兩種螯合劑對鈷脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)及鈷富集的影響

伏 毅，王 艷，高 鵬，黃 敏，陳 浩

（四川省原子能研究院, 四川 成都 610101）

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，重金屬從采礦、冶金、制造業(yè)、農(nóng)業(yè)等人類生產(chǎn)活動中釋放到環(huán)境中，造成土壤、水體、空氣污染，成為威脅全球環(huán)境、食品安全的熱點問題。利用植物對重金屬污染土壤進行生態(tài)恢復(fù)和植物修復(fù)是一種經(jīng)濟有效的環(huán)境治理技術(shù)，目前得到廣泛的研究。紫花苜蓿(Medicago sativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，抗旱性強，具有良好的抗逆性特點，已有報道紫花苜蓿對重金屬具有一定的耐性和累積作用[1]，是一種具有潛力的重金屬污染土壤修復(fù)植物[2-3]。然而，在重金屬脅迫條件下，紫花苜蓿生長往往受到抑制，其生態(tài)恢復(fù)和修復(fù)效果受到影響。如何通過人工干預(yù)的方法降低重金屬對紫花苜蓿的影響，可以使紫花苜蓿在污染土壤上正常生長，提高污染土壤生態(tài)恢復(fù)率，具有重要的研究意義。

鈷(Co) 是生物體所需的有益元素，是維生素B12的重要組成部分[4]，也是重金屬元素之一。隨著電動汽車產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，含Co 電池被大量使用，且保持快速增長趨勢，導致Co 引起環(huán)境污染的風險增高[5]。此外，Co 礦開采、精煉、加工，含Co 化肥的過量使用，使釋放到環(huán)境中的Co 含量逐年增加。過量的Co 進入農(nóng)業(yè)環(huán)境中后，對農(nóng)作物生長環(huán)境造成一定程度的污染，能夠直接或間接通過食物鏈威脅人類的健康[6]。我國已有Co 污染的相關(guān)報道，戴燕燕等[7]研究表明黃河中段河流階地土壤中Co 均處于重度污染狀態(tài)，姚成斌等[8]報道了貴州遵義松林Ni-Mo 多金屬礦區(qū)，部分旱地土壤中Co 存在重度污染，導致植物生長受抑制、農(nóng)作物減產(chǎn)。張虎等[9]研究表明，Co 脅迫能對紫花苜蓿產(chǎn)生毒性效應(yīng)，能顯著降低紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)，使紫花苜蓿幼苗抗氧化系統(tǒng)活性下降，活性氧清除能力降低，膜脂過氧化程度加劇，從而抑制了紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長。同時， Co 脅迫能降低植物體內(nèi)葉綠素含量及葉綠素合成相關(guān)基因的表達，對植物光合作用產(chǎn)生負面影響[10-11]；能抑制植物固氮和氮素同化[12]、改變植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[9]等。Co 對植物的毒性作用十分顯著，但如何通過外源物質(zhì)減輕Co 的毒性效應(yīng)的報道十分有限，值得進一步研究。

乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚) 四乙酸(ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid，EGTA)是重要的金屬離子螯合劑，能與堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，常被用于重金屬污染土壤化學淋洗和重金屬離子活化劑[13]。有研究表明，適當濃度的EDTA、EGTA能增加土壤中重金屬的生物有效性，促進植物對重金屬的吸收，降低重金屬對植物的毒性，增加植物的生物量[14]，也能增加植物的光合速率、谷胱甘肽、植物螯合肽的含量[15]，在植物修復(fù)重金屬污染土壤中，能夠有效提高植物對重金屬的積累量。盡管如此，在Co 脅迫條件下，外源添加EDTA、EGTA對植物生長及重金屬富集的研究報道較少。鑒于此，本研究通過添加外源EDTA、EGTA，初步探討EDTA、EGTA 對Co 脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響，分析EDTA、EGTA 對緩解Co 脅迫抑制植物生長的機制，為螯合劑在植物修復(fù)Co 污染環(huán)境中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子萌發(fā)及處理

1.1.1 消毒

紫花苜蓿(威納爾)種子用自來水沖洗，除去雜質(zhì)和干癟的種子，再用蒸餾水反復(fù)清洗2～3 遍后，用0.05%的次氯酸鈉溶液浸泡 15 min，進行消毒處理，然后用無菌水洗凈備用。

1.1.2 發(fā)芽

將兩層定性濾紙鋪于直徑9 cm、高1.2 cm的培養(yǎng)皿(已滅菌)中，加入5 mL 的處理液作為發(fā)芽床，放置經(jīng)過消毒的紫花苜蓿種子，于光照培養(yǎng)箱中(25 ℃，前2 d 為暗培養(yǎng)，第3 天開始光照/黑暗12 h/12 h)培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿中放入30 粒種子，每個處理設(shè)置3 個平行。加入處理液開始培養(yǎng)當天記作第0 天，于第2 天再加入5 mL 處理液，第4 天對幼苗進行收集，測定其長度、金屬含量及各項生理指標。每個試驗獨立重復(fù)3 次。

1.1.3 材料處理

首先，采用不同濃度CoCl2溶液(0.1、0.2、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol·L-1)處理紫花苜蓿種子，測定不同處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗長度，選定幼苗長度為對照(無CoCl2處理)一半時的Co 濃度為半抑制濃度(0.7 mmol·L-1CoCl2)，作為Co 脅迫濃度，用于下一步研究外源添加EDTA、EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響。其次，在Co 脅迫條件下，外源添加不同濃度EDTA (0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、 2.0 mmol·L-1)、 EGTA (0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol·L-1)，測定不同處理下種子發(fā)芽率、幼苗長度，觀察EDTA、EGTA 對Co 脅迫下種子萌發(fā)及幼苗生長的影響(前期試驗發(fā)現(xiàn)由于高濃度的EDTA、EGTA 對植物表現(xiàn)出毒性效應(yīng)，抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，且EDTA 的毒性作用比EGTA 更大，因此設(shè)置了不同的濃度梯度試驗)，篩選出具有最佳恢復(fù)效果的EDTA、EGTA 濃度分別為0.8 和1.0 mmol·L-1。最后，測定對照、Co 脅迫(0.7 mmol·L-1)、Co 脅 迫(0.7 mmol·L-1) + EDTA (0.8 mmol·L-1)、Co脅迫(0.7 mmol·L-1) + EGTA (1.0 mmol·L-1) 4 個處理下幼苗體內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)生速率、超氧化物歧化酶活性、MDA 含量及Co 含量。

1.2 種子發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)計算方法

種子置床后第1～4 天，每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)，計算發(fā)芽率(%)和發(fā)芽指數(shù)。

式中：Gt為時間t的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.3 幼苗長度測定

種子發(fā)芽4 d 后，選擇每個培養(yǎng)皿中最高的10 株紫花苜蓿幼苗，用標尺測定幼苗的長度。

1.4 超氧陰離子產(chǎn)生速率、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的測定

不同處理的紫花苜蓿幼苗各取0.5 g，加入2.5 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH = 7.8)和少量石英砂于4 ℃研磨，離心力11 000 × g，4 ℃，離心10 min。上清備用。按照羥胺還原法，測定超氧陰離子產(chǎn)生速率[16]。利用SOD 抑制氮藍四唑(NBT)的光還原作用來測定SOD 酶的活力[17]，為進一步證明Co 對SOD 酶活性的影響是否直接通過與SOD 結(jié)合進而抑制了SOD的活性，采用體外試驗，在提取的SOD 酶溶液中，加入不同濃度的Co (0.05、0.2、0.7 mmol·L-1) 處理20 min 后，測定SOD 酶的活性，測定方法同上。利用TCA-TBA 法測定MDA 含量[18-19]。

1.5 金屬含量測定

將培養(yǎng)4 d 的紫花苜蓿幼苗取出，經(jīng)蒸餾水沖洗6 遍，去離子水沖洗3 遍后于105 ℃烘30 min 殺青，80 ℃烘至恒重[20]，稱取0.2 g，按照國標GB/T14609—2008 濕法消解，消解液用火焰原子吸收分光光度法測定其金屬元素含量[21]。用量筒測定取出幼苗后的殘余培養(yǎng)液體積，并用原子吸收分光光度法測定鈷濃度，按照殘余鈷量=殘余培養(yǎng)液體積×鈷濃度計算殘余鈷量，按照去除率=（添加量-殘余鈷量）/添加量×100%計算去除率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值 ± SD 表示，選用SPSS 21.0 和Excel 2019 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和處理，采用Dancun 法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較(P＜ 0.05)，Excel 2019 完成制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDTA、EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

如表1 所示，在0.1～1.0 mmol·L-1的Co 溶液中萌發(fā)的紫花苜蓿種子，其發(fā)芽率(除第3 和4 天)、發(fā)芽指數(shù)均低于對照，但在0.1～0.7 mmol·L-1Co 處理條件下，各處理間的差異并不顯著，1.0 mmol·L-1的Co 溶液處理后，種子發(fā)芽率(除第3 天)、發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(P＜ 0.05)，而在2.0 mmol·L-1的Co 溶液處理后，紫花苜蓿種子基本上不發(fā)芽(因為數(shù)據(jù)均為0，故表1 未列出)。0.1～1.0 mmol·L-1的Co 溶液中紫花苜蓿幼苗長度，隨著Co 濃度增加而逐漸降低，在0.7 mmol·L-1Co 作用下，紫花苜蓿幼苗長度為對照的一半，發(fā)芽率表現(xiàn)出滯后性，并且發(fā)芽率低于對照(表1)，因此，選定0.7 mmol·L-1Co 為半抑制濃度，作為Co 脅迫濃度，用于下一步測定EDTA、EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響。

表1 不同濃度Co 對紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different Co concentrations on alfalfa seed germination

如表2、表3 所列，在Co 脅迫條件下，加入不同濃度的EDTA、EGTA 對紫花苜蓿種子的萌發(fā)呈現(xiàn)一定的恢復(fù)效果。加入不同濃度的EDTA、EGTA的種子發(fā)芽率在發(fā)芽第1 天沒有顯著變化，但是從第2 天開始均表現(xiàn)出一定的恢復(fù)效果，且隨著EDTA、EGTA 濃度的升高，種子發(fā)芽率基本上呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。其中，0.5～1.0 mmol·L-1的EDTA 對Co 脅迫種子發(fā)芽率的恢復(fù)效果較好，在0.5～1.0 mmol·L-1的EGTA 對Co 脅迫種子發(fā)芽率的恢復(fù)效果最好。隨著加入的EDTA、EGTA 的濃度升高，對Co 脅迫下種子發(fā)芽指數(shù)的影響呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其中0.8、1.0 mmol·L-1EDTA和1.0、2.0 mmol·L-1EGTA 的恢復(fù)效果最好。

表2 不同濃度EDTA 對Co 脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different EDTA concentrations on seed germination under Co stress

表3 不同濃度EGTA 對Co 脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different EGTA concentrations on alfalfa seed germination under Co stress

如圖1 所示，不同濃度EDTA、EGTA對Co 脅迫幼苗長度的影響均呈現(xiàn)出先促進、后抑制的趨勢，隨著EDTA、EGTA 濃度的增加，幼苗長度先升高后降低，0.8 mmol·L-1EDTA 對Co 脅迫種子萌發(fā)的恢復(fù)效果最好，恢復(fù)到對照的72.4%，平均長度高出Co 脅 迫 條 件 下 幼 苗12.3 mm。1.0、2.0 mmol·L-1EGTA 對Co 脅迫幼苗長度的恢復(fù)效果較好，分別達到對照的77.4%和77.8%，平均長度分別高出Co 脅迫組15.3 和15.5 mm。綜合考慮，EDTA、EGTA 對Co 脅迫幼苗的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和長度的影響后，選擇0.8 mmol·L-1EDTA 和1.0 mmol·L-1EGTA 作為恢復(fù)Co 脅迫種子萌發(fā)的最佳濃度，測定在該濃度處理下紫花苜蓿幼苗體內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生速率、超氧化物歧化酶活性、MDA 含量及Co 含量。

圖1 不同濃度EDTA、EGTA 對Co 脅迫下紫花苜蓿幼苗長度的影響Figure 1 Effects of different EDTA, EGTA concentrations on seedling length in Co-stressed alfalfa seedlings

2.2 EDTA 和EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

如圖2 所示，Co 脅迫較CK 顯著增加紫花苜蓿幼苗中超氧陰離子產(chǎn)生速率(P＜ 0.05)，增加了84%，外源EDTA、EGTA能顯著恢復(fù)到對照水平。幼苗中的超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著降低，與Co 脅迫相比，分別顯著下降41%和46% (P＜ 0.05)。

圖2 EDTA, EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響Figure 2 Effects of EDTA, EGTA on superoxide anion production rate in Co-stressed alfalfa seedlings

2.3 EDTA 和EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中SOD 活性的影響

如圖3A 所示，Co 脅迫較CK 顯著降低紫花苜蓿幼苗中的SOD 活性(P＜ 0.05)，僅為對照的78%。外源添加EDTA 和EGTA 較Co 處理顯著增加幼苗中SOD 活性，分別增加20%和9%，與對照相比，分別達到對照的93%和85%。因此，EDTA 比EGTA 具有更好的恢復(fù)效果。

圖3 EDTA、EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中超氧化物歧化酶活性的影響Figure 3 Effects of EDTA, EGTA on SOD activity in Co-stressed alfalfa seedlings

采用體外試驗，在提取的SOD 酶溶液中加入不同濃度Co，測定SOD酶活性的變化，如圖3B所示，SOD酶溶液中加入不同濃度Co 作用后，SOD 活性沒有發(fā)生變化，說明Co 抑制紫花苜蓿幼苗中SOD 活性不是Co 直接作用于SOD，而是通過其他途徑抑制了酶的活性，具體作用途徑有待進一步研究。

2.4 EDTA 和EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中MDA 含量的影響

如圖4 所示，Co 脅迫顯著增加紫花苜蓿幼苗中的MDA 含量(P＜ 0.05)，增加了30%。加入EDTA、EGTA顯著降低幼苗中MDA 含量，僅為Co 脅迫條件下的65%左右，顯著低于對照(P＜ 0.05)。

圖4 EDTA、EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中MDA 含量的影響Figure 4 Effects of EDTA, EGTA on MDA content in Co-stressed alfalfa seedlings

2.5 EDTA 和EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中Co 含量的影響

如圖5A 所示，紫花苜蓿幼苗對照組中未檢測出Co含量，Co 脅迫(0.7 mmol·L-1的Co 溶液中)顯著增加紫花苜蓿幼苗中Co 含量(P＜ 0.05)，達到2 000 mg·kg-1。外源添加EDTA 和EGTA 顯著降低紫花苜蓿幼苗中Co 含 量(P＜ 0.05)，分 別 為212 和675 mg·kg-1，僅為Co 脅迫條件下的10%和31%。EGTA 處理組幼苗的Co 含量高于EDTA 處理組。Co 單獨處理組殘留的Co 量最低，加入EDTA 和EGTA 后殘留量較CK 和Co 處理顯著增加(圖5B)，結(jié)果與幼苗體內(nèi)的含量相一致，說明紫花苜蓿幼苗對水溶液中Co 的清除能力較強，去除率達到77.46%，加入EDTA 和EGTA去除率顯著降低(P＜ 0.05)，僅有2.79%和16.61%。

圖5 EDTA、EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中Co 含量的影響Figure 5 Effects of EDTA, EGTA on cobalt content in Co-stressed alfalfa seedlings

3 討論

3.1 EDTA 和EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

Co 脅迫能夠抑制植物種子萌發(fā)[22]。在單子葉植物中，對水稻(Oryza sativa)種子在Co 脅迫條件下萌發(fā)的研究結(jié)果證明，Co 脅迫能夠抑制水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力、幼苗的長度等生長指標[23]。在雙子葉植物中，對綠豆(Phaseolus radiatus)種子在0.2～1.0 mmol·L-1Co濃度處理條件下萌發(fā)的研究結(jié)果證明，Co 能夠延遲綠豆種子萌發(fā)、抑制幼苗生長，這種效應(yīng)隨鈷濃度的增加而加大[24]。本研究表明，Co 脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)也存在顯著抑制作用(表1)，0.1 mmol·L-1Co 就能引起種子發(fā)芽率降低，幼苗長度降低，0.7 mmol·L-1Co 抑制紫花苜蓿幼苗生長，長度僅為對照的一半，這與在綠豆中觀察到的結(jié)果一致。

一定濃度的EDTA、EGTA 等螯合劑能夠緩解重金屬對植物種子萌發(fā)的抑制作用。對銅、鉛復(fù)合污染黑麥草(Lolium perenne)配施2.5 mmol·L-1的EDTA 能夠顯著提高黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根芽長，緩解銅、鉛的抑制作用[25]。對鉻脅迫下黃瓜(Cucumis sativus)種 子 施 加1.0 ～2.5 mmol·L-1的EDTA 可以提高種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率，緩解黃瓜種子萌發(fā)期受到的鉻脅迫[26]。對鎘脅迫下的鷹嘴豆(Cicer arietinum)中添加0.1 mmol·L-1的EGTA，能夠有效改善鷹嘴豆幼苗的生長，緩解鎘的抑制作用[27]。本研究表明，對Co 脅迫條件下紫花苜蓿種子，外源添加0.8 mmol·L-1的EDTA 或1.0 mmol·L-1的EGTA能顯著恢復(fù)Co 脅迫紫花苜蓿種子的發(fā)芽率及幼苗長度，緩解Co 的抑制作用。由此可見，EDTA、EGTA 能緩解Co 脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用。

3.2 EDTA 和EGTA 對Co 脅迫紫花苜蓿幼苗中活性氧代謝平衡的影響

重金屬脅迫，會導致植物體內(nèi)過量地產(chǎn)生活性氧[28]，抑制抗氧化酶活性[29]。張虎等[9]研究表明，Co 脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)生速率及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 含量均顯著增加，并且隨著Co 脅迫濃度的增大而升高；隨著 Co 脅迫濃度的增大，紫花苜蓿幼苗葉片的SOD 活性均呈先升高后降低的趨勢。本研究表明，在Co 脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生速率和MDA 含量顯著增加(圖2、圖4)，SOD 活性顯著降低，說明Co 脅迫引起紫花苜蓿幼苗體內(nèi)超氧陰離子積累，并降低SOD 酶活性，導致活性氧代謝平衡被打破，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，這與張虎等[9]的研究結(jié)果一致。

EDTA、EGTA 能降低重金屬脅迫引起的活性氧積累、提高抗氧化系統(tǒng)活性。銅脅迫下，蕓苔屬植物歐洲油菜(Brassica napus)體內(nèi)活性氧含量顯著增加，SOD等抗氧化酶活性降低，外源添加EDTA 能顯著恢復(fù)銅脅迫引起的這些生理指標變化[30]。外源EDTA能提高鎘脅迫下土荊芥(Dysphania ambrosioides)體內(nèi)SOD 及其他抗氧化酶類的活性[31]。對鉛脅迫下的菠菜施用EDTA，能提高菠菜(Spinacia oleracea)的抗氧化活性，并中和活性氧[32]。對鎘脅迫下的鷹嘴豆(Cicer arietinum)種子外源添加EGTA，能提高SOD 酶活性[27]。本研究表明，外源EDTA、EGTA能顯著降低Co 脅迫條件下的超氧陰離子產(chǎn)生速率和MDA 含量(圖2、圖4)，提高SOD 活性(圖3A)，說明外源EDTA、EGTA 緩解了Co 脅迫引起的活性氧積累，減輕了氧化脅迫作用。

超氧化物歧化酶含有能夠與金屬輔基進行結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，按照結(jié)合的金屬種類可以分為CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD[33]。由于金屬離子之間可能發(fā)生替代作用，而使酶失去活性，因此本研究在體外研究了Co 對SOD 的作用，結(jié)果表明，在SOD 水溶液中加入Co 并不能直接引起SOD活性的改變(圖3B)，說明Co 離子不能直接作用于SOD 本身，而Co 引起的紫花苜蓿幼苗SOD 活性降低可能是其他原因引起的。韓立敏等[34]研究了在鹽脅迫條件下超氧化物歧化酶基因表達出現(xiàn)了先增加后降低的變化，說明在一定的脅迫環(huán)境下，SOD 的基因表達受到調(diào)控，并隨著脅迫程度的增加基因表達水平受到抑制，這可能是SOD 酶活性降低的原因之一。對Co 脅迫條件下SOD 基因表達水平，以及上下游調(diào)控機制需更進一步的研究。

3.3 EDTA 和EGTA 對紫花苜蓿吸收Co 的影響

目前，較多研究表明，在重金屬污染土壤中加入EDTA、EGTA 等金屬離子螯合劑能夠促進植物吸收重金屬元素，提高對土壤的清除能力。例如，對生長在重金屬污染中的高粱(Sorghum bicolor)和燕麥(Avena sativa)施加EDTA，能夠顯著提高根、芽中的鎘、鉻和鉛的濃度[35]；對生長在鎘和砷混合污染農(nóng)田上的蒼耳(Xanthium strumarium)施加EDTA，能提高蒼耳植株對鎘、砷的總積累量[36]；對鋅脅迫條件下的紫花苜蓿施加EDTA，有助于提高紫花苜蓿的葉片Zn 含量[37]；對生長在重金屬污染耕作土壤上的青葙(Celosia argentea)施加一定濃度的EGTA，能顯著提高青葙對鎘、鉛、鋅、銅的吸收富集[38]。但是，也有施加EDTA、EGTA 等螯合劑對植物吸收重金屬沒有影響或降低吸收量的報道。例如，對生長在鎘、鋅、鉛和銅復(fù)合污染土壤上的鬼針草(Bidens pilosa)施加EGTA，雖能增加鬼針草不同部位鋅、鉛和銅的吸收量，但是對鬼針草吸收鎘的影響效果不佳[39]；對生長在重金屬污染土壤中的東南景天(Sedum alfredii)施加EDTA，顯著降低了對鉛和鋅的吸收，但是對鎘的吸收沒有顯著影響[15]。本研究表明，采用溶液培養(yǎng)法，對Co 脅迫條件下的紫 花 苜 蓿 施 加0.8 mmol·L-1EDTA 和1 mmol·L-1EGTA，顯著降低了紫花苜蓿對Co 的吸收富集(圖5)，緩解了Co 對紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用。

4 結(jié)論

綜上，Co 脅迫條件下紫花苜蓿幼苗中大量累積Co，達到2 000 mg·kg-1干重，使種子萌發(fā)和幼苗生長受到嚴重的抑制。Co 脅迫條件下紫花苜蓿幼苗中的超氧陰離子產(chǎn)生速率增加、SOD 酶活性降低、MDA 含量增加，使幼苗中活性氧代謝失衡，這是Co 脅迫引起種子萌發(fā)、生長受抑的原因之一。通過外源添加EDTA、EGTA 能夠降低紫花苜蓿幼苗中的Co 含量，減少超氧陰離子產(chǎn)生速率，恢復(fù)SOD 酶活性，降低MDA 含量，進而緩解Co 脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用。