蒲公英葉提取物對(duì)齲齒菌的抑菌活性研究

邢艷霞，祝 賀，成雙雙，孫天雪，楊顏菲，姚曉曼，于 洋，李 波，祝夢(mèng)柳，常桂芳*，劉 瑜

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100；2.淄博市張店區(qū)人民醫(yī)院，山東淄博 255000）

蒲公英（TaraxacummongolicumHand.-Mazz.）別名婆婆丁、黃花地丁、奶汁草、華花郎等，是一種多年生菊科草本植物[1]。我國目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蒲公英種類有75 種以上，其中藥用蒲公英至少占27 種[2]，蒲公英在自然界中資源豐富，分布廣泛，蹤跡遍布全國各地，是我國常見的藥食兩用植物。蒲公英管理簡單、經(jīng)濟(jì)收益良好；同時(shí)抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣，在我國大多地區(qū)均可人工種植[1]。蒲公英提取物及各單體成分均具有較強(qiáng)的生物活性。蒲公英屬植物的抗菌活性物質(zhì)主要包括脂肪酸中的亞油酸和亞麻酸[3]；抗炎活性主要集中于三萜類、黃酮類、酚酸類、有機(jī)酸類以及甾醇類等成分[4]；抑菌活性主要集中在黃酮、有機(jī)酸和多糖類成分[5]。蒲公英具有廣譜抑菌作用，目前發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌和沙門氏菌都有抑菌作用[5]，但少有文章研究其對(duì)齲齒菌的抑菌作用。

近幾年口腔疾病的發(fā)病率處于較高水平，全世界大約80%～90%的人有齲齒的困擾。目前，變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌、口腔鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌被認(rèn)為是導(dǎo)致齲齒的主要細(xì)菌。它們借助口腔中的唾液蛋白黏附并定植在牙齒表面，從而形成牙菌斑[6]。牙菌斑中的齲齒菌可以催化水解口腔中殘存的碳水化合物生成有機(jī)酸，導(dǎo)致牙齒中的羥基磷灰石（HA）溶解，最終形成齲洞[7]。如不及時(shí)修補(bǔ)，則會(huì)累及牙神經(jīng)，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量。對(duì)于齲齒，人們一直在探索治愈的方法，如激光，氟制劑等。這些方法雖然有一定的效果，但長期使用可能會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用[8-9]。針對(duì)這一問題，近年來科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物如蒲公英葉等具有很好的防齲功效[10]，有助于改變目前難以防控和治療齲齒的現(xiàn)狀。本研究以蒲公英葉為原材料，探究蒲公英葉提取物對(duì)變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌、口腔鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌的抑制作用，并評(píng)價(jià)其抑制效果，開拓蒲公英葉在防治齲齒菌領(lǐng)域的研究，旨在為蒲公英葉在藥用和食用方向的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

蒲公英鮮葉，山東騰駿祥生物科技股份有限公司。

試驗(yàn)選取了兩種好氧菌：變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌；一種兼性厭氧菌：口腔鏈球菌；一種嚴(yán)格厭氧菌：牙齦卟啉單胞菌。變異鏈球菌（S.mutans，ATCC25175），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；口腔鏈球菌（S.oralis，ATCC 35037），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；遠(yuǎn)緣鏈球菌（S.sobrinus,BNCC353916），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis，ATCCBAA-308），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

無水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、甘油，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、腦心浸出液（BHI）肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（BHI）培養(yǎng)基、厭氧產(chǎn)氣袋和圓形立式厭氧培養(yǎng)袋，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；哥倫比亞血平板，常德比克曼生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

微波干燥機(jī)，山東科弘微波能有限公司；WZJ-6J 震動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；SW-CJ-1D 型（實(shí)用垂直新穎）單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；索氏提取器，鄭州東亞玻璃儀器廠；RV-10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海耀特設(shè)備儀器有限公司；LGL-25E 真空冷凍干燥機(jī)，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；LG10-2.4A 高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；V-500 型可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SPL-250 生化培養(yǎng)箱，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒲公英葉預(yù)處理

將蒲公英葉摘洗干凈，在80～85 ℃的水中漂燙殺青90 s，撈出后用涼水清洗，濾干水分，調(diào)整微波干燥機(jī)功率為1 200 W，轉(zhuǎn)速為4 r/min，對(duì)蒲公英葉進(jìn)行干燥處理。將干燥后的蒲公英葉用震動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)粉碎，分裝儲(chǔ)存。

1.2.2 蒲公英葉水溶性物質(zhì)的提取

用熱水浸提法提取蒲公英葉中的水溶性物質(zhì)[11]。將水溶性物質(zhì)干燥成粉末，并稱量質(zhì)量，置于4 ℃冰箱中密封儲(chǔ)藏。按公式（1）計(jì)算提取率。

1.2.3 蒲公英葉醇溶性物質(zhì)的提取

用索氏提取法提取蒲公英葉中的醇溶性物質(zhì)。以70%的乙醇為提取溶劑，在94 ℃的恒溫水浴鍋中回流提取，直至顏色變淺，得到黃綠色的蒲公英葉醇溶性成分。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下旋蒸濃縮，真空冷凍干燥24 h，將醇溶性提取物干燥成粉末，并稱量質(zhì)量，置于4 ℃冰箱中密封儲(chǔ)存[12-13]。

1.2.4 供試提取液的制備

蒲公英水提物供試提取液：將水溶性提取物用無菌水配成質(zhì)量濃度為1g/mL的樣品溶液，以溶劑無菌水為陰性對(duì)照。

蒲公英醇提物供試提取液：將醇溶性提取物用二甲基亞砜配成質(zhì)量濃度為1 g/mL 的樣品溶液，以質(zhì)量濃度為1 g/mL 二甲基亞砜為陰性對(duì)照。

蒲公英混合型供試提取液：將水溶性提取物與醇溶性提取物按1∶1 的比例混合，用甘油配成質(zhì)量濃度為1g/mL的樣品溶液，以質(zhì)量濃度為1 g/mL 的甘油為陰性對(duì)照。置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 培養(yǎng)基的選擇

用于本次試驗(yàn)的齲齒菌共四種，分別為變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌、口腔鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌。變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌和口腔鏈球菌液體培養(yǎng)基用腦心浸出液（BHI）肉湯培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基用腦心浸液瓊脂（BHI）培養(yǎng)基。牙齦卟啉單胞菌液體培養(yǎng)基用LB 肉湯培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基用哥倫比亞血平板。

1.2.6 齲齒菌菌懸液的制備

將不同菌種接種至液體培養(yǎng)基中，變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌在BHI 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18～24 h；口腔鏈球菌置于BHI 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24～30 h；牙齦卟啉單胞菌置于BHI 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48～54 h。

將活化好的菌種用高速離心機(jī)在5 000 r/min 的條件下離心10 min，將上清液倒出，在沉淀的菌種中加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，測(cè)其吸光度，將吸光度調(diào)至2.0，菌懸液濃度為106～107CFU/mL，將菌種置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 抑菌作用的測(cè)定

抑菌作用的測(cè)定采用瓊脂打孔擴(kuò)散法[14]，在培養(yǎng)皿中加入齲齒菌涂抹均勻并用6 mm 的打孔器在培養(yǎng)皿上均勻地打4 個(gè)孔。調(diào)整樣品液濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00 g/mL。培養(yǎng)皿中分別加入100 μL 的供試提取液和陰性對(duì)照。按照上述1.2.6 的方式培養(yǎng)。觀察并用十字交叉法量取抑菌圈直徑大小。

1.3.2 最低抑菌濃度的測(cè)定

在培養(yǎng)皿中加入齲齒菌涂抹均勻并用6 mm 的打孔器分布均勻地打5 個(gè)孔[15]，分別加入濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/mL 的供試提取液100 μL。按上述1.2.6 的方式培養(yǎng)。以沒有細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為蒲公英葉提取物的最低抑菌濃度（MIC）值。

1.3.3 最低殺菌濃度的測(cè)定

采用瓊脂培養(yǎng)基平板法[16]，取最低抑菌濃度中未見細(xì)菌生長的孔相對(duì)應(yīng)的供試提取液100 μL 于培養(yǎng)皿中，再加入100 μL 相對(duì)應(yīng)的菌液涂布均勻。按上述1.2.6 的方式培養(yǎng)，觀察齲齒菌的生長狀況。以菌落數(shù)量不超過5個(gè)的最低提取物濃度作為蒲公英葉提取物的最低殺菌濃度（MBC）值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯（Duncanny）多重比較分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英葉提取物的提取率

蒲公英葉提取率如表1所示，蒲公英葉水提物的粗提率為11.9%，醇溶性提取物的粗提率為6.9%。

表1 蒲公英葉提取物提取率Table 1 Extraction rate of dandelion leaves

2.2 蒲公英葉提取物對(duì)齲齒菌的抑菌作用

2.2.1 蒲公英葉水提物對(duì)齲齒菌的抑菌作用

探究蒲公英葉水提物對(duì)四種齲齒菌的抑菌作用，用水作陰性對(duì)照。由表2 可知，當(dāng)蒲公英葉的水提物濃度大于0.50 g/mL 時(shí)，對(duì)變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌和口腔鏈球菌都有抑制作用，但對(duì)牙齦卟啉單胞菌沒有抑菌效果。不同濃度的蒲公英葉水提物對(duì)齲齒菌的抑菌作用有顯著性差異，且抑菌效果與水溶性提取物濃度呈正相關(guān)。蒲公英葉水提物對(duì)遠(yuǎn)緣鏈球菌的抑菌效果更為明顯，變異鏈球菌和口腔鏈球菌次之。

表2 蒲公英葉水提物對(duì)齲齒菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone diameter of dandelion leaf water extract against caries bacteria

本實(shí)驗(yàn)中，蒲公英葉水提物對(duì)牙齦卟啉單胞菌沒有抑制作用，這與華亞南等[17]的結(jié)果一致，可能的原因如下：一是蒲公英葉水提物成分復(fù)雜，而抑菌成分少，含量低，無抑菌作用的成分大大稀釋了抗菌物質(zhì)的濃度，使抑菌效果無法顯示，只有通過除去提取物中的非抑菌成分，提高有效抗菌物質(zhì)的濃度，才能顯示抑菌效果[18]；二是提取方法對(duì)蒲公英葉的抑菌作用存在一定影響。

2.2.2 蒲公英葉醇提物對(duì)齲齒菌的抑菌作用

探究蒲公英葉醇提物對(duì)四種齲齒菌的抑菌作用，用二甲基砜作陰性對(duì)照。由表3 可知，當(dāng)蒲公英葉醇提物濃度大于0.25 g/mL 時(shí)，對(duì)變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌有抑制作用，當(dāng)濃度大于0.50 g/mL 時(shí)，對(duì)四種菌都有抑制作用。不同濃度的蒲公英葉醇提物對(duì)齲齒菌的抑菌作用有顯著性差異，且抑菌效果與醇溶性提取物濃度呈正相關(guān)。蒲公英葉醇提物對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果更為明顯，遠(yuǎn)緣鏈球菌和口腔鏈球菌次之，對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑制效果相對(duì)較差。

表3 蒲公英葉醇提物對(duì)齲齒菌的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameter of dandelion leaf lipid extract on dental caries bacteria

2.2.3 蒲公英葉混合型提取物對(duì)齲齒菌的抑菌作用

探究蒲公英葉混合型提取物對(duì)四種齲齒菌的抑菌作用，用甘油作陰性對(duì)照。由表4 可知，當(dāng)蒲公英葉混合型提取物濃度為0.25 g/mL 時(shí)，只對(duì)遠(yuǎn)緣鏈球菌有抑制作用，當(dāng)濃度大于0.50 g/mL 時(shí)，對(duì)四種菌都有抑制作用。不同濃度的蒲公英葉混合型提取物對(duì)齲齒菌的抑菌作用有顯著性差異，且抑菌效果與混合型提取物濃度呈正相關(guān)。蒲公英葉混合型提取物對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果更為明顯，之后依次是變異鏈球菌、口腔鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌。

表4 蒲公英的混合型提取物對(duì)齲齒菌的抑菌圈直徑Table 4 Inhibition zone diameter of mixed extract of dandelion on caries bacteria

蒲公英葉供試提取液濃度為0.50 g/mL 時(shí)對(duì)齲齒菌有明顯的抑制作用，當(dāng)濃度為0.25 g/mL 時(shí)，對(duì)部分齲齒菌有抑制作用，但0.25g/mL 濃度以下的蒲公英葉供試提取液對(duì)齲齒菌的抑制作用不明確。所以在0.50～0.10 g/mL 之間以0.10 為梯度，測(cè)蒲公英葉供試提取液的最低抑菌濃度。

2.3 蒲公英葉供試提取液的最低抑菌濃度

由表5 可知，對(duì)變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌來說，蒲公英葉醇提物的抑菌效果更好，MIC 為0.20 g/mL；對(duì)口腔鏈球菌來說，蒲公英葉三種供試提取液的抑菌效果相似，MIC 為0.50 g/mL；對(duì)牙齦卟啉單胞菌來說，蒲公英葉醇提物和混合型提取物抑菌效果相似，MIC為0.50 g/mL。

表5 三種供試提取液對(duì)齲齒菌的最低抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of three extracts against caries bacteria

2.4 蒲公英葉供試提取液的最低殺菌濃度

由表6 可知，蒲公英葉醇提物對(duì)變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌的殺菌效果更好，最低殺菌濃度為0.40、0.30 g/mL，對(duì)口腔鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的殺菌效果相對(duì)較差，最低殺菌濃度為0.50 g/mL。

表6 三種供試藥液對(duì)齲齒菌的最低殺菌濃度Table 6 Minimum bactericidal concentration of three tested solutions to caries bacteria

3 結(jié)論與展望

本研究采用體外抑菌的試驗(yàn)方法，對(duì)蒲公英葉供試提取液的體外抑菌情況進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果顯示，蒲公英葉水提物對(duì)變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌和口腔鏈球菌有抑菌作用，在0～1.00 g/mL 濃度內(nèi)對(duì)牙齦卟啉單胞菌沒有抑制作用，蒲公英葉醇提物和混合型提取物對(duì)四種齲齒菌都有抑菌作用。不同濃度的蒲公英葉供試提取液對(duì)齲齒菌的抑菌作用有顯著性差異，且供試提取液濃度與抑菌效果呈正相關(guān)。蒲公英水提物對(duì)遠(yuǎn)緣鏈球菌的最低抑菌濃度為0.40 g/mL，蒲公英醇提物對(duì)變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌的最低抑菌濃度為0.20 g/mL，蒲公英混合型提取物對(duì)遠(yuǎn)緣鏈球菌的最低抑菌濃度為0.30 g/mL。蒲公英水提物對(duì)遠(yuǎn)緣鏈球菌的最低殺菌濃度為0.40 g/mL，蒲公英醇提物對(duì)遠(yuǎn)緣鏈球菌的最低殺菌濃度為0.30 g/mL，蒲公英混合型提取物對(duì)四種齲齒菌的最低殺菌濃度為0.50 g/mL。最低抑菌濃度和最低殺菌濃度與抑菌圈直徑數(shù)據(jù)趨于一致，說明蒲公英葉提取液對(duì)這四種齲齒菌均具有良好抑菌效果。

蒲公英粗提物雖不如單一化學(xué)藥物的殺菌效果強(qiáng)，但綠色天然，安全無毒，來源廣泛，提取工藝簡單，其通過抑菌作用發(fā)揮生物活性，在抑菌領(lǐng)域仍然具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。蒲公英作為天然藥物，其化學(xué)成分復(fù)雜，各個(gè)部位含有的主要活性成分也有所不同。蒲公英葉提取物對(duì)變異鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌、口腔鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果存在差異。蒲公英葉抑制致齲菌的作用是單一成分作用還是多種成分的協(xié)同作用，抑菌有效成分在體內(nèi)和體外的作用是否存在差異也尚待深入研究，為下一步蒲公英類食品、藥品的開發(fā)提供重要的基礎(chǔ)理論支撐。