基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的作用機(jī)制

任騰騰,于瀟飛,李云*,劉業(yè)志,張同妍,郭中原

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355;2.山東省立第三醫(yī)院 藥學(xué)部,山東 濟(jì)南 250031;3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所,北京 100700;4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,河南 鄭州 450000)

當(dāng)前,隨著社會的發(fā)展,人民生活水平逐漸提高,痛風(fēng)和高尿酸血癥已成為臨床常見病,高尿酸血癥臨床表現(xiàn)為血清尿酸(UA)含量升高(男性UA ≥ 420 μmol/L,女性UA ≥ 360 μmol/L)。當(dāng)血清 UA 水平高于正常閾值時(shí),尿酸單鈉(MSU)晶體沉積在關(guān)節(jié)上,引起關(guān)節(jié)損傷和炎癥反應(yīng),最終使人患上痛風(fēng)[1-2]。近年來,痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)病率和患病率逐年增加[3]。全球痛風(fēng)患病率在 0.1% 到 10% 之間[4];2016 年統(tǒng)計(jì)顯示中國痛風(fēng)發(fā)病率為 5.61%,并呈逐年上升趨勢[5]。具有易診難治,復(fù)發(fā)率較高的特點(diǎn),嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量。因此,降低血清UA含量是預(yù)防和治療痛風(fēng)、高尿酸血癥的主要措施[6]。目前,臨床上對于痛風(fēng)和高尿酸血癥主要有物理治療、藥物治療以及手術(shù)治療等,但因發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,均無法根治。臨床上常用的藥物如別嘌醇、苯溴馬隆等均存在不同程度的不良反應(yīng)[7-9]。因此,尋找和開發(fā)活性優(yōu)良的降低血清UA藥物迫在眉睫。近年來科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),高良姜中的黃酮類成分能顯著降低高尿酸血癥小鼠的血清UA水平[10-11]。高良姜我國的傳統(tǒng)中藥材,具有溫胃止嘔,散寒止痛的功效。黃酮類、揮發(fā)油和二苯基庚烷等是其主要化學(xué)成分[12-13]。藥理研究發(fā)現(xiàn),高良姜具有抗氧化、抗胃潰瘍、抗炎等作用[14-15]。在民間,高良姜被廣泛用作食材、湯料、調(diào)味品以及香料等,對其進(jìn)行降尿酸產(chǎn)品開發(fā)可帶來較好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。然而,高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的機(jī)制尚不清楚,尤其是其有效化學(xué)成分的分子靶點(diǎn)機(jī)制,因此,有必要對高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的具體靶點(diǎn)和通路等進(jìn)一步探索。

本研究首先運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),建立了“成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,再通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用和靶點(diǎn)富集分析,最后篩選出活性成分,分析高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的分子機(jī)制,并利用分子對接驗(yàn)證活性成分與蛋白的親和力,為高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 高良姜化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的收集

藥物化學(xué)成分及靶標(biāo)數(shù)據(jù)來源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[16],以“高良姜”為關(guān)鍵詞檢索化學(xué)成分,對高良姜的有效成分進(jìn)行篩選,其中設(shè)定口服生物利用度(OB)≥ 30%,類藥性(DL)≥ 0.18。從TCMSP中獲取相篩選成分的靶點(diǎn),并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)名稱規(guī)范?；赑ubchem數(shù)據(jù)庫[17]獲得上述化合物的SDF結(jié)構(gòu)。

1.2 高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病作用靶點(diǎn)的收集

以“hyperuricemia”、“gout”為關(guān)鍵詞使用OMIM數(shù)據(jù)庫,Disgenet數(shù)據(jù)庫,Genecards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,得到高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 高良姜-高尿酸血癥和痛風(fēng)共同靶點(diǎn)的篩選

運(yùn)用Venny2.1在線作圖工具,導(dǎo)入高良姜篩選成分作用靶點(diǎn)、痛風(fēng)及高尿酸血癥相關(guān)靶點(diǎn),繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得高良姜藥物-痛風(fēng)及高尿酸血癥共同靶點(diǎn),即為高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件將“高良姜-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病”網(wǎng)絡(luò)圖可視化,通過Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行藥物、成分、靶標(biāo)、通路之間的拓?fù)溆?jì)算分析,Degree值代表了化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)之間的相關(guān)個(gè)數(shù),而Degree數(shù)值由大到小表代表化學(xué)成分關(guān)鍵程度由大到小,從而獲得核心成分。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

將高良姜與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,確定蛋白種類為“Homo sapiens”,設(shè)置最低相互作用閾值參數(shù)0.4,再獲取PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,其中,Degree值的高低根據(jù)節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化不同表示。基于拓?fù)浞治龊Y選核心靶點(diǎn),將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2中,使用NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浣馕?以degree,betweenness centrality,average shortest path length 和closeness centrality四種參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn),選擇degree分值超過平均分的基因?yàn)楹诵陌悬c(diǎn),使用R 3.6.1工具繪制靶點(diǎn)條形圖。

1.6 GO和KEGG富集分析及可視化

為了說明中藥化合物對應(yīng)的預(yù)測靶點(diǎn)在基因功能和通路中的作用,運(yùn)用R軟件Bioconductor生物信息軟件進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的GO和KEGG富集分析(P<0.05,Q<0.05),輸出可視化條形圖及氣泡圖。

1.7 分子對接驗(yàn)證

LibDock 是 Discovery Studio 中的一種對接方法[8]。 通過這種計(jì)算機(jī)輔助虛擬活性篩選的方法,可以在不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的情況下的篩選出小分子的活性,經(jīng)過多年的發(fā)展,該方法準(zhǔn)確性高,操作簡便,可進(jìn)行小分子高通量活性篩選,是目前藥物研究領(lǐng)域較為重要的一種技術(shù)。在 PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心靶標(biāo)中,選擇前 5 個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行分子對接虛擬活性驗(yàn)證。在Discovery Studio 19.0(Chuang Teng Technology Co.,Ltd.,Beijing,China)中,使用Libdock算法評估化合物與痛風(fēng)和高尿酸血癥靶點(diǎn)之間的潛在分子結(jié)合模式。結(jié)合位點(diǎn)分別基于共結(jié)晶配體與 5 個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合來定義。在對接篩選實(shí)驗(yàn)之前,去除靶標(biāo)蛋白共結(jié)晶配體,并使用相同的參數(shù)將制備的配體與蛋白質(zhì)對接。根據(jù)對接結(jié)果,選擇具有最低對接能量的最佳得分對接模型代表化合物的最佳配體結(jié)合位點(diǎn)。對于每個(gè)配體,計(jì)算相互作用能量以定義配體和受體之間的相互作用,并分析預(yù)測的結(jié)合相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 對高良姜的化學(xué)成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中設(shè)定OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18,對高良姜的有效成分進(jìn)行篩選,共得到潛在活性成分13個(gè)(表1),TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出180個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。

表1 高良姜的潛在活性成分

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2 疾病作用靶點(diǎn)篩選

以“hyperuricemia”、“gout”為關(guān)鍵詞,分別在OMIM、Disgenet、Genecards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,去重后分別獲得1 101個(gè)痛風(fēng)作用靶點(diǎn),802個(gè)靶點(diǎn)高尿酸血癥作用靶點(diǎn),二者取交集后獲得319個(gè)兩疾病的共同靶點(diǎn)(如圖1)。

圖1 高尿酸血癥和痛風(fēng)共同靶點(diǎn)

2.3 高良姜藥物-痛風(fēng)及高尿酸血癥疾病共同靶點(diǎn)的篩選

采用Venny2.1在線作圖工具,導(dǎo)入180個(gè)高良姜藥物靶點(diǎn)、1 101個(gè)痛風(fēng)作用靶點(diǎn),802個(gè)高尿酸血癥作用靶點(diǎn),繪制韋恩圖,三者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)28個(gè)(如圖2)。

圖2 高良姜與痛風(fēng)、高尿酸血癥靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

采用Cytoscape軟件導(dǎo)入高良姜中13個(gè)潛在活性成分和28個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn),繪制“高良姜-化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)-高尿酸血癥和痛風(fēng)疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3)。高良姜中的11種活性成分(刪除其中2個(gè)與疾病靶點(diǎn)無交集的成分)根據(jù)degree降序排列分別為 quercetin,kaempferol,isorhamnetin,galangin,beta-sitosterol,1,7-diphenyl-5-hydroxy-3-heptanone,7-Methoxy-8-(2'-ethoxy-3'-hydroxy-3'-methybutyl)coumarin,medicarpin,(2S,3R)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5,7-dimethoxychroman-3-ol,5-methoxy-1,7-diphenyl-3-heptanone,butyl-2-ethylhexyl phthalate。

注: 圖中紫色代表高良姜,綠色三角形代表高良姜中的11種活性成分,藍(lán)色橢圓形代表28個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn),紅色菱形代表疾病。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

2.5.1 構(gòu)建蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)圖

為了更直觀地表征高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的作用機(jī)制,采用STRING 數(shù)據(jù)庫分析高良姜與兩疾病的28個(gè)交集靶點(diǎn)基因的交互作用,按“1.5”PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件中,制作PPI網(wǎng)絡(luò)(如圖4)。經(jīng)軟件計(jì)算可知,網(wǎng)絡(luò)中共含有28個(gè)節(jié)點(diǎn),210條邊,平均節(jié)點(diǎn)數(shù)15。

圖4 高良姜與痛風(fēng)及高尿酸血癥交集基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5.2 基于拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)篩選

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2中,通過“1.5”中基于拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)篩選的方法以NetworkAnalyzer工具實(shí)現(xiàn)拓?fù)浞治?采用R 3.6.1制作前 30 位靶點(diǎn)的條形圖(如圖5)。基于 PPI 拓?fù)浞治雠琶?位的核心靶標(biāo)在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中較為關(guān)鍵,包括 CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA、ICAM1。

2.6 KEGG 和GO富集分析

2.6.1 GO富集分析

將28個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語言運(yùn)行后得到GO 條目1 256條,結(jié)果顯示,交集基因集合共富集至1205條生物學(xué)過程(Biological process,BP)通路;交集基因集合共富集至10條細(xì)胞組分表達(dá)(Cellular component,CC)過程;交集基因集合共富集至41個(gè)與分子功能(Molecular function,MF)相關(guān)的過程。從 BP 的富集結(jié)果來講,高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的靶標(biāo)主要參與調(diào)節(jié)對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、細(xì)胞對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、衰老、白細(xì)胞細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)等(圖6(a))。從 CC 的富集結(jié)果來說,靶標(biāo)主要涉及質(zhì)膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)、血小板α顆粒腔等(圖6(b))。從 MF 的富集結(jié)果來講,靶標(biāo)主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合、死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合等(圖6(c))。

圖5 排名前30的核心靶點(diǎn)

圖6 高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的GO富集分析條形圖

2.6.2 KEGG富集分析

高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的28個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入R語言分析后得到118條KEGG通路,前20位KEGG通路條形圖(如圖7),其中P-value代表富集顯著性,所有通路都是有意義(P-value<0.05)且顏色越紅則說明顯著性越高。主要信號通路涉及:糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、TNF、IL-17、NF-κB、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Nod樣受體、Toll樣受體等信號通路,這提示高良姜可能是通過調(diào)控多個(gè)通路發(fā)揮治療痛風(fēng)及高尿酸血癥作用。

圖7 高良姜治療痛風(fēng)、高尿酸血癥的KEGG富集分析

2.7 分子對接結(jié)果

LibDock 是 Discovery Studio 中的一個(gè)對接應(yīng)用程序,將具有不同結(jié)合親和力的配體分子對接以生成熱圖,以指示配體與其結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用,并優(yōu)化獲得的能量 (Ayoub et al.,2018)。最后,保留得分較高的對接構(gòu)象。使用這種篩選方法,可以縮小PPIs的范圍,并且可以進(jìn)一步篩選潛在的生物活性配體。從PBD數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)中檢索到 前5 個(gè)靶標(biāo)的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID分別為CCL2:4zk9,CXCL8:6n2u,IL1B:6y8m,VEGFA:1vpf,ICAM1:1iam),去除蛋白質(zhì)中的水分子并純化蛋白質(zhì)。從 PubChem 數(shù)據(jù)庫 (https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得前5 個(gè)化合物高良姜素(galangin)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)的3D分子結(jié)構(gòu)。采用治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物別嘌醇(allopurinol)作陽性對照配體。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),高良姜素、異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素分別與CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA有較好的結(jié)合,LibDock對接得分均高于陽性藥別嘌醇,而與ICAM1未結(jié)合(表2)。5種化合物中異鼠李素分別與4種蛋白獲得了最高的LibDock對接得分(如圖 8)。異鼠李素與CCL2(PBD ID:4ZK9)結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)為 78.2015(如圖 8(a)),其結(jié)合作用通過異鼠李素B環(huán)與SER B:63、THR B:45氨基酸殘基形成碳?xì)滏I;C環(huán)與SER B:63、LEU B:25、ILE B:20氨基酸殘基形成π-Sigma相互作用;C環(huán)與SER B:21、ARG B:24氨基酸殘基形成amide-π堆疊相互作用;A、B、C環(huán)與VAL B:22、LEU B:25、ILF B:20、ILF B:51氨基酸殘基形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與CXCL8(PBD ID:6N2U)結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)為85.6050(如圖 8(b)),其結(jié)合作用通過異鼠李素A、B環(huán)羥基與LEU A:3、VAL A:25氨基酸殘基形成常規(guī)氫鍵;A環(huán)與ARG A:24、LYS A:1形成碳?xì)滏I;A、B、C環(huán)與ILE A:26形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與IL1B (PBD ID: 6Y8M) 結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)為85.8516(如圖 8(c)),其結(jié)合作用通過異鼠李素C環(huán)羰基與ASN A:108形成常規(guī)氫鍵;B環(huán)甲氧基與LYS A:103、ASP A:54形成碳?xì)滏I;A環(huán)與IEU A:110 形成π-alkyl相互作用。異鼠李素與VEGFA結(jié)合的LibDock分?jǐn)?shù)(PBD ID:1VPF)為78.2015(如圖 8(d)),其結(jié)合作用通過異鼠李素C環(huán)羥基與CYS B:61形成常規(guī)氫鍵;B、C環(huán)與ASP B:63、GLU B:64、GLU B:64、CYS B:61形成碳?xì)滏I;A、C環(huán)與CYS B:60形成π-alkyl相互作用。

注:圖中用三字母氨基酸代碼及其位置注釋殘基, 疏水殘基呈綠色,而極性殘基呈紫色,水分子呈青色,受體和配體之間的相互作用用不同顏色的虛線表示,與相應(yīng)的殘基顏色一致。

表2 高良姜中5個(gè)化合物與4個(gè)靶標(biāo)LibDock分子對接得分

3 總結(jié)與討論

痛風(fēng)是一種慢性疾病,由于血清尿酸水平過高導(dǎo)致尿酸晶體沉積在關(guān)節(jié)并引起炎癥,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛,常見于指尖、肘、跖趾、跟腱等部位;2016 年統(tǒng)計(jì)顯示中國痛風(fēng)發(fā)病率為5.61%,并呈逐年上升趨勢[5]。目前,對于痛風(fēng)和高尿酸血癥還沒有根治的方法。西醫(yī)是主要的治療方法,但長期使用藥物會產(chǎn)生副作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析,探討高良姜治療痛風(fēng)和高尿酸血癥的活性成分及作用機(jī)制。結(jié)果從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得了11種潛在活性化合物,前5位關(guān)鍵成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素、高良姜素、β-谷甾醇;篩選出高良姜藥物-痛風(fēng)及高尿酸血癥疾病28個(gè)共同靶點(diǎn),通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析前4位關(guān)鍵靶點(diǎn)是CCL2、CXCL8、IL1B、VEGFA;關(guān)鍵通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、TNF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等信號通路;此外,高良姜還通過調(diào)節(jié)20個(gè)生物過程、10個(gè)細(xì)胞組分表達(dá)過程和20個(gè)分子功能來防治痛風(fēng)和高尿酸血癥。這也說明高良姜由多種化合物組成,通過多途徑作用于痛風(fēng)和高尿酸血癥的不同靶點(diǎn),為后期臨床用藥和作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

基于KEGG富集分析的結(jié)果,本文選擇了與痛風(fēng)和高尿酸血癥治療相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路進(jìn)行如下分析:

糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路。高級糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是還原糖與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合的非酶合成的產(chǎn)物。AGEs與其受體產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物(RAGE)結(jié)合能誘導(dǎo)各種類型的細(xì)胞和器官的氧化應(yīng)激和炎癥[19-20]。圖9為AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的分析結(jié)果。研究表明,AGEs聯(lián)合RAGE可顯著提高OA軟骨細(xì)胞中TGF-β和MMP-9 mRNA、IL-1、蛋白的表達(dá)水平,顯著降低過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,增加丙二醛水平,顯著促進(jìn)NF-κB 的核轉(zhuǎn)位[21]。TGF-β和MMPs的表達(dá)水平可作為實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo),以判斷OA的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)研究證明,槲皮素能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶 (MAPKs) 的磷酸化、核因子 κ-B 激酶 (IKK)α/β等與炎癥過程相關(guān)的信號通路,激活轉(zhuǎn)錄因子 2 (ATF2) 和核因子 (NF)-κB p65,并阻止 NF-κB p65 易位進(jìn)入細(xì)胞核。通過降低IL-1β、IL-6、IL-8、ICAM-1、sICAM-1 和 MCP-1 產(chǎn)生阻斷 MAPK 和 NF-κB 信號通路的激活進(jìn)而改善炎癥反應(yīng)[22]。異鼠李素可劑量依賴性的降低NF-κB信號通路中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1和TGF-β1的蛋白和mRNA的表達(dá)[23]。綜上所述,糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路可能是高良姜治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵通路。

圖9 糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路圖

IL-17信號通路。在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的早期階段會出現(xiàn)局部炎癥加強(qiáng),伴隨著關(guān)節(jié)紅腫和劇烈疼痛[24]。其中,IL-17是一種主要的促炎因子[25]。由IL-17信號通路圖(如圖10)可知,IL-17通過激活相關(guān)受體,介導(dǎo)NF-κB通路的激活;而TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子也能增強(qiáng)IL-17的活性,增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1/3/9/13)的表達(dá)[25]。文獻(xiàn)研究證實(shí),IL-17與其受體結(jié)合,可激活NF-κB和MAPK等下游通路,誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等表達(dá),繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[26]。在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者中也存在這一過程,由于NF-κB和激活蛋白1(AP-1)通路被激活[27],可增加促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、IL-17、TNF-α和NLRP3的表達(dá)[28]。實(shí)驗(yàn)研究證明,高良姜素及高良姜醇提物[29]、異鼠李素[30]能有效降低大鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平,槲皮素[30]、山奈酚[31]、谷甾醇[32]可降低TNF-α水平,表明高良姜可能通過抑制IL-17信號通路來治療痛風(fēng)和高尿酸血癥。

圖10 IL-17信號通路圖

TNF信號通路。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子,能誘導(dǎo)炎癥因子 IL-1β的表達(dá),兩者之間具有相互刺激的作用, IL-1β可以提高TNF-α的活性[34]。通過分析TNF信號通路圖(如圖11)可知,NF-κB通路被激活,增加了應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK1/2)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平,進(jìn)而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的表達(dá),來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),TNF-α可誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)分泌脂多糖,促進(jìn)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其表達(dá)炎癥因子如IL-1β和IL-6,并增加細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平[35]。TNF-α在尿酸鈉(MSU)晶體誘導(dǎo)的小鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)中顯著升高,并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[36]。而高良姜素及高良姜醇提物[29]、異鼠李素[30]能有效降低大鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平,山奈酚[31]可通過抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-1β和COX-2分泌發(fā)揮抗炎作用,槲皮素[32]、谷甾醇[33]可降低TNF-α的表達(dá)水平,表明高良姜可能通過抑制TNF-α信號通路來治療痛風(fēng)和高尿酸血癥。

圖11 TNF信號通路圖

目前,高良姜總黃酮及單體化合物高良姜素、異鼠李素、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素降尿酸藥理活性研究報(bào)道較多,說明活性顯著,但是臨床應(yīng)用或相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)較少。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,闡述了高良姜防治痛風(fēng)和高尿酸血癥的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,其作用特點(diǎn)是多成分調(diào)控多靶點(diǎn),繼而調(diào)控多通路的炎癥反應(yīng)。通過分析高良姜降尿酸的活性成分和分子機(jī)制,為進(jìn)一步開展高良姜降尿酸作用機(jī)制研究和降尿酸產(chǎn)品開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。本研究所獲得的關(guān)鍵活性成分和作用靶點(diǎn)是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫的信息,分子對接虛擬篩選技術(shù)驗(yàn)證了成分與靶點(diǎn)的親和作用,但仍需動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,因此后續(xù)將在此基礎(chǔ)上開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)高良姜治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的作用機(jī)制。