基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究柴胡清肝湯治療肉芽腫性乳腺炎的作用機制

謝 璐 萬 華 吳雪卿 馮佳梅 高晴倩 瞿文超 邵士珺 孫佳曄

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院乳腺科，上海 200021

肉芽腫性乳腺炎（granulomatous mastitis，GM）是非哺乳期乳腺炎常見的類型之一，臨床癥見乳房腫塊、紅腫、疼痛等，可伴有發(fā)熱、咳嗽、結(jié)節(jié)性紅斑、關(guān)節(jié)炎等全身癥狀，病情反復(fù)，病程遷延，好發(fā)于非哺乳期、非妊娠期的中青年女性[1-2]。近年來發(fā)病率逐年遞增，在全球其發(fā)病率占所有乳腺疾病的0.3%～1.9%，在發(fā)展中國家的發(fā)病率約占乳腺良性病變的4%～5%[3-5]。該病歸屬于中醫(yī)學(xué)“粉刺性乳癰”范疇，1985 年顧伯華教授首次明確提出該病的概念并收錄至《實用中醫(yī)外科學(xué)》[6]。

肝經(jīng)郁熱證為該病常見的證型之一，臨床表現(xiàn)為乳房結(jié)塊紅腫熱痛、按之灼熱，或化膿潰破，可伴發(fā)熱、頭痛、便秘、溲黃，舌質(zhì)紅、苔黃膩、脈弦數(shù)或滑數(shù)?！度庋磕[性小葉性乳腺炎中醫(yī)診療專家共識（2021 版）》[7]、“十三五”規(guī)劃教材《中醫(yī)外科學(xué)》[8]等均推薦柴胡清肝湯治療肝經(jīng)郁熱證GM，治擬疏肝清熱、活血化瘀、調(diào)暢氣機。

臨床研究報道證實，柴胡清肝湯治療可顯著改善肝郁化熱型急性進展期GM 中醫(yī)證候評分，減輕乳房疼痛，縮小乳房腫塊，有效率較高[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，該方對肉芽組織增生有顯著的抑制作用[10]。但柴胡清肝湯治療GM 潛在的作用機制尚不明確，因此本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探索該方的作用機制和潛在靶點，為臨床治療提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 柴胡清肝湯有效成分和相關(guān)靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http: //tcmspw.com/tcmsp.php/）數(shù)據(jù)庫中，分別以柴胡清肝湯12 味中藥為關(guān)鍵詞進行檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 作為限定條件，篩選得出該方的有效活性成分。運用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https: //sparql.uniprot.org/）對靶點蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)名稱。

1.2 GM相關(guān)靶點的獲取及關(guān)鍵靶點的獲取

以“granulomatous mastitis”為關(guān)鍵詞在GeneCards（https: //www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索，獲取疾病相關(guān)靶點。將藥物有效成分靶點和疾病靶點導(dǎo)入Venny 2.1.0 繪制韋恩圖，得到柴胡清肝湯治療GM 的藥物-疾病關(guān)鍵靶點。

1.3 柴胡清肝湯治療GM靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物、有效成分、疾病相關(guān)靶點及其屬性文件數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 中，繪制柴胡清肝湯與GM 的成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 交集靶點的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物-疾病交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https: //www.string-db.org）中，選擇物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)定為“medium confidence（0.4）”，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 中進行可視化處理。

1.5 GO富集和KEGG通路富集分析

將柴胡清肝湯治療GM 的交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（https: //david.ncifcrf.gov/），設(shè)置P＜ 0.05。GO 富集分析從生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）3 個模塊進行。將富集結(jié)果的條目繪制成條形圖和氣泡圖，由在線數(shù)據(jù)分析可視化平臺（https: //www.bioinformatics.com.cn/）繪制。

1.6 關(guān)鍵靶點的分子對接驗證

根據(jù)拓撲學(xué)參數(shù)Degree 值（度值）計算得出排名前5 位的核心活性成分，從TCMSP 數(shù)據(jù)下載MOL2 格式的3D 結(jié)構(gòu)，將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0 進行能量最小化；從PDB 數(shù)據(jù)庫下載核心蛋白基因的3D 結(jié)構(gòu)，使用Pymol 2.3.0 進行去除蛋白結(jié)晶水、原始配體等操作，利用AutoDocktools（v1.5.6）對核心活性成分和關(guān)鍵靶點進行加氫、計算電荷等操作并保存為pdbqt 格式。使用POCASA 1.1 預(yù)測蛋白結(jié)合位點，采用AutoDock Vina 1.1.2 進行對接。利用PyMOL 2.3.0 和Ligplot V2.2.5 對對接結(jié)果進行相互作用模式分析，根據(jù)結(jié)合能大小評估化合物與核心蛋白靶點的結(jié)合活性，選取結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為篩選條件，以評價兩者的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 柴胡清肝湯與GM作用靶點網(wǎng)絡(luò)分析

經(jīng)過篩選共獲得柴胡清肝湯有效成分199個、有效成分靶點293 個、GM 疾病相關(guān)靶點79 個，其中有效成分和疾病交集靶點共23 個（圖1）。通過Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建柴胡清肝湯與GM 可視化網(wǎng)絡(luò)（圖2），利用Network Analyzer 進行PPI 拓撲學(xué)參數(shù)分析，共得到478 個節(jié)點、4374 條邊。以Degree值進行排序，藥物活性成分排名前5 位的分別是（圖3）：槲皮素（MOL000098，quercetin）、山柰酚（MOL000422，kaempferol）、β-谷甾醇（MOL000358，beta-sitosterol）、豆甾醇（MOL000449，stigmasterol）和黃芩素（MOL000173，wogonin），由此推測柴胡清肝湯可能通過以上有效成分在治療GM 中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖1 柴胡清肝湯有效活性成分與GM 的交集靶點韋恩圖

圖2 柴胡清肝湯與GM 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 排名前5 位的柴胡清肝湯有效成分

2.2 柴胡清肝湯治療GM核心靶點分析及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將23 個交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，經(jīng)篩選后得到23 個節(jié)點、163 條邊（圖4）。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 中，利用Network Analyzer進行PPI 拓撲學(xué)參數(shù)分析，以Degree 值排序，取排名前10 位的節(jié)點為核心靶點，即IL-6、TNF、ALB、IL-1β、CXCL8、STAT3、CCL2、IL-4、IFNG、CRP，并繪制可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），由此推測柴胡清肝湯作用于以上靶點發(fā)揮治療GM 的作用。

圖4 柴胡清肝湯治療GM 關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將23 個藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行GO 富集分析，以P＜ 0.05 為篩選條件，BP 富集結(jié)果共129 個條目，CC 富集共9 個條目，MF 富集共13 個條目，根據(jù)Count 前10 位的富集結(jié)果作GO 功能富集分析圖（圖6）。結(jié)果顯示，BP 主要包括炎癥反應(yīng)、基因表達的正向調(diào)控、對脂多糖的細胞反應(yīng)、DNA 轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等；CC 主要包括細胞外空間、細胞外區(qū)域、外泌體、質(zhì)膜等；MF 主要包括蛋白結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞因子活性、酶結(jié)合、受體結(jié)合等。將Count 排名前15 位的KEGG核心通路構(gòu)建KEGG 功能富集圖（圖7），主要包括IL-17、Toll 樣受體、細胞因子受體相互作用、NF-κB、TNF 等信號通路。

圖6 柴胡清肝湯治療GM 交集靶點的GO 功能富集圖

圖7 柴胡清肝湯治療GM 交集靶點的KEGG 通路富集圖

2.4 柴胡清肝湯主要有效成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，篩選Degree 值排名前5 位的有效活性成分槲皮素（MOL000098，quercetin）、山柰酚（MOL000422，kaempferol）、β- 谷甾醇（MOL000358，beta-sitosterol）、豆甾醇（MOL000449，stigmasterol）和黃芩素（MOL000173，wogonin），及Degree 值較大的作用靶點IL-6（PDB ID：1ALU）、TNF（PDB ID：2E7A）、IL-1β（PDB ID：6I8Y）、CXCL8（PDB ID：6N2U）、STAT3（PDB ID：6NJ2）、IL-4（PDB ID：2D48），進行分子對接，取結(jié)合能力最高的對接結(jié)果進行可視化處理（圖8），結(jié)果顯示關(guān)鍵活性成分與核心靶點的結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol。

圖8 柴胡清肝湯有效活性成分與作用靶點的分子對接結(jié)果

3 討論

GM 是一類好發(fā)于非哺乳期、非妊娠期的慢性乳腺化膿性疾病，歸屬于中醫(yī)學(xué)“粉刺性乳癰”的范疇，病程遷延反復(fù)，復(fù)發(fā)率高，影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。目前，該病病因尚未明確，可能與自身免疫功能紊亂、細菌感染、乳頭凹陷、高泌乳素血癥等相關(guān)[11-13]。

肝經(jīng)郁熱證為該病臨床最常見的證型之一，臨床常用柴胡清肝湯加減治療。柴胡清肝湯出自明代陳實功《外科正宗》，由柴胡、川芎、當(dāng)歸、赤芍、生地黃、黃芩、山梔、天花粉、防風(fēng)、牛蒡子、連翹、甘草共12 味藥物組成，諸藥配伍，以“清消”為貴，發(fā)揮疏肝解郁、清熱解毒、和營消腫的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實柴胡清肝湯可通過抑制IL-6、IL-2、IL-4、TGF-β 等促炎因子的表達，作用于NLRP3/IL-1β 通路抑制GM 的炎癥發(fā)展[14]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究柴胡清肝湯治療GM 的潛在作用靶點，共獲得柴胡清肝湯有效活性成分199 個、有效成分靶點293 個、藥物-疾病共同靶點23 個，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素等有效活性物質(zhì)可能作用于IL-6、TNF、ALB、IL-1β、CXCL8、STAT3、CCL2、IL-4、IFNG、CRP 等靶點，干預(yù)IL-17、Toll 樣受體、細胞因子受體相互作用、NF-κB、TNF 等信號通路。分子對接結(jié)果顯示，柴胡清肝湯中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等關(guān)鍵活性成分與核心靶點的結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol，驗證了運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索柴胡清肝湯治療GM 作用機制的可靠性。

GM 病理鏡下表現(xiàn)為肉芽腫周圍炎性細胞的致密集合[15]，免疫應(yīng)答中起主要作用的是巨噬細胞，重要特征是單核/巨噬細胞的活化[16]。巨噬細胞具有高度的可塑性，暴露于不同的誘導(dǎo)環(huán)境時，功能上可極化為促炎性（M1）表型和修復(fù)性（M2）表型[17]。在炎癥病理情況下，乳腺微環(huán)境穩(wěn)態(tài)喪失，平衡傾向于促炎，引起巨噬細胞表型向M1 型極化。結(jié)合本研究關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖、GO 功能富集圖、KEGG 通路富集圖的研究結(jié)果，柴胡清肝湯可能通過多靶點、多通路作用于M1/M2 巨噬細胞表型極化，調(diào)節(jié)多種下游多種炎癥因子的表達，干預(yù)GM 的病程發(fā)展。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，從分子機制層面初步分析柴胡清肝湯治療GM 的主要有效成分和作用機制，結(jié)果顯示柴胡清肝湯可通過多成分、多靶點、多通路作用于GM 的疾病治療，潛在的作用機制可能與調(diào)節(jié)巨噬細胞功能相關(guān)，但缺乏實驗研究的驗證，后續(xù)將對具體機制行進一步的科學(xué)探索和驗證。