胸腺肽α1對銅綠假單胞菌感染支氣管擴(kuò)張癥大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

梁秋亭 謝襯梨 王惠嫦 柳元斌 陳立沖 袁煒良

廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東東莞 523900

銅綠假單胞菌是氣道常見致病菌，在人體免疫失衡時，會突破免疫屏障，從局部侵入并大量繁殖，導(dǎo)致氣道炎癥，破壞氣管壁及周圍肌肉組織，引起支氣管、毛細(xì)支氣管管腔擴(kuò)張[1]。隨著病情進(jìn)展，支氣管擴(kuò)張癥患者將面臨呼吸困難，甚至肺功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。有學(xué)者建議將感染性支氣管擴(kuò)張癥的治療靶點放在“抗免疫失衡”上[3]。嚴(yán)錫祥等[4]將胸腺肽α1 用于治療重癥肺部感染性疾病，取得顯著療效，證明胸腺肽α1 具備免疫調(diào)節(jié)作用，該藥可改善患者的免疫失衡問題。但回顧近年研究文獻(xiàn)，未見胸腺肽α1 應(yīng)用于感染性支氣管擴(kuò)張癥方面的研究。本研究通過一項動物實驗，探討胸腺肽α1 對銅綠假單胞菌感染支氣管擴(kuò)張癥大鼠免疫調(diào)節(jié)的影響，論證胸腺肽α1 治療支氣管擴(kuò)張癥的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

將2022 年10 月至2023 年2 月采購于廣州艾舒娜生物科技有限公司的50 只銅綠假單胞菌介導(dǎo)的Balb/c 大鼠納入研究，動物許可證號：SYXK（粵）2022-0293。隨機(jī)抽取其中10 只大鼠，處死后剝離氣管、支氣管、肺臟，依照常規(guī)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；隨后取20 只大鼠應(yīng)用胸腺肽α1 皮下注射治療，為觀察組，雄雌比例1 ∶1，3 ～6 周齡，平均（4.78±1.12）周，體重20 ～27 g，平均（24.02±2.49）g；另20 只大鼠應(yīng)用生理鹽水皮下注射，為對照組，雄雌比例1 ∶1，3 ～6 周齡，平均（4.73±1.10）周，體重19 ～26 g，平均（23.78±2.13）g。所有大鼠的操作及飼養(yǎng)符合東莞市濱海灣中心醫(yī)院實驗動物倫理委員會規(guī)定。

本研究使用LightScanner 32 Real Time PCR 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國Idaho 公司）及其配套試劑；FlexiWash FW400 自動化蛋白免疫印跡雜交系統(tǒng)（cellagen technology）及其配套試劑；Attune 流式細(xì)胞儀（賽默飛世爾科技公司）及其配套試劑；BK-EL10C酶標(biāo)儀（山東博科醫(yī)用材料有限公司）及其配套試劑。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌感染支氣管擴(kuò)張大鼠的模型建立方法 取仰臥位固定大鼠，常規(guī)消毒后麻醉，在距唇下3 cm 的頸部做一縱切口，長度約1 cm，縱向分離氣管。于環(huán)狀軟骨下較寬的氣管軟骨間隙做一橫切口，長度約2 cm，備氣管插管。自制氣管插管，緩伸至胸骨角下約3 cm 處，有抵觸感即達(dá)右側(cè)肺底葉。使用微量進(jìn)樣器經(jīng)插管快速注入0.02 ml（1012 CFU/ml）菌液和1 ml 氣體后，撥管并豎起固定板，讓大鼠呈垂直體位，避免大鼠術(shù)后呼吸障礙。待大鼠呼吸平穩(wěn)，縱向縫合氣管切口，橫向兩層縫合頸部肌群與皮膚。

1.2.2 藥物干預(yù) 觀察組大鼠，腹腔皮下注射胸腺肽α1（Patheon ltalia S.P.A.公司，國藥準(zhǔn)字H20171177，規(guī)格：1.6 mg/支）0.5μg/kg，q12h×3 d，對照組大鼠皮下注射生理鹽水（同等容積注射）。

1.2.3 樣本采集 于建模后第28 天處死全部存活大鼠36 只（其中對照組4 只大鼠分別于建模后第19、20、22、26 天死亡，確定死亡后即刻采集樣本），收集支氣管肺泡灌洗液與鼠尾外周血作為觀察樣本。經(jīng)鈍頭靜脈采血針，于氣管朝肺泡灌入1.5 ml無菌PBS 緩沖液，收集1 ml 支氣管肺泡灌洗液并離心；大鼠尾巴處抽取外周血2 ml，離心后置于-80℃環(huán)境冷藏待檢。

1.2.4 病理實驗 大鼠處死后剝離氣管、支氣管、肺臟，依照常規(guī)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。以戊二醛用石蠟包埋、固定肺組織，切片，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，隨后觀察組織學(xué)改變情況。依照病理實驗判定大鼠建模成功。

1.3 觀察指標(biāo)

通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）方法測定線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）含量，免疫蛋白印跡試驗檢測Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）9 表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測定支氣管肺泡灌洗液及外周血白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）4+細(xì)胞計數(shù)、CD8+細(xì)胞計數(shù)、輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）17 細(xì)胞計數(shù)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）細(xì)胞計數(shù)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測支氣管肺泡灌洗液及外周血白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2、IL-6、IL-10、IL-17 的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

觀察組層次清晰，上皮細(xì)胞和纖毛整齊排列，無滲出物，管腔內(nèi)外無炎性細(xì)胞浸潤，腔內(nèi)偶見分泌物，肺泡組織清晰，肺泡壁未見增厚，無異常增生與浸潤。

為進(jìn)一步判定大鼠建模成功，再觀察對照組大鼠的組織學(xué)情況，見大鼠支氣管管壁有不同程度破壞，伴有局部潰瘍，管腔擴(kuò)張明顯，同級支氣管腔內(nèi)有局部炎性細(xì)胞和濾泡增生。部分支氣管在血管內(nèi)，可見充血、出血情況，血管周圍有炎性浸潤，肺泡腔和肺間質(zhì)中有大量炎性細(xì)胞浸潤，病變區(qū)域大鼠肺泡結(jié)構(gòu)受損，肺泡壁變薄，有斷裂融合為大皰的情況，一些肺泡腔伴有不同程度的出血，說明實驗大鼠建模成功。見圖1。

圖1 肺組織病理（HE 染色）結(jié)果

2.2 兩組mtDNA、TLR9水平比較

觀察組mtDNA 水平高于對照組，TLR9 水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 兩組mtDNA、TLR9水平比較（）

表1 兩組mtDNA、TLR9水平比較（）

注 MtDNA：線粒體DNA；TLR9：Toll 樣受體9

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2.3 兩組CD4+、CD8+細(xì)胞計數(shù)比較

觀察組CD4+細(xì)胞計數(shù)、CD8+細(xì)胞計數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 兩組CD4+、CD8+細(xì)胞計數(shù)比較（個/mm2，）

表2 兩組CD4+、CD8+細(xì)胞計數(shù)比較（個/mm2，）

注 CD：外周血白細(xì)胞分化抗原

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2.4 兩組Th17、Treg水平比較

觀察組Th17 水平高于對照組，Treg 水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表3。

表3 兩組Th17、Treg水平比較（%，）

表3 兩組Th17、Treg水平比較（%，）

注 Th17：輔助性T 細(xì)胞17；Treg：調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞

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2.5 兩組IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平比較

觀察組IL-2、IL-6、IL-17 水平低于對照組，IL-10水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表4。

表4 兩組IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平比較（ng/L，）

表4 兩組IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平比較（ng/L，）

注 IL：白細(xì)胞介素

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3 討論

支氣管擴(kuò)張癥與支氣管炎有本質(zhì)上的區(qū)別，首先，前者病情基本為慢性進(jìn)展，后者急性發(fā)病情況并不少見；其次，前者為不可逆性的支氣管壁結(jié)構(gòu)性病變，而后者為可逆性病變[5]。支氣管擴(kuò)張癥病因眾多，其中以感染最為常見[6]。Chandrasekaran等[7]研究顯示，感染銅綠假單胞菌是發(fā)病的主要因素?；颊呷糁委煵划?dāng)，易引發(fā)呼吸障礙、肺源性心臟病等嚴(yán)重不良預(yù)后。近年來該病的發(fā)病率有所增加，針對該病的治療研究，應(yīng)予重視[8]。

mtDNA 是線粒體基因組，有與細(xì)菌DNA 相似的結(jié)構(gòu)末甲基化鳥嘌呤島，其作為一種缺乏保護(hù)性內(nèi)含子、組蛋白與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的裸DNA 分子，具有高突變性[9]。研究表明[10]，mtDNA 能夠激活機(jī)體先天免疫與炎癥反應(yīng)，并參與炎癥過程，故mtDNA成為一些炎癥疾病的治療新靶點。目前已知的哺乳動物TLR 有13 種，該物質(zhì)主要在樹突細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)，在調(diào)節(jié)獲得性/固有免疫反應(yīng)上具備顯著作用[11]。目前已知TLR3 以外的所有TLR 種類，均可啟動MyD88 依賴途徑，刺激核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），誘導(dǎo)炎癥因子過量表達(dá)[12]。TLR9 位于細(xì)胞內(nèi)膜，可與致病菌中尚未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（motifs oligodeoxynucleotides，CpG DNA）特異性結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和中下游分子，此時機(jī)體內(nèi)一些炎癥因子會過量釋放，這是TLR9 參與人體炎癥反應(yīng)的機(jī)制[13]。若TLR9 特異性地識別mtDNA 中未甲基化的CpG 島，會引發(fā)瀑布鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)。治療細(xì)菌感染所致的支氣管擴(kuò)張癥，治療靶點為mtDNA與TLR9。改善上述生理指標(biāo)的表達(dá)水平，或許有助于改善患者的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠接受胸腺肽α1 皮下注射治療，其mtDNA水平、TLR9 水平有所改善（相較于對照組而言），本研究表明：①mtDNA、TLR9 參與大鼠支氣管擴(kuò)張癥病情進(jìn)展；②胸腺肽α1 治療支氣管擴(kuò)張癥的藥用機(jī)制或許為調(diào)節(jié)mtDNA、TLR9 水平。Treg細(xì)胞參與免疫應(yīng)答過程，Th17 細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)。Th17 細(xì)胞分泌IL-17，為T 輔助細(xì)胞，促炎；而Treg 細(xì)胞分泌IL-10，是免疫調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞，與促炎因子相互制約，與Th17 相抗衡[14]。保障機(jī)體良好的內(nèi)環(huán)境，改善炎癥情況，需維持好Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞之間的平衡。本研究結(jié)果顯示，觀察組Th17 水平高于對照組，Treg 水平低于對照組，表明觀察組大鼠的免疫耐受維持情況更佳，組織間的動態(tài)平衡更加理想。觀察組IL-2、IL-6 水平低于對照組，表明觀察組大鼠的機(jī)體炎癥反應(yīng)得到進(jìn)一步改善。

究其原因是觀察組大鼠注射了胸腺肽α1，該藥物為28 個氨基酸構(gòu)成的短肽（酸性多肽），為典型的免疫調(diào)節(jié)劑，在癌癥人群中應(yīng)用較多，近年來一些學(xué)者以該藥糾正患者的免疫功能，改善患者的免疫失衡問題。在規(guī)范用藥下，機(jī)體細(xì)胞免疫功能會進(jìn)一步增強(qiáng)。藥物主要是通過影響T 細(xì)胞亞群含量，從而發(fā)揮免疫“增效”作用。呂建寧等[15]研究強(qiáng)調(diào)，CD4+細(xì)胞計數(shù)、CD8+細(xì)胞計數(shù)與淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)整之間存在影響，前者參與細(xì)胞免疫，后者參與體液免疫；臨床一般通過檢測CD4+、CD8+細(xì)胞計數(shù)水平，評估患者是否出現(xiàn)免疫障礙。譚穎[16]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胸腺肽α1 治療，支氣管擴(kuò)張患者的CD4+、CD8+細(xì)胞計數(shù)水平較給藥前顯著提升，這與本研究中“觀察組大鼠CD4+細(xì)胞計數(shù)、CD8+細(xì)胞計數(shù)高于對照組”的結(jié)果一致，證實胸腺肽α1能夠改善病鼠的免疫失衡問題。呂建寧等[15]強(qiáng)調(diào)，胸腺肽α1 治療支氣管擴(kuò)張癥，藥效機(jī)制還可能與抗氧化、阻斷病灶氯離子通道、下調(diào)內(nèi)皮素-1 水平等因素有關(guān)，藥物能夠改善氣道收縮功能，使氣管舒張，有助于緩解患者的呼吸困難問題。

綜上所述，mtDNA、TLR9 參與銅綠假單胞菌感染支氣管擴(kuò)張癥大鼠的發(fā)病過程，疾病進(jìn)展與機(jī)體免疫失衡、炎癥進(jìn)展有關(guān)。胸腺肽α1 治療銅綠假單胞菌感染支氣管擴(kuò)張癥，通過干預(yù)上述發(fā)病機(jī)制，提高大鼠機(jī)體免疫力，改善炎癥反應(yīng)，應(yīng)用價值高。本研究存在一些局限性，主要在于研究時間不長、大鼠的觀察樣本量不足，這可能會在一定程度上導(dǎo)致本研究結(jié)論欠客觀。因此未來需要進(jìn)一步延長研究時間、擴(kuò)大樣本量，以提高研究的客觀性。