陰道分泌物常規(guī)檢測模式性能評價(jià)和復(fù)檢規(guī)則分析

陸庭嫣 顧丹鳳 王亞虹 葛亞芳 楊海鷗

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院檢驗(yàn)科 上海市胚胎源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030）

陰道分泌物顯微鏡鏡檢（白帶常規(guī)）是女性細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）、外陰陰道假絲酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）、滴蟲性陰道炎（trichomonas vaginitis，TV）和炎癥細(xì)胞評估的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目[1]。近年來，隨著檢驗(yàn)技術(shù)自動(dòng)化和智能化的不斷發(fā)展，白帶常規(guī)檢測經(jīng)歷了從人工鏡檢到半自動(dòng)干化學(xué)分析，再到全自動(dòng)有形成分聯(lián)合干化學(xué)檢測的發(fā)展過程[2-5]，檢測效率逐步提升。然而，干化學(xué)酶檢測具有局限性[6-9]，白帶有形成分具有多樣性[10]，為了驗(yàn)證和了解各種檢測模式對疾病篩查的準(zhǔn)確性和敏感性，本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備，對不同檢測模式的臨床漏診率和實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢率進(jìn)行分析，建立優(yōu)選檢測模式顯微鏡復(fù)檢規(guī)則，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2021年2—5月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院門診患者陰道拭子1 334份，其中1 064份用于建立規(guī)則的樣本不限制送檢科室來源和患者年齡，連續(xù)隨機(jī)納入，每天不超過50份；270份用于規(guī)則驗(yàn)證的樣本主要選自婦科門診、宮頸門診等陰道炎癥患者較多的臨床科室門診，以確保小樣本量情況下BV、VVC、TV的陽性驗(yàn)證需求。樣本采集部位和方法參照第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[1]。

1.2 儀器和試劑

重慶天海公司BD500白帶檢測分析儀和配套一次性計(jì)數(shù)板、清洗液。石家莊博洋生物科技公司陰道炎五聯(lián)檢試劑盒。鄭州安圖公司AutowoMO生殖道分泌物干化學(xué)檢測儀和配套試劑。日本Olympus公司CX41光學(xué)顯微鏡。革蘭染液（珠海貝索公司）。

1.3 方法

采集后的樣本由專人負(fù)責(zé)處理，取樣后1 h內(nèi)完成檢測。將儀器檢測后的剩余樣本混勻，用一次性滴管等量滴加2張玻片，1張用于人工鏡檢白細(xì)胞計(jì)數(shù)和線索細(xì)胞、菌絲/孢子、滴蟲；1張待自然干燥后用火焰固定，行革蘭染色鏡檢。2種鏡檢分別由1名有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)技師雙盲完成。根據(jù)說明書要求進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.3.1 參考方法

依據(jù)國內(nèi)外相關(guān)指南[11-13]推薦的B V、VVC、TV診斷參考方法，本研究將濕片鏡檢聯(lián)合革蘭染色鏡檢（簡稱聯(lián)合鏡檢）結(jié)果作為不同檢測模式性能評估和復(fù)檢方案驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)。濕片鏡檢判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[1]，革蘭染色鏡檢判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Nugent評分標(biāo)準(zhǔn)[14]。以濕片10個(gè)高倍鏡視野均值為白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；革蘭染色5～10個(gè)視野區(qū)域內(nèi)Nugent評分≥7分為BV陽性；以濕片鏡檢或革蘭染色鏡檢任一方法陽性為真菌菌絲/孢子陽性；滴蟲以濕片鏡檢陽性為標(biāo)準(zhǔn)，但當(dāng)鏡下活動(dòng)度減弱疑似不確定時(shí)，需補(bǔ)充核酸檢測進(jìn)行確認(rèn)，并以核酸檢測結(jié)果為準(zhǔn)。

1.3.2 檢測模式

模式1：陰道炎五聯(lián)檢；模式2：儀器法干化學(xué)酶檢測；模式3：儀器法有形成分分析；模式4：儀器法有形成分分析聯(lián)合陰道炎五聯(lián)檢；模式5：儀器法有形成分聯(lián)合儀器法干化學(xué)酶檢測。

1.3.3 3類初始復(fù)檢方案

目前，我國陰道分泌物自動(dòng)/半自動(dòng)檢測系統(tǒng)的顯微鏡復(fù)檢方案相關(guān)文獻(xiàn)較少，也缺乏相應(yīng)的規(guī)范化文件可供參考。陰道分泌物有形成分和干化學(xué)檢測的方法和原理與同為體液學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的尿液有形成分和干化學(xué)分析極為相似，但又與尿液檢測中細(xì)胞的定量分析要求不同：BV、VVC、TV相應(yīng)病原體在陰道分泌物有形成分中的形態(tài)識別和確認(rèn)是疾病篩查的重要依據(jù)。《陰道微生態(tài)評價(jià)的臨床應(yīng)用專家共識》[15]指出，若形態(tài)學(xué)檢測與功能學(xué)檢測結(jié)果不一致，以形態(tài)學(xué)結(jié)果為主要參考指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室基于陰道分泌物檢測特性，并參考張時(shí)民[16]和吳曉華等[17]對尿液有形成分和干化學(xué)分析的基本篩檢規(guī)則，設(shè)立了3類初始復(fù)檢方案。

1）方案1。單獨(dú)進(jìn)行干化學(xué)檢測時(shí)，BV、VVC、TV任一項(xiàng)目提示陽性時(shí)，進(jìn)入顯微鏡復(fù)檢程序。2）方案2。單獨(dú)使用圖像式有形成分分析儀時(shí)，線索細(xì)胞、真菌菌絲/孢子、滴蟲任一有形成分陽性時(shí)，進(jìn)入儀器圖譜審核程序，如圖譜陽性成分形態(tài)典型，直接判為陽性，反之判為陰性；若圖譜陽性成分形態(tài)不典型或圖像對焦不清晰難以辨別，則進(jìn)入顯微鏡復(fù)檢程序。3）方案3。有形成分分析和干化學(xué)酶檢測聯(lián)合使用，2種方法陽性結(jié)果相符或有形成分分析陽性而干化學(xué)酶檢測陰性時(shí)，以儀器圖譜有形成分結(jié)果為準(zhǔn)，陽性形態(tài)典型者直接判斷為陽性，錯(cuò)誤識別者判為陰性，陽性形態(tài)非典型或圖像不清晰難以辨別者進(jìn)入顯微鏡復(fù)檢程序。有形成分分析陰性而干化學(xué)酶檢測陽性時(shí)：查看儀器圖譜“未分類、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞”分類欄是否有未被識別的陽性成分，如有典型的分類錯(cuò)誤或未識別的陽性成分，則修正結(jié)果為陽性，若未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)陽性成分，則判為陰性。

1.3.4 顯微鏡復(fù)檢程序

1）BV顯微鏡復(fù)檢程序。濕片高倍鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)典型的線索細(xì)胞或大量的雜菌成團(tuán)聚集（革蘭染色可見Nugent評分≥7分的細(xì)菌成團(tuán)聚集的特征，簡稱為BV相關(guān)細(xì)菌團(tuán)），可以直接判斷為BV陽性，反之為陰性；若濕片高倍鏡鏡檢不典型或難以辨別線索細(xì)胞，則通過Nugengt評分進(jìn)行二次確認(rèn)。

2）VVC、TV顯微鏡復(fù)檢程序。濕片鏡檢發(fā)現(xiàn)典型的真菌菌絲/孢子、滴蟲者，可直接判斷為VVC陽性、TV陽性；未觀察到則為陰性。

1.3.5 不同檢測模式性能評價(jià)

以聯(lián)合鏡檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)5種檢測模式的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率和符合率。選擇敏感性、符合率最高的檢測模式對相關(guān)疾病進(jìn)行初篩。

對濕片鏡檢的白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和儀器法有形成分分析的白細(xì)胞等級進(jìn)行一致性評估：儀器法有形成分分析白細(xì)胞分級陰性為0級，+為1級，++為2級，+++為3級；濕片鏡檢白細(xì)胞計(jì)數(shù)0～5個(gè)/高倍鏡視野為0級、5～15個(gè)/高倍鏡視野為1級、15～30個(gè)/高倍鏡視野為2級、≥30個(gè)/高倍鏡視野為3級。

1.3.6 優(yōu)選檢測模式復(fù)檢規(guī)則的建立和驗(yàn)證

在初始復(fù)檢規(guī)則的基礎(chǔ)上，再對優(yōu)選檢測模式的假陰性結(jié)果進(jìn)行分析，利用有形成分與干化學(xué)項(xiàng)目的對應(yīng)關(guān)系，調(diào)整復(fù)檢規(guī)則。在復(fù)檢量可接受的情況下，加大儀器陽性報(bào)警提示，以降低假陰性漏檢的概率，從而建立優(yōu)選檢測模式的復(fù)檢規(guī)則。再根據(jù)國內(nèi)外通用的復(fù)檢規(guī)則評估指標(biāo)[18-21]評估優(yōu)選檢測模式復(fù)檢規(guī)則的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率（漏診率）和復(fù)檢率，驗(yàn)證復(fù)檢規(guī)則的臨床適用性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例或率表示，比較采用配對四格表χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合鏡檢結(jié)果

聯(lián)合鏡檢結(jié)果顯示，用于建立復(fù)檢規(guī)則的1 064份樣本中，線索細(xì)胞/Nugent評分≥7分的BV陽性率為18.80%（200/1 064），真菌菌絲/孢子陽性率為14.10%（150/1 064），滴蟲陽性率為1.03%（11/1 064），BV+TV陽性率為0.38%（4/1 064），BV+VVC陽性率為2.82%（30/1 064）?？傟栃月蕿?0.83%（328/1 064）。

2.2 儀器法有形成分分析和濕片鏡檢的一致性

儀器法有形成分分析與濕片鏡檢結(jié)果一致的樣本有672例，一致率為63.16%（672/1 064），Kappa值=0.474。Kendall相關(guān)分析結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)（r=0.738，P＜0.005），Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示白細(xì)胞分級差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。儀器法有形成分分析白細(xì)胞分級較濕片鏡檢平均高1級。見表1。

表1 儀器法有形成分分析和濕片鏡檢結(jié)果一致性分析 份

2.3 5種檢測模式篩查BV、VVC、TV的性能評估結(jié)果

2.3.1 5種檢測模式與聯(lián)合鏡檢結(jié)果的一致性

5種檢測模式中，檢測結(jié)果與聯(lián)合鏡檢檢測結(jié)果一致性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測，最低的是單獨(dú)陰道炎五聯(lián)檢。見表2。

表2 5種檢測模式與參考方法的符合情況

2.3.2 5種檢測模式篩查BV、VVC、TV的性能比較

5種檢測模式篩查BV、VVC的敏感性、特異性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。篩查BV敏感性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測，最低的是陰道炎五聯(lián)檢；篩查VVC敏感性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測，2種單獨(dú)干化學(xué)檢測模式（陰道炎五聯(lián)檢和儀器法干化學(xué)酶檢測）敏感性均較低；5種檢測模式篩查TV的敏感性、特異性均較高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.926）。見表3。

表3 5種檢測模式篩查BV、VVC、TV的性能和總符合率 %

2.3.3 最優(yōu)檢測模式的確定和性能驗(yàn)證

以敏感性和總符合率最高的儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測模式為最優(yōu)方法，在初始復(fù)檢規(guī)則的基礎(chǔ)上分析該模式篩查3種疾病的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率（漏診率）、符合率和復(fù)檢率，結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)檢測模式的檢測性能

2.4 最優(yōu)檢測模式假陰性結(jié)果分析及其初始復(fù)檢規(guī)則的調(diào)整

漏檢BV的88份樣本中，有16份儀器法有形成分分析未檢出線索細(xì)胞；儀器法干化學(xué)酶檢測脯氨酸氨基肽酶（±），但無報(bào)警提示；1份唾液酸苷酶弱陽性樣本有報(bào)警提示，但圖譜審核陰性。為降低BV漏檢率，補(bǔ)充了1條復(fù)檢規(guī)則，見表5規(guī)則4。63份漏檢VVC的樣本中，有12份儀器法干化學(xué)酶檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶（+）或（±）、葡萄糖苷酶和凝固酶同時(shí)（+）或（±），且提示VVC或TV陽性報(bào)警，但儀器法有形成分分析均未檢出真菌菌絲/孢子、滴蟲，儀器圖譜審核也未發(fā)現(xiàn)陽性成分。為降低VVC漏檢率，補(bǔ)充了1條復(fù)檢規(guī)則，見表5規(guī)則5。

表5 最優(yōu)檢測方法復(fù)檢規(guī)則

2.5 復(fù)檢規(guī)則驗(yàn)證

270份樣本驗(yàn)證結(jié)果提示，有67份需復(fù)檢，其中9份需行革蘭染色復(fù)檢BV，總復(fù)檢率為24.81%（67/270），假陰性率較初始規(guī)則低。復(fù)檢規(guī)則驗(yàn)證結(jié)果見表6。

3 討論

傳統(tǒng)的濕片鏡檢白帶常規(guī)是篩查女性下生殖道感染性疾?。˙V、VVC、TV）和炎癥評估最簡單、經(jīng)濟(jì)的方法。但當(dāng)樣本量增多、操作人員的閱片壓力增大時(shí)，閱片經(jīng)驗(yàn)會對檢測結(jié)果造成影響。為解決這一問題，適用于大樣本量的各類半自動(dòng)/全自動(dòng)分析系統(tǒng)越來越多地應(yīng)用于臨床。

圖像識別式白帶有形成分分析儀采用光鏡高倍（40×10）分辨率形態(tài)學(xué)檢查原理，通過計(jì)算機(jī)軟件對圖像進(jìn)行圖形比對，識別各類有形成分，并分類、計(jì)數(shù)[22]。然而，白帶成分的多樣性、復(fù)雜性，以及高倍鏡下細(xì)胞、菌群識別能力的局限性，會導(dǎo)致某些成分的漏判或誤判。

陰道分泌物干化學(xué)分析儀基本均可測定陰道酸堿度、評估乳酸桿菌功能、檢測微生物代謝產(chǎn)物。對于BV、VVC、TV的判斷主要是測定其相對應(yīng)的陰道微生物代謝產(chǎn)物和酶的活性[23]，但是某些標(biāo)記的酶多種微生物均能產(chǎn)生，如氨基葡萄糖苷酶在滴蟲和白念珠菌中均存在，只能依據(jù)pH值來區(qū)分[24]。但pH值的檢測結(jié)果往往又受到陰道沖洗、陰道給藥、經(jīng)期、試紙質(zhì)量、標(biāo)本放置時(shí)間等較多因素的影響[25]，可能會導(dǎo)致錯(cuò)誤的陽性提示。

本研究設(shè)計(jì)了5種白帶常規(guī)檢測模式，基本涵蓋了臨床實(shí)驗(yàn)室常用的陰道分泌物自動(dòng)/半自動(dòng)分析模式。通過參考方法的評估，最終證實(shí)儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測模式篩查BV、VVC、TV的敏感性和符合率優(yōu)于單獨(dú)的干化學(xué)檢測或單獨(dú)的有形成分分析，通過建立聯(lián)合檢測模式復(fù)檢規(guī)則，可進(jìn)一步降低假陰性率。聯(lián)合檢測的優(yōu)勢在于儀器有形成分的自動(dòng)識別和分類大大減輕了人工鏡檢的視覺疲勞和操作人員的主觀性識別差異，掃描成像的各成分形態(tài)圖譜可自動(dòng)分類并進(jìn)行溯源回顧，有助于對陽性結(jié)果的確認(rèn)審核；而搭配了干化學(xué)酶法的相對應(yīng)項(xiàng)目陽性報(bào)警又能彌補(bǔ)儀器有形成分識別分類錯(cuò)誤或漏檢的可能。但是儀器法干化學(xué)酶檢測的檢測能力可能會因試劑品牌有較大差異，且不同檢測原理的有形成分分析儀間形態(tài)識別能力也可能會存在差異。不同實(shí)驗(yàn)室使用不同的儀器、試劑和檢測方法時(shí)，應(yīng)依據(jù)可行標(biāo)準(zhǔn)評估不同儀器特性和不同檢測方法的敏感性、特異性，制定個(gè)性化的復(fù)檢規(guī)則，盡可能降低臨床漏診率。

值得強(qiáng)調(diào)的是，參考方法對于不同檢測方法敏感性、特異性的評估是至關(guān)重要的，不能簡單地參照尿液檢測儀器評估的方法，僅僅以濕片鏡檢結(jié)果做為參考。2018年，BV診斷歐洲指南[11]指出：革蘭染色鏡檢是診斷BV的參考方法，雖然Amsel臨床標(biāo)準(zhǔn)中濕片高倍顯微鏡下的線索細(xì)胞與革蘭染色結(jié)果密切相關(guān)，但其敏感性低于革蘭染色鏡檢，因而僅以濕片鏡檢為參考會造成BV的漏檢。對于VVC的診斷，2018年歐洲指南[11]和2012年我國VVC診治指南[12]均指出：陰道分泌物濕片和革蘭染色鏡檢檢出芽生孢子、菌絲或假菌絲都可診斷VVC，且革蘭染色鏡檢敏感性略高于濕片鏡檢，基于此，本研究以聯(lián)合鏡檢中任一種方法陽性為陽性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，濕片鏡檢與革蘭染色鏡檢篩查BV的敏感性、特異性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），篩查VVC僅敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究參考方法選擇依據(jù)的正確。對于TV的診斷，2018年歐洲指南[11]和2020年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會指南[13]均指出：顯微鏡檢查陰道分泌物懸液觀察陰道毛滴蟲是當(dāng)前最常用來診斷TV的方法，但敏感性只有45%～60%，推薦通過核酸檢測診斷TV。基于此，本研究確認(rèn)將2種鏡檢方式的結(jié)果聯(lián)合判斷可保證參考方法的準(zhǔn)確性，且必要時(shí)補(bǔ)充核酸檢測確認(rèn)TV。

參考方法的驗(yàn)證為選擇BV、VVC、TV的顯微鏡復(fù)檢方式提供了依據(jù)。BV的顯微鏡復(fù)檢僅單純依靠濕片高倍鏡檢難以準(zhǔn)確識別線索細(xì)胞，因?yàn)橛行┘?xì)菌，如大量的陽性球菌或陽性桿菌也會有上皮細(xì)胞的黏附現(xiàn)象，只有革蘭染色油鏡觀察才能避免線索細(xì)胞假陽性，故本研究確立了BV的顯微鏡復(fù)檢方式為：濕片高倍鏡下難以鑒別時(shí)，行革蘭染色二次確認(rèn)。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然革蘭染色后，識別真菌菌絲孢子較濕片更容易區(qū)分VVC，敏感性也略高于濕片鏡檢，但2種鏡檢方式的特異性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了使復(fù)檢規(guī)則更適用于實(shí)際操作，本研究設(shè)定了VVC、TV的顯微鏡復(fù)檢只需要濕片低倍鏡或高倍鏡識別確認(rèn)即可。

本研究中，儀器法有形成分分析的白細(xì)胞分級較濕片鏡檢平均高1級，常見原因?yàn)椋?）基底層小圓上皮細(xì)胞在人工鏡檢時(shí)較容易被區(qū)分，但儀器計(jì)數(shù)時(shí)因其大小與白細(xì)胞相近，可能被誤判為白細(xì)胞；2）某些BV陽性的樣本中雜菌黏附成團(tuán)的BV相關(guān)細(xì)菌團(tuán)易被儀器誤判為白細(xì)胞。提示在儀器法有形成分分析白細(xì)胞計(jì)數(shù)等級與白細(xì)胞脂酶等級相差較大時(shí)，需通過圖譜確認(rèn)或顯微鏡復(fù)檢確認(rèn)。

綜上所述，現(xiàn)有儀器法干化學(xué)酶檢測聯(lián)合儀器法有形成分分析可以有效提升BV、VVC、TV檢測敏感性、降低復(fù)檢率。聯(lián)合鏡檢更適用于BV、VVC、TV的復(fù)檢確認(rèn)。