芍葛芎湯的有效成分可通過調(diào)控ALB、TNF、IL-6、AKT1 等核心靶點(diǎn)基因，通過上述各富集信號通路發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的研究方法對桂芍葛芎湯治療偏頭痛的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測分析，在一定程度上揭示了桂芍葛芎湯可通過多成分、多通路、多靶點(diǎn)防治偏頭痛，為桂芍葛芎湯的推廣應(yīng)用提供了理論及基礎(chǔ)依據(jù)。本研究存在一定的局限性，研究結(jié)論僅局限于數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)，在今后的臨床和實(shí)驗(yàn)研究工作中需進(jìn)一步對篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)及相關(guān)通路加以驗(yàn)證。