新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的氨甲酰磷酸合成酶1缺乏癥患兒長期隨訪研究

張詹明，童 凡，陳 遲，張 婷，錢古柃，楊 昕，黃新文，楊茹萊，趙正言

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院遺傳與代謝科 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，浙江 杭州 310052

CPS1缺乏癥是由于CPS1（OMIM 608307）發(fā)生雙等位基因致病性變異，導(dǎo)致CPS1（EC 6.3.4.16）功能缺陷所致。CPS1位于尿素循環(huán)第一步，是尿素循環(huán)的啟動酶和限速酶，文獻報道CPS1 缺乏癥患者重癥型居多，出現(xiàn)癥狀后治療的患者病死率高或易遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1-4］。通過新生兒篩查早期發(fā)現(xiàn)和早期診治是改善CPS1 缺乏癥患者預(yù)后的重要手段［5-6］。CPS1 缺乏癥新生兒篩查隊列的長期隨訪資料報道較少，本研究基于浙江省新生兒篩查中心十年的篩查、隨訪數(shù)據(jù)，總結(jié)CPS1缺乏癥患兒基因型及表型特點，探討新生兒篩查對患兒長期預(yù)后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2013 年9 月1 日 至2023 年8 月31 日浙江省新生兒疾病篩查中心所有接受串聯(lián)質(zhì)譜檢查并最終診斷為CPS1 缺乏癥的患兒為研究對象。所有檢查均經(jīng)過患兒家長知情同意，研究方案通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審查（2017-IRB-023）。

1.2 新生兒召回及診斷標(biāo)準(zhǔn)

采用血瓜氨酸作為CPS1 缺乏癥篩查的關(guān)鍵指標(biāo)，以血瓜氨酸低于正常值范圍為篩查陽性標(biāo)準(zhǔn)召回新生兒；排除早產(chǎn)、飲食等繼發(fā)因素，復(fù)查指標(biāo)仍低者建議行基因檢測。

CPS1缺乏癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①存在疾病相關(guān)特征性生化表型，如血瓜氨酸低、血氨高等；②檢出CPS1雙等位基因變異，同時排除具有類似生化表型的其他遺傳性代謝缺陷?。虎蹆H檢出CPS1單等位基因變異病例，經(jīng)長期隨訪與攜帶者鑒別顯示表型符合［7-8］。

1.3 檢測儀器及試劑

新生兒篩查濾紙（Schleicher&Schuell 903）為美國GE 公司產(chǎn)品；新生兒篩查試劑盒為美國PerKin Elmer 公司產(chǎn)品；串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters QuattroMicro API）為美國Waters 公司產(chǎn)品；外顯子捕獲試劑盒為美國Illumina 公司產(chǎn)品；聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.4 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血氨基酸及?；鈮A譜

新生兒出生后48～72 h 足底采血，滴于濾紙，陰干后送檢。干血斑經(jīng)瓜氨酸、精氨酸、甲硫氨酸等11 種氨基酸及琥珀酰丙酮測定試劑盒處理后上串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用非衍生法檢測干血斑中的酰基肉堿。

1.5 高通量測序分析基因變異

采集患兒及其父母靜脈血，送醫(yī)院遺傳實驗室進行遺傳代謝病靶向高通量測序，包含CPS1、ARD1、ASL、ASS1、SLC25A13、OAT、OTC、SLC25A15基因或家系全外顯子基因檢測。其中1例用新生兒篩查剩余的干血斑進行高通量測序，并經(jīng)父母外周靜脈血家系驗證。采用SIFT（https：//sift.jcvi.org/）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、MutationTaster（https：//www.mutationtaster.org/）及HSF 軟件（https：//hsf.genomnis.com/）等預(yù)測變異功能。

1.6 臨床治療和隨訪

疑診CPS1 缺乏癥的患兒立即采取飲食治療（限制天然蛋白質(zhì)攝入量、添加特殊奶粉）、口服瓜氨酸及精氨酸，監(jiān)測瓜氨酸、精氨酸、血氨、肝腎功能、血氣、電解質(zhì)、血糖、乳酸等指標(biāo)，根據(jù)病情調(diào)整飲食及藥物劑量。血氨持續(xù)增高的患兒應(yīng)用精氨酸、苯甲酸鈉等。患兒急性期2～4 周復(fù)診，以后根據(jù)指標(biāo)控制情況1～3個月復(fù)診，監(jiān)測項目包括身高、體重、發(fā)育評估（包括ASQ 和格里菲斯發(fā)育評估量表）及上述生化指標(biāo)等。監(jiān)測患兒的身高、體重，其測量值分別處于同年齡身高、體重第25百分位及以上為正常；測量值小于同年齡體重、身高第25百分位為落后。

2 結(jié)果

2.1 篩查結(jié)果

共篩查新生兒4 056 755名，因血瓜氨酸低應(yīng)召回2918 名，實際召回2870 名，排除營養(yǎng)不良、早產(chǎn)及其他等原因?qū)е碌难习彼峤档停詈笤\斷CPS1 缺乏癥6 例，其中男性3 例，女性3 例，CPS1 缺乏癥的發(fā)病率約為1/676 126 活產(chǎn)新生兒。

2.2 基因檢測結(jié)果

5 例患兒檢測到CPS1基因的雙等位基因變異，1例患兒僅檢測到單位點基因變異。共檢出10種變異類型，2種（c.2359C＞T、c.1549+1G＞T）為已知致病變異；8種為新報道變異，其中c.3405-1G＞T為經(jīng)典剪接突變，c.2372C＞T、c.1436C＞T、c.2228T＞C、c.2441G＞A、c.3031G＞A為錯義突變，c.3075T＞C為同義突變，c.390-403del 為移碼突變。見表1。提示CPS1變異位點分散，以錯義突變?yōu)橹鳌?/p>

表1 6例氨甲酰磷酸合成酶1缺乏癥患兒CPS1基因檢測結(jié)果Table 1 CPS1 gene variations in six children with carbamoyl phosphate synthase 1 deficiency

2.3 臨床監(jiān)測結(jié)果

所有CPS1缺乏癥患兒的父母均健康，非近親婚配，否認(rèn)不良孕產(chǎn)史?；純弘S訪至9個月～10歲，除1例（例3）于新生兒時期死亡，其余5例均存活。所有患兒初篩血瓜氨酸均降低（2.72～6.21 μmol/L，正常值范圍7.14～37.00 μmol/L），并伴血氨不同程度增高，血氨峰值為72～304 μmol/L（正常值范圍9～30 μmol/L）。其中例1 出生4 d 因“反應(yīng)低下”擬“新生兒敗血癥”收入院，體檢生理反射減低，入院第2 日即檢測到血氨升高（203 μmol/L），同時伴血瓜氨酸降低（3.37 μmol/L）。例3新生兒期發(fā)病，新生兒篩查（血瓜氨酸2.72 μmol/L）召回時已在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院住院治療，表現(xiàn)為發(fā)紺、嗜睡，起初考慮為感染性疾病，抗感染治療效果欠佳，進一步檢查發(fā)現(xiàn)血氨升高（304 μmol/L）。結(jié)果提示，瓜氨酸降低、血氨升高為CPS1 缺乏癥的特征性生化表現(xiàn)。

2.4 治療及隨訪結(jié)果

CPS1 缺乏癥患兒在隨訪過程中血瓜氨酸的絕對值波動于3.34～120.00 μmol/L，血氨值波動于22～118 μmol/L。其中，例1 檢測到血氨升高后立即予精氨酸泵注，后期給予精氨酸、瓜氨酸口服及對癥支持治療，住院7 d，血氨恢復(fù)正常，一般情況好轉(zhuǎn)后出院，隨訪發(fā)現(xiàn)患兒存在明顯飲食喜好偏差，不喜吃肉；例3發(fā)現(xiàn)血氨升高后經(jīng)常規(guī)治療無效后死亡，經(jīng)家長同意利用新生兒篩查剩余的干血斑進行高通量測序，并用父母外周血標(biāo)本進行家系驗證，結(jié)果存在CPS1復(fù)合雜合變異；例6檢出血瓜氨酸持續(xù)減少及血氨進行性增加至85 μmol/L，啟動精氨酸口服治療，后因基因僅檢測到來自父源的單個變異（父親血瓜氨酸正常），患兒臨床未見異常，嘗試停藥1個月，重新出現(xiàn)血氨基酸及血氨等生化指標(biāo)改變，并出現(xiàn)肌張力偏高表現(xiàn)，故予診斷，給予精氨酸及限制蛋白飲食。另外，例1 和例2 存在多動或?qū)W習(xí)障礙等問題；例5 隨訪過程中發(fā)現(xiàn)一過性嘴角抽動。5 例患兒接受ASQ 或格里菲斯發(fā)育評估量表評估均顯示正常。存活患兒除例4 身高和體重均正常，其余4 例均合并身高或體重發(fā)育落后。見表2。提示通過新生兒篩查診斷并隨訪治療的CPS1 缺乏癥患兒大多預(yù)后較好。

表2 6例氨甲酰磷酸合成酶1缺乏癥患兒臨床資料及隨訪情況Table 2 The clinical data and follow-up information of 6 cases with carbamoyl phosphate synthase 1 deficiency

3 討論

CPS1 缺乏癥在新生兒中的發(fā)病率具有明顯的地區(qū)差異，美國為1/1 300 000～1/60 000［9-10］，歐洲為1/300 000［11］，日本為1/320 000［12］。本文資料來源于浙江省新生兒篩查，樣本較大，結(jié)果顯示，405 萬余名篩查新生兒中確診CPS1 缺乏癥患兒6 例，發(fā)病率約為1/680 000，低于日本和歐洲報道，提示CPS1 缺乏癥在浙江人群中較為罕見。但是，由于新生兒篩查以血瓜氨酸作為關(guān)鍵指標(biāo)，存在假陰性的可能，因此CPS1 缺乏癥的實際患病率可能更高。

CPS1 缺乏癥屬于尿素循環(huán)障礙，由于CPS1參與催化尿素循環(huán)的第一步，是關(guān)鍵的限速酶，通常被認(rèn)為是尿素循環(huán)障礙中癥狀最重的類型，臨床常在新生兒期間發(fā)病，表現(xiàn)為高氨血癥、嘔吐、共濟失調(diào)、嗜睡進展為昏迷，若在出現(xiàn)癥狀后再治療，患者病死率高達50%，多數(shù)遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［11］，少數(shù)晚發(fā)型患者的存活率超過90%［13］。CPS1 缺乏癥患者典型的生化指標(biāo)改變?yōu)檠习彼釡p少、血氨增加。本文資料中，患兒初篩血瓜氨酸絕對值為2.72～6.21 μmol/L，并伴血氨不同程度增加，血氨峰值為72～304 μmol/L。其中3 例患者尿液檢測提示尿乳清酸正常，與既往報道一致［14］。結(jié)果提示，血瓜氨酸減少、血氨增加為CPS1缺乏癥相對特征性的改變，而尿有機酸檢測的診斷價值有限。所有存活CPS1 缺乏癥患兒經(jīng)確診后均定期監(jiān)測瓜氨酸及血氨等指標(biāo)，并及時根據(jù)檢驗結(jié)果調(diào)整飲食指導(dǎo)及藥物治療方案?；純悍謩e隨訪9 個月～10 年，除1 例新生兒期死亡，其余患兒目前均存活，且發(fā)育評估均正常。5 例存活患兒中，例1、例2 存在行為問題，包括注意力缺陷、多動、學(xué)習(xí)障礙等，例5、例6 分別出現(xiàn)一過性的神經(jīng)癥狀，包括嘴角抽動、肌張力偏高。與文獻報道中出現(xiàn)癥狀后再治療的患者比較，本文資料經(jīng)新生兒篩查早期診斷、治療的CPS1缺乏癥患兒的整體預(yù)后明顯更優(yōu)，其中80%患兒存在身高或體重落后的情況，考慮與限制天然蛋白飲食有關(guān)，建議CPS1 缺乏癥患兒隨訪治療過程中需加強營養(yǎng)評估及支持治療。

CPS1缺乏癥屬于常染色體隱性遺傳病，其致病基因CPS1位于染色體2q35，包含38個外顯子和4500 個編碼核苷酸，以錯義突變多見，其他無義、剪接點突變、框移突變及小片段缺失亦有報道［15-16］。LOVD數(shù)據(jù)庫（http：//www.LOVD.nl/CPS1）、HGMD 數(shù)據(jù)庫（http：//www.hgmd.org/）等顯示，超過240個CPS1致病性變異廣泛分布在各個外顯子中，多數(shù)為家族特有變異，這給CPS1 缺乏癥患兒的基因診斷帶來了巨大挑戰(zhàn)。本文資料6例患兒檢測到10 種不同的基因型，以點突變?yōu)橹?，包? 個無義突變、1 個同義突變及5 個錯義突變，另有2個剪接突變，1個移碼變異，體現(xiàn)CPS1基因變異具有高度遺傳異質(zhì)性，與既往文獻報道一致［15］。患兒最終經(jīng)長期隨訪聯(lián)合生化表型獲得診斷。本文資料中基因改變以錯義突變?yōu)橹?，如c.3031G＞A（p.V1011M）、c.2441G＞A（p.R814Q），通過SIFT、Polyphen-2 和MutationTaster 等多個軟件對以上位點進行蛋白功能預(yù)測，均提示為“高度危害”。例1檢測到c.2359C＞T 變異，即第2359位堿基胞嘌呤突變?yōu)樾叵汆堰?，?dǎo)致過早產(chǎn)生終止密碼子，可能導(dǎo)致編碼蛋白的截短或由于無義介導(dǎo)的衰變而導(dǎo)致蛋白缺失。Rapp等［17］報道過此位點純合變異的患者資料，并對其做了肝細(xì)胞活檢酶學(xué)測定，發(fā)現(xiàn)該患者肝臟中檢測的CPS1 活性完全喪失，且在9 個月后死亡。例1 在隨訪10年期間出現(xiàn)多次血氨升高，但經(jīng)積極治療后生長發(fā)育正常。例3 在新生兒期死于高氨血癥，基因檢測顯示存在c.3075T＞C 和c.3405-1G＞T 變異，其中c.3075T＞C 雖為同義突變，推測也存在改變mRNA剪切、蛋白質(zhì)空間位置，最終產(chǎn)生有害變異的可能［18］；而c.3405-1G＞T 為經(jīng)典剪接突變，往往影響mRNA 剪切，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失［19］。例4存在c.1549+1G＞T 變異，該變異亦為經(jīng)典剪接突變，經(jīng)HSF 軟件預(yù)測，該變異影響mRNA 剪切，進而可能影響蛋白質(zhì)合成，該患兒目前一般狀況良好。例6檢測到的c.390-403del為移碼突變，預(yù)測可導(dǎo)致多肽鏈合成提前終止。由于CPS1變異分散，多數(shù)為家系特有，本文資料未發(fā)現(xiàn)基因型與表型的相關(guān)性，有待進一步積累資料挖掘。

綜上，浙江省CPS1 缺乏癥較罕見；其變異位點分散，多為家系特有，這給CPS1 缺乏癥基因診斷帶來挑戰(zhàn)，結(jié)合生化指標(biāo)及臨床表型是目前診斷CPS1 缺乏癥的可行方案。新生兒篩查早期診斷規(guī)范治療患兒預(yù)后較好。

志謝研究得到國家重點研發(fā)計劃（2022YFC2703400）支持

AcknowledgementsThis work was supported by the National Key R&D Project of China (2022YFC2703400)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of InterestsThe authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)