UiO-66 對種菌唑裝載量的高效液相色譜分析

張奇珍，劉小芳，高圖強(qiáng)，石鑫，劉鵬飛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193)

種菌唑(ipconazole，IPC)為日本吳羽化學(xué)公司于20 世紀(jì)90 年代初開發(fā)的新型三唑類殺菌劑，CAS 登錄號為125225-28-7，CIPAC 編碼為798，化學(xué)名稱2-[(4-氯苯基)甲基]-5-(1-異丙基)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)環(huán)戊醇，化學(xué)式：C18H24ClN3O[1]，結(jié)構(gòu)式見圖1。種菌唑通過抑制病原菌麥角甾醇的生物合成而致效，對水稻惡苗病、胡麻斑病和稻瘟病表現(xiàn)出較好的防治效果，具有殺菌譜廣、活性高，兼具內(nèi)吸和保護(hù)活性，且對單子葉和雙子葉作物均安全等特點(diǎn)[2]。

圖1 種菌唑結(jié)構(gòu)式

金屬有機(jī)骨架(metal organic frameworks，MOFs)是以金屬原子為連接點(diǎn)，有機(jī)配位體支撐構(gòu)成的一維、二維或三維骨架結(jié)構(gòu)。作為一種新型多孔晶體材料，因其具有高孔隙率、結(jié)構(gòu)多樣等特點(diǎn)，可被作為納米粒子載體使用[3-6]。本研究前期從眾多MOFs材料中選擇已在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中顯示出良好應(yīng)用潛力的UiO-66[7]作為載體，將種菌唑進(jìn)行包載，制備出IPC@UiO-66 納米載藥顆粒，對種菌唑具有優(yōu)秀的靶向運(yùn)輸和控緩作用(未發(fā)表)。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了種菌唑原藥、微乳劑以及懸浮劑的高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的檢測分析方法[8-10]。高效液相色譜簡單、快速、重復(fù)性好，為常量分析的主流檢測手段。液質(zhì)聯(lián)用方法的檢出限通常優(yōu)于高效液相色譜法，多用于殘留檢測分析。IPC@UiO-66 中有效成分的定量分析目前尚無公開報(bào)道。與原藥和常規(guī)制劑分析不同，納米載藥體系中有效成分的準(zhǔn)確定量對方法的前處理過程要求較高，需要篩選合適的溶劑對有效成分進(jìn)行充分提取。因此，本文建立了一種測定IPC@UiO-66 中種菌唑裝載量的高效液相色譜分析方法，具有省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的優(yōu)勢，可滿足定量分析要求。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑和試劑

種菌唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度94.4%，BEPURE，北京曼哈格生物科技公司)；甲醇(色譜純，美國FISHER公司)；IPC@UiO-66 納米載藥顆粒(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)制備)。

1.2 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Quintix224-1CN-1 電子天平(德國SARTORIUS 公司)；針筒過濾器：孔徑0.45 μm 濾膜(天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Arium comfortⅡ型超純水系統(tǒng)(德國SARTORIUS公司)。

1.3 高效液相色譜操作條件

紫外檢測器：DAD G1315A；色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇∶純水=80∶20(體積比)，流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL；柱溫：室溫(溫度變化應(yīng)不大于2 ℃)。

1.4 樣品前處理

對IPC@UiO-66 進(jìn)行不同提取溶劑(甲醇、乙腈、純水)和不同超聲時(shí)間(5、10、20、30、50、70 min)的提取處理，篩選種菌唑的最佳提取條件。

1.5 測定步驟

1.5.1 標(biāo)樣溶液的配制

稱取種菌唑標(biāo)準(zhǔn)品(50±0.5)mg，置于50mL的棕色容量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容至50 mL。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至0.005、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 系列質(zhì)量濃度，上機(jī)檢測用于工作曲線的建立。配制用于樣品定量計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，稱取種菌唑標(biāo)準(zhǔn)品(12±0.5)mg，置于10 mL的棕色容量瓶中，準(zhǔn)確移取2.0 mL上述溶液于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容。

1.5.2 試樣溶液的配制

準(zhǔn)確稱取IPC@UiO-66試樣(40±0.5)mg于25 mL的棕色容量瓶中，加入適量甲醇超聲波振蕩處理，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜后待測。

1.5.3 測定

按1.3 節(jié)儀器參數(shù)及條件運(yùn)行液相色譜，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2 針的峰面積變化小于1.5%后，以標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)樣分析。

1.5.4 裝載量計(jì)算

將測得的2 針相鄰試樣溶液及前后2 針標(biāo)樣溶液中的種菌唑峰面積分別進(jìn)行平均，其中種菌唑有由異構(gòu)體I (1RS, 2SR, 5RS)和異構(gòu)體II (1RS, 2SR,5SR)組成[9-11]，計(jì)算峰面積時(shí)將異構(gòu)體I 和異構(gòu)體II 的峰面積相加，根據(jù)下式計(jì)算。

IPC@UiO-66 中種菌唑的裝載量X(%)：

式中：X為試樣中種菌唑的裝載量(%)；A1為標(biāo)樣溶液中種菌唑峰(異構(gòu)體I+異構(gòu)體II)面積的平均值；A2為試樣溶液中種菌唑峰(異構(gòu)體I+異構(gòu)體II)面積的平均值；m1、m2分別為稱取的種菌唑標(biāo)樣和試樣的質(zhì)量(mg)；P為種菌唑標(biāo)準(zhǔn)品的純度(%)；k為種菌唑標(biāo)樣和試樣的配制體積比值。

1.6 方法學(xué)考查

1.6.1 工作曲線建立

HPLC 檢測質(zhì)量濃度為0.005、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 的種菌唑系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，待儀器基線穩(wěn)定后，在優(yōu)化的色譜分離條件下按低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度的順序測定種菌唑系列標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，根據(jù)標(biāo)樣濃度及其對應(yīng)峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到方程。

1.6.2 添加回收率測定

平行稱取15 份(40±0.5)mg不含種菌唑的空白金屬骨架UiO-66 試樣(同批次)于1.5 mL 離心管中，分別添加0.1 mL 質(zhì)量濃度為20、40、80 g/L的種菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度水平重復(fù)5 次，混勻并靜置2 h 后，全部轉(zhuǎn)移至25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3、1.4 節(jié)中甲醇超聲提取方法和色譜檢測條件進(jìn)行提取和檢測，計(jì)算平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.7 樣品檢測

平行稱取10 份(40±0.5)mg的IPC@UiO-66 試樣(同批次)于25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3 節(jié)和1.4 節(jié)中甲醇超聲提取方法和色譜檢測條件進(jìn)行提取和檢測，根據(jù)1.5.4 節(jié)中的公式，計(jì)算IPC@UiO-66 中的種菌唑裝載量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器波長的篩選

在1.3 節(jié)色譜條件下，種菌唑2 個(gè)異構(gòu)體的保留時(shí)間約為9.7、10.7 min。使用高效液相色譜儀檢測器檢測種菌唑在210~400 nm 吸收波長范圍內(nèi)的紫外吸收峰，得到種菌唑的紫外吸收光譜圖，發(fā)現(xiàn)種菌唑在222 nm 波長處有最大紫外吸收峰(圖2a)，在該波長下，儀器響應(yīng)較好，試樣色譜圖中未顯示其他雜質(zhì)峰(圖2b)，因此選擇222 nm 作為種菌唑的檢測波長。

圖2 種菌唑的紫外吸收譜圖(a)及試樣(b)高效液相色譜圖

2.2 方法的線性相關(guān)性

以種菌唑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性方程y=9 903x-32.914，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。說明在質(zhì)量濃度為0.005~0.5 g/L 內(nèi)，種菌唑的質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好(圖3)。

圖3 種菌唑峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

2.3 提取溶劑和超聲時(shí)間的篩選

對IPC@UiO-66 進(jìn)行不同介質(zhì)(甲醇、乙腈、純水)和不同超聲時(shí)間(5、10、20、30、50、70 min)的處理，結(jié)果見圖4?？梢?，超聲處理后，IPC@UiO-66 在甲醇和乙腈有機(jī)相中能較好分散，但在純水中聚集成塊，最終導(dǎo)致無法將種菌唑充分提取。甲醇超聲30 min 種菌唑的裝載量相較于超聲50、70 min 幾乎沒有差異。用乙腈作為提取介質(zhì)，在70 min 內(nèi)不能充分提取有效成分，提取效率僅為理論裝載量的72.21%。因此本研究最終選擇甲醇為提取介質(zhì)，超聲時(shí)間為30 min。

圖4 溶劑與提取時(shí)間對UiO-66 提取效率的影響

2.4 方法準(zhǔn)確度

在不含種菌唑的空白金屬骨架UiO-66 試樣中添加3 種不同質(zhì)量濃度水平的種菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻并靜置2 h 后用甲醇定容，超聲時(shí)間為30 min，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定，結(jié)果見表1。實(shí)測值是IPC@UiO-66 中種菌唑的檢出量，理論添加量和實(shí)際檢出量與農(nóng)藥殘留分析的固定添加水平表述方式不同，主要原因在于添加的種菌唑的質(zhì)量相比于載體質(zhì)量不能忽略。通過計(jì)算，得到UiO-66中種菌唑的加標(biāo)回收率為98.71%~99.34%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%~1.62%，說明該方法對IPC@UiO-66中種菌唑具有良好的提取率，滿足檢測要求。

表1 UiO-66 中種菌唑添加回收率

2.5 樣品檢測

在同一批次IPC@UiO-66 樣品中平行稱取10 個(gè)試樣，進(jìn)行色譜分析，分別計(jì)算其種菌唑裝載量，結(jié)果見表2，含量分布范圍為14.47%~14.61%。

表2 IPC@UiO-66 樣品中種菌唑裝載量檢測

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜儀建立了一種檢測IPC@UiO-66 中有效成分種菌唑的方法。該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，且操作簡便，可以應(yīng)用于含有種菌唑的UiO-66 金屬骨架中有效成分包封率和裝載量的分析，同時(shí)也為UiO-66 裝載其他種類農(nóng)藥的檢測提供了技術(shù)參考。