麻黃水提物減輕脂多糖誘導急性肺損傷的作用及機制研究

苑 萌，董慧文，劉佳麗，馮學輝，韓寶華，韓樹池*，張志斌，盧 晶

河北北方學院附屬第一醫(yī)院急診科，河北 張家口 075000

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是在嚴重感染、休克、創(chuàng)傷等非心源性疾病過程中由肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷造成的彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，臨床上以進行性低氧血癥和呼吸窘迫為主要表現(xiàn)，具有病死率高、救治難度大的特點[1-2]。 相關(guān)的分子生物學研究顯示，活性氧（reactive oxygen species, ROS）/硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein, TXNIP）/Nod 樣受體蛋白3（Nod like receptor protein 3, NLRP3）通路介導的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)在多種ALI 模型中與肺損傷加重有關(guān)[3-4]。 麻黃是具有抗炎、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)等活性的藥物，相關(guān)的動物實驗證實麻黃水提物對藥物性腎損傷、藥物性肝損傷具有保護作用，并且其臟器保護作用與抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)[5-6]。 為深入認識麻黃水提物在ALI 中的治療價值，本文以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）誘導ALI 大鼠為對象，研究麻黃水提物通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路減輕ALI 的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 雄性大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為[SCXK(京)2016-0011]，8 周齡，體質(zhì)量240～260 g，共72 只。 飼養(yǎng)條件：12 h 晝夜交替，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%。實驗過程遵循3R 原則。動物實驗在河北北方學院實驗動物中心開展，使用許可：SYXK（冀）2019-004。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：HBNV202307012098）。

1.2 藥品及試劑

LPS（批號：82857-67-8）購自美國Sigma 公司；麻黃水提物由醫(yī)院藥劑科制備；ROS/NLRP3 激動劑三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide, TMAO）（批號:1184-78-7）購自美國MCE 公司；白細胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（批號：SP12250）購自武漢賽培生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde, MDA）、總抗氧化力（total antioxidant capacity, T-AOC）及ROS 檢測試劑盒（批號分別為SP30131、SP15821、SP13358）購自武漢賽培生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin, HE）染色試劑盒（批號：G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；TXNIP、NLRP3 特異性一抗（批號：ab263899）及β-actin 特異性一抗（批號：ab8226）購自美國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、給藥及脂多糖誘導肺損傷 實驗動物分為正常對照組、模型組、麻黃水提物組、TMAO 組、麻黃水提物+TMAO 組，每組8 只。每組均在造模前進行灌胃給藥，方法如下：正常對照組、模型組給予1 mL/100 g 生理鹽水灌胃，每日1 次，連續(xù)10 d；麻黃水提物組參照文獻[5-6]，將400 mg/kg麻黃水提物溶于1 mL/100 g 生理鹽水中灌胃，每日1 次，連續(xù)10 d；TMAO 組參照文獻[4]，將100 mg/kg TMAO 溶于1 mL/100 g 生理鹽水中灌胃，每日1次，連續(xù)10 d；麻黃水提物+TMAO 組將400 mg/kg 麻黃水提物和100 mg/kg TMAO 溶于1 mL/100 g 生理鹽水中灌胃，每日1 次，連續(xù)10 d。 末次給藥后24 h，除正常對照組外，其余各組均參照文獻[7]進行LPS 誘導ALI 造模，方法如下：腹腔注射0.5 mL LPS 溶液、劑量5 mg/kg，復制LPS 誘導ALI 模型，正常對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 標本取材及保存 造模后6 h， 采用斷頭法處死大鼠，于斷頭處留取外周血8 mL，3 000×g 離心5 min，分離血清并在-80 ℃儲存。 剪開大鼠胸部皮膚暴露胸腔，分離并結(jié)扎右側(cè)支氣管，從左側(cè)主氣管注入磷酸鹽緩沖液，觀察到肺部膨隆后抽回液體，重復操作3 次，合并3 次回抽的緩沖液，250×g 離心10 min，分離上清作為肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF），放入-80 ℃儲存。 取右側(cè)肺組織，生理鹽水清洗后，一部分在4%多聚甲醛中固定、制作石蠟切片，另一部分在液氮中冷凍后放入-80 ℃儲存。

1.3.3 肺組織病理改變的檢測 取肺組織的石蠟切片，按照HE 染色試劑盒的說明書進行染色操作，封片后在顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.4 細胞因子含量的檢測 取血清樣本和BALF樣本，按照酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒進行操作，檢測IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量。

1.3.5 氧化應(yīng)激指標及ROS 活力的檢測 取液氮冷凍的肺組織約30 mg，加入生理鹽水200 μL，研磨后將組織研磨液在4 ℃以12 000×g 離心10 min，取上清并按照試劑盒的說明書進行操作，檢測MDA、T-AOC 的含量及ROS 的活力。

1.3.6 蛋白表達的檢測 取液氮冷凍的肺組織約30 mg，加入200 μL 裂解液，勻漿提取組織蛋白并檢測濃度，將含有30 μg 蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中進行Western blot 實驗。 電泳分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉硝酸纖維素膜1 h，用TXNIP 一抗（1∶600 稀釋）、NLRP3 一抗（1∶400 稀釋）、TXNIP 一抗（1∶250 稀釋）、β-actin 一抗（1∶5 000 稀釋）4 ℃孵育硝酸纖維素膜過夜。 次日，用辣根過氧化物酶二抗（1∶2 000 稀釋）室溫孵育硝酸纖維素膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）內(nèi)顯影得到蛋白條帶，計算蛋白條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算TXNIP、NLRP3 的蛋白表達水平。

1.3.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，以“±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠肺組織病理改變的影響

正常對照組大鼠肺組織形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎癥細胞浸潤；模型組和TMAO 組大鼠均出現(xiàn)肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚的病理改變；麻黃水提物組大鼠肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤減少、肺泡間隔增厚改善；麻黃水提物+TMAO 組大鼠肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚的病理改變較麻黃水提物組加重。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織的HE 染色（×400）

2.2 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠BALF 中炎癥細胞分類的影響

模型組大鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均高于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均低于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠BALF中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO 組大鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)量均高于麻黃水提物組、低于TMAO組（P<0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠BALF 中炎癥細胞分類的比較（×106/L）

2.3 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠血清及BALF 中炎癥細胞因子的影響

模型組大鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量比例均高于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量均低于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量均高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO組大鼠血清及BALF 中IL-1β、IL-18、TNF-α 的含量均高于麻黃水提物組、低于TMAO 組（P<0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清及BALF 中炎癥細胞因子含量的比較

2.4 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平的影響

模型組大鼠肺組織中MDA 的含量高于對照組，T-AOC 的含量低于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠肺組織中MDA 的含量均低于模型組、T-AOC 的含量高于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠肺組織中MDA 的含量高于模型組、T-AOC 的含量低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO 組大鼠肺組織中MDA 的含量高于麻黃水提物組、低于TMAO 組，T-AOC 的含量低于麻黃水提物組、高于TMAO 組（P<0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平的比較

2.5 麻黃水提物及TMAO 對LPS 誘導ALI 大鼠肺組織中ROS/TXNIP/NLRP3 通路的影響

模型組大鼠肺組織中ROS 活力及TXNIP、NLRP3 的表達水平均高于正常對照組（P<0.05）；麻黃水提物組大鼠肺組織中ROS 活力及TXNIP、NLRP3的表達水平均低于模型組（P<0.05）；TMAO 組大鼠肺組織中ROS 的活力及TXNIP、NLRP3 的表達水平高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；麻黃水提物+TMAO 組大鼠肺組織中ROS 的活力及TXNIP、NLRP3 的表達水平高于麻黃水提物組、低于TMAO 組（P<0.05）。 詳見圖2 和表4。

表4 各組大鼠肺組織中ROS 活力及TXNIP、NLRP3表達水平的比較

圖2 各組大鼠肺組織中TXNIP、NLRP3 的蛋白表達

3 討論

ALI 是臨床常見的呼吸系統(tǒng)危重癥，系有非心源性因素引起的急性呼吸窘迫，表現(xiàn)為頑固性低氧血癥，嚴重者可發(fā)展為多器官功能障礙，甚至死亡。從分子生物學機制分析，該病是失控性炎癥反應(yīng)引起的急性肺組織病理損傷，其特征為炎癥細胞在肺內(nèi)大量浸潤、炎癥介質(zhì)過度釋放，同時伴有ROS 大量產(chǎn)生、氧化應(yīng)激反應(yīng)激活[8-9]。 因此，針對ALI 的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)進行抗炎及抗氧化治療，對減輕肺損傷、降低死亡率具有積極意義。

麻黃是麻黃屬植物草麻黃、中麻黃、木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖，其水提物具有抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用[10-11]，用于藥物性肝損傷及腎損傷動物模型的治療，起到臟器保護作用，并減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[5-6]。 LPS 誘導ALI 是研究ALI 常用的動物模型[12-13]，本研究在LPS 誘導ALI 大鼠中觀察麻黃水提物減輕ALI 的治療效果。結(jié)果顯示：腹腔注射LPS 后模型大鼠出現(xiàn)了肺組織內(nèi)炎癥細胞浸潤、肺泡間隔增厚的病理改變，符合ALI特征，表明造模成功；經(jīng)麻黃水提物干預后，肺組織的病理改變明顯減輕，提示麻黃水提物對LPS誘導ALI 具有一定保護作用。

麻黃水提物的腎臟保護作用和肝臟保護作用與抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。 ALI 發(fā)生及進展過程中炎癥反應(yīng)激活的特征是中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在肺內(nèi)浸潤增多，多種炎癥細胞因子如（IL-1β、IL-18、TNF-α）釋放增加。 因此，檢測炎癥細胞數(shù)目及炎癥細胞因子含量能夠反映ALI 進程中炎癥反應(yīng)的程度[14-15]。 氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的特征是ROS 生成增多，引起脂質(zhì)損傷并生成產(chǎn)物MDA，同時消耗多種抗氧化物并引起T-AOC降低，檢測ROA 及MDA、T-AOC 能夠反映ALI 進程中氧化應(yīng)激的程度[16-17]。 本研究中，LPS 誘導ALI 大鼠的BALF 中炎癥細胞數(shù)量、血清及BALF中炎癥細胞因子含量、肺組織中ROS 及MDA 含量均增加，而T-AOC 含量降低，符合炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的ALI 特征。 經(jīng)麻黃水提物干預后，炎癥細胞數(shù)量、炎癥細胞因子及ROS、MDA 含量降低，T-AOC 含量增加，提示麻黃水提物用于LPS 誘導ALI 的治療對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用。

多項研究表明，ROS/TXNIP/NRLP3 在肺炎、ALI、膿毒癥等模型中與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)[18-19]。 ROS 不僅具有氧化活性，能直接介導氧化應(yīng)激，導致組織的氧化損傷，還可促進TXNIP的表達，TXNIP 能激活NLRP3 炎癥小體并引起下游多種炎癥因子的成熟和釋放，進而介導炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大激活。 本研究中，模型組大鼠肺組織中TXNIP、NLRP3 的表達均增加；經(jīng)麻黃水提物干預后，肺組織中TXNIP、NLRP3 的表達均能降低。 TMAO是ROS 激活劑，本研究單獨使用TMAO 干預后進行LPS 誘導ALI 造模，與模型組比較，TMAO 組各項指標差異不顯著，提示模型組大鼠體內(nèi)ROS/TXNIP/NLRP3 通路已處于充分激活狀態(tài)，加用TMAO 并不會進一步激活該通路，這一結(jié)果與國內(nèi)王亞靜在重癥肺炎大鼠中的研究結(jié)果接近[4]；而與僅接受麻黃水提物干預的大鼠比較，經(jīng)麻黃水提物與TMAO 聯(lián)合干預后大鼠的肺損傷明顯加重，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)也發(fā)生激活，提示麻黃水提物干預減輕LPS 誘導ALI 的作用與抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有關(guān)。

綜上所述，麻黃水提物能減輕LPS 誘導ALI、抑制肺部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，其機制可能與抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有關(guān)。麻黃水提物的生物學作用多樣且復雜，是否還通過其他分子通路發(fā)揮減輕ALI 的作用尚不清楚，故而后續(xù)進一步探索其他信號通路在麻黃水提物減輕ALI 中的作用，有助于更全面地認識該藥物的治療價值及機制。