山東榮成海帶病害原因的初步調查及分析

劉曉慧，蓋珊珊，辛美麗，詹冬梅，范妮妮，劉瑋

（1.山東省海洋科學研究院，山東省大型海藻資源保護與應用工程技術研究中心，山東 青島 266104；2.青島市大型海藻工程技術研究中心，山東 青島 266104；3.中國水產科學研究院長島增殖實驗站，山東 長島 265800）

海帶（Saccharina japonica）是我國最重要的養(yǎng)殖經濟藻類，養(yǎng)殖產量占我國藻類養(yǎng)殖總產量的50%以上[1]，具有良好的食用、藥用和工業(yè)價值[2,3]。養(yǎng)殖面積不斷擴大和養(yǎng)殖密度居高不下加劇了海帶養(yǎng)殖病害的爆發(fā)，影響了海帶養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展[4-7]。榮成是我國北方重要的海帶養(yǎng)殖基地，產量達全國海帶養(yǎng)殖產量的30%[8]，2021 年底，榮成北部海域突發(fā)海帶規(guī)模性病害，截至2022 年1 月已殃及榮成北部全部海帶養(yǎng)殖產區(qū)，并逐漸向南蔓延。

根據致病原因，海帶病害主要包括生理性病害和病原性病害兩大類，前者如綠爛病、白爛病和泡爛病等，由環(huán)境因素變化引發(fā)；后者如畸形病、葉卷病等，由微生物病原體引發(fā)[6,7]。近年來報道的海帶病害多為生理性病害，如2018 年10 月山東威海育苗場的綠爛??；2019 年3 月福建莆田的爛孔病和2019 年7 月山東青島的黑斑病等[9,10]，而有關海帶病害的研究主要集中在病原分析、生化組分變化、褐藻多酚抑菌效果及附生菌群落結構等[7,10-15]。雖然目前海帶病害已得到了越來越多的關注，但由于海帶病害種類多、病因錯綜復雜、病程各具特殊性等原因，導致可供分析的病害病例資料仍相對匱乏。

形態(tài)學是分類研究最直觀的依據，形態(tài)性狀差異分析不僅廣泛應用于藻類群體分化、品系篩選等研究[16-18]，也是分析病害發(fā)生的重要手段。本研究采用方差分析、判別分析及相關性分析等比較研究了榮成灣至愛蓮灣海域的成山、俚島、瓦屋石和尋山4個海區(qū)海帶的形態(tài)特征、組織成分含量及海區(qū)營養(yǎng)鹽含量，以期闡明病害對榮成養(yǎng)殖海帶的影響，探尋病害的病程特點和致病原因，為海帶病害的診斷與防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022 年1 月6 日，在榮成沿岸4 個養(yǎng)殖海區(qū)采集海帶樣品（圖1）。采樣時4 個養(yǎng)殖海區(qū)的海帶均已發(fā)病，成山和俚島海帶為點狀白爛，瓦屋石和尋山海帶為綠爛，其中成山海帶病爛最為嚴重，俚島次之，瓦屋石和尋山病情較輕，且尋山海帶處于幼苗暫養(yǎng)期。各海區(qū)隨機采集海帶不少于30 棵，共計131 棵（表1）。海帶樣品現(xiàn)場采集后0 ℃保存并立即轉運至實驗室進行后續(xù)處理，海水水樣以0.45 μm 濾膜現(xiàn)場抽濾后冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 榮成海帶采樣地點Fig.1 Sampling sites of kelp S.japonica in Rongcheng

1.2 海帶形態(tài)特征測量

海帶藻體沖洗后擦干表面測量體長、體寬和鮮重，計算體長/鮮重、體寬/鮮重和體長/體寬的比值。用色差儀（威福光電WR-10）測定海帶葉片生長部L*、a*、b*色度值，即明度、紅綠色度和黃藍色度[19]。

1.3 海帶組織成分測定

測定了海帶樣本組織的含水率、可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素a 和類胡蘿卜素含量，每個成分重復測定3 次。海帶樣品于80 ℃下烘干至恒重測定含水率；可溶性糖參照農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 1278-2007）測定；可溶性蛋白參照考馬斯亮藍法測定；葉綠素a 和類胡蘿卜素參考史修周等[20]的方法測定。按下列公式計算葉綠素a 和類胡蘿卜素的含量，總色素為葉綠素a 和類胡蘿卜素含量之和。葉綠素a 含量=12.72A663-2.59A645，類胡蘿卜素含量=[1000×A470-3.27×（12.72A663-2.59A645）-104×（22.88A645-4.67A663）]/229。

1.4 海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度測定

海水樣品中無機氮和活性磷酸鹽濃度參照《海洋調查規(guī)范第4 部分：海水分析》（BG/T 17378.4-2007）分析測定，每個樣品重復3 次。

1.5 數據分析

用Excel 軟件處理數據。用SPSS19.0 軟件對海帶形態(tài)特征進行方差分析和判別分析；對海帶組織成分含量和海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度進行方差分析；對海帶形態(tài)特征、組織成分含量及海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 海帶病害癥狀

與同期正常養(yǎng)殖海帶（圖2-a）相比，發(fā)病海帶葉片顏色變淺，發(fā)黃發(fā)白，潰爛脫落，病情嚴重的僅剩假根附近藻體（圖2-b）。調查中發(fā)現(xiàn)了點狀白爛和綠爛等多種病害癥狀，其中成山和俚島海帶主要為點狀白爛病，葉片脆硬，出現(xiàn)不規(guī)則白點并逐漸變薄形成孔洞，孔洞向中部和生長部蔓延擴大，最終導致葉片大面積潰爛和脫落（圖2-c、d）；瓦屋石和尋山海帶則表現(xiàn)出綠爛病的癥狀，葉稍和葉緣發(fā)黃發(fā)綠，伴隨變軟發(fā)粘而腐爛，綠爛部位逐漸向中下部擴大（圖2-e、f）。

圖2 海帶病害特征Fig.2 Clinic symptoms of the diseased kelp S.japonica

2.2 海帶形態(tài)差異

2.2.1 生長指標

所有海帶樣品的平均體長、體寬和鮮重分別為（617.1±310.5）mm、（124.6±70.5）mm 和（46.5±44.5）g。成山海帶在所有群體中葉片潰爛最為嚴重，生長指標最低，平均體長、體寬和鮮重分別為（270.3±110.0）mm、（69.3±31.8）mm 和（10.8±8.7）g。尋山海帶處于幼苗暫養(yǎng)期，但生長指標高于成山海帶，平均體長、體寬和鮮重分別為（556.9±88.0）mm，（70.3±20.7）mm，（19.1±8.9）g。俚島海帶平均體長、體寬和鮮重分別為（728.7±92.1）mm、（167.4±30.7）mm 和（63.3±19.7）g，均顯著高于成山和尋山海帶。瓦屋石海帶生長指標最高，平均體長、體寬和鮮重分別為（1 039.5±177.1）mm、（211.9±50.5）mm 和（105.8±43.5）g（表1、圖3）。

圖3 海帶體長、體寬和鮮重箱線圖Fig.3 Boxplot of body length,body width and fresh body weight of kelp S.japonica samples

結果發(fā)現(xiàn)，不同海帶群體間生長指標的差異顯著，但體長、體寬和鮮重均表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，由低到高依次為成山、尋山、俚島和瓦屋石，其中尋山和成山海帶的生長指標低于整體平均水平，瓦屋石和俚島海帶高于整體平均水平（圖3）。

2.2.2 顏色指標

成山和俚島海帶L*、a*、b*的平均值分別為31.70±4.77、7.10±0.71、20.50±5.60 和34.10±1.52、8.60±0.60、23.1±2.95，兩個群體L*和b*值差異不顯著，且均高于瓦屋石海帶，低于尋山海帶，表明成山和俚島海帶顏色的明度和黃藍色度較為接近，與瓦屋石海帶相比顏色較淺且偏黃；與尋山海帶相比顏色較深且偏藍（黃藍色度上b*值較高）。瓦屋石海帶L*、a*、b*的平均值分別26.10±2.30、6.80±0.79 和13.50±3.72，3 個色度值均低于其他群體。尋山海帶L*、a*、b*的平均值分別為39.90±3.76、7.40±0.66 和26.00±2.54，其中L*和b*值高于其他群體（圖4）。

圖4 海帶L*、a*、b*色度值箱線圖Fig.4 Boxplot of L*,a*and b*of kelp S.japonica samples

2.2.3 判別分析

采用逐步判別法從體長、體寬、鮮重、體長/鮮重、體寬/鮮重、體長/體寬和L*、a*、b*共9 個特征值中篩選出6 個，建立了4 個海帶群體的判別公式：

成山Y=0.081X1+0.421X2+0.393X3+45.045X4+117.228X5-36.289X6-779.090；

俚島Y=0.113X1+0.334X2+0.253X3+49.819X4+137.095X5-40.578X6-1011.333；

瓦屋石Y=0.124X1+0.436X2-0.284X3+44.941X4+123.410X5-37.774X6-819.476；

尋山Y=0.093X1+0.303X2+3.204X3+52.969X4+127.778X5-41.174X6-1044.423。

式中，X1～X6分別代表體長、體長/鮮重、體長/體寬、L*、a*、b*。依據判別方程式進行判別分組，4 個群體的判別準確率在90.0%～100.0%之間，其中俚島群體判別準確率最高為100.0%，綜合判別率為94.6%（表2）。

表2 4 個海帶群體的判別分析Tab.2 Discriminant results of 4 populations of kelp S.japonica

2.3 海帶組織成分

各群體海帶含水率變化范圍為85.4%～93.2%，尋山最高，成山最低。海帶葉綠素a、類胡蘿卜素和總色素含量變化范圍分別為0.21～0.46 mg·g-1、0.03～0.08 mg·g-1和0.24～0.54 mg·g-1，均是尋山最高，俚島最低，成山和瓦屋石介于二者之間。海帶可溶性糖含量變化范圍為0.02%～0.07%，成山最高，其他3 個群體差異不顯著。海帶可溶性蛋白含量變化范圍為0.32～0.85 mg·g-1，由高到低依次為瓦屋石、尋山、俚島和成山（圖5）。

圖5 不同海帶群體的組織成分含量Fig.5 Biochemical component contents of different populations of kelp S.japonica

2.4 海區(qū)營養(yǎng)鹽

各采樣海區(qū)無機氮和活性磷酸鹽濃度的變化范圍分別為0.024～0.094 mg·L-1和0.001～0.007 mg·L-1，其中成山海區(qū)無機氮濃度最高，其他3 個海區(qū)無機氮濃度均低于0.038 mg·L-1；俚島和瓦屋石海區(qū)活性磷酸鹽濃度相對較高，成山和尋山活性磷酸鹽濃度較低（圖6）。成山、俚島、瓦屋石和尋山海區(qū)氮磷比分別為94∶1、3.4∶1、6.3∶1 和27∶1。調查海區(qū)整體無機氮濃度為（0.045±0.028）mg·L-1，活性磷酸鹽濃度為（0.003±0.002）mg·L-1。

圖6 不同海區(qū)的營養(yǎng)鹽濃度Fig.6 Nutrient concentrations in different mariculture areas

2.5 相關性分析

2.5.1 海帶體長、體寬、鮮重與生長指標、顏色指標和組織成分含量的相關性分析

對點狀白爛群體（成山、俚島）和綠爛群體（瓦屋石、尋山）海帶的體長、體寬、鮮重與生長指標、顏色指標和組織成分含量的相關性分析表明，點狀白爛群體的體長、體寬、鮮重與色度值a*呈顯著正相關，綠爛群體的體長、體寬、鮮重與L*、a*、b*色度值呈顯著負相關。兩種病害群體各自的體長、體寬和鮮重之間均存在顯著的正相關關系，但體長、體寬和鮮重與組織成分含量之間的相關性不顯著（表3）。

表3 海帶體長、體寬、鮮重與生長指標、顏色指標和組織成分含量之間的相關性Tab.3 Correlation between body length,body width,fresh body weight and growth indicator,color indicator,biochemical component contents of kelp S.japonica

2.5.2 海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度與海帶生長指標、顏色指標及組織成分含量的相關性分析

不同病害海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度與海帶生長指標、顏色指標及組織成分含量的相關性分析表明，成山和俚島海區(qū)無機氮和活性磷酸鹽濃度與海帶生長指標、顏色指標及組織成分含量之間的相關性均不顯著；瓦屋石和尋山海區(qū)無機氮濃度與海帶體長呈顯著正相關，與色度值L*呈顯著負相關，活性磷酸鹽濃度與海帶鮮重呈顯著正相關；各海區(qū)無機氮和活性磷酸鹽濃度與海帶組織成分含量之間的相關性均不顯著，但除含水率外，無機氮濃度和其他組織成分含量的相關系數均為正值，呈正相關（表4）。

表4 海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度與海帶生長指標、顏色指標和組織成分含量之間的相關性Tab.4 Correlation between mariculture area nutrients and growth indicator,color indicator,biochemical component contents of kelp S.japonica

3 討論

3.1 海帶病害特征

自海帶筏式養(yǎng)殖技術建立以來，海帶病害時有發(fā)生[9,10,21]，是制約海帶養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展的重要瓶頸。2021 年底山東榮成沿岸海區(qū)發(fā)生的海帶病害范圍之廣，損失之重近五十年來少見。截至采樣時，榮成北部海帶養(yǎng)殖區(qū)均受到此次病害的嚴重影響，面臨減產甚至絕產的風險。與以往單一病害的報道不同，此次海帶發(fā)病存在點狀白爛和綠爛等多種病害癥狀，其中成山和俚島海帶主要為點狀白爛病，而瓦屋石和尋山海帶主要為綠爛?。ū?）。

點狀白爛病和綠爛病都是海帶人工養(yǎng)殖中常見的病害。其中點狀白爛病屬于栽培期生理性病害，發(fā)病速度快，3～5 天就會造成嚴重的病爛[22]。成山和俚島海帶葉片上先出現(xiàn)不規(guī)則白點，隨后白點逐漸腐爛形成孔洞，孔洞連成片導致葉片整個白爛脫落，孔洞和脫落邊緣發(fā)白發(fā)黃，葉片脆硬，與1963—1964 年間煙臺和威海海帶點狀白爛的記錄特征一致[21]。綠爛病在海帶育苗期和栽培期均有可能發(fā)生，環(huán)境條件的不適和褐藻酸降解菌的大量繁殖分別會造成海帶生理性綠爛和病原性綠爛[6,10]。褐藻酸降解菌通常在海帶遭受環(huán)境脅迫、抗病力下降時大量繁殖，使病情擴大，但環(huán)境因子往往是誘發(fā)海帶大規(guī)模綠爛的主要原因[10,23,24]（表5）。近年來海帶綠爛病多發(fā)生在育苗期[10,25]，栽培期綠爛病的報道相對較少，而此次調查中瓦屋石和尋山海帶均有綠爛跡象，但癥狀相對較輕，僅葉稍和葉緣出現(xiàn)了黃綠和軟爛，葉片形態(tài)較為完整。海帶病害的誘因錯綜復雜，同一表征也可能由不同的原因引起，如海區(qū)營養(yǎng)鹽過高或受光不足時，海帶容易發(fā)生綠爛，水質貧瘠或光照過強時，則常常發(fā)生各種白爛[10,21]。也有研究表明，營養(yǎng)鹽濃度過高或過低都可能發(fā)生綠爛病[25]。榮成此次病害范圍廣、種類多，調查海區(qū)養(yǎng)殖海帶的發(fā)病率高達100%，是環(huán)境條件引發(fā)的生理性病害，可能與海區(qū)營養(yǎng)鹽和光照等多個環(huán)境條件的不同變化有關。

3.2 海帶形態(tài)差異

此次病害由榮成灣向南蔓延，先北后南逐漸發(fā)病。位于采樣海區(qū)最北端的成山海帶受病害影響的時間最早，采樣時海帶葉片潰爛嚴重，大部分海帶僅剩假根附近藻體，生長指標甚至低于幼苗暫養(yǎng)期的尋山海帶。由成山向南至俚島和瓦屋石，海帶體長、體寬和鮮重的生長指標逐漸變好，且群體間差異顯著，判別準確率在90.0%～100.0%之間。在以往報道中，榮成桑溝灣正常養(yǎng)殖海帶1 月的平均體長、體寬和鮮重可分別達到（1 860±490）mm、（310±60）mm 和（282±167）g[26]（表5），此次調查中4 個海帶群體的平均體長、體寬和鮮重均低于同期桑溝灣養(yǎng)殖海帶的生長水平，其中病情最為嚴重的成山海帶鮮重為桑溝灣海帶鮮重的3.8%，病情較輕的瓦屋石海帶鮮重也僅為桑溝灣海帶鮮重的37.5%，可見此次病害對榮成養(yǎng)殖海帶生長造成了嚴重的影響。

海帶顏色變化普遍存在于生長不良及養(yǎng)殖病害發(fā)生的過程中，如缺氮導致的藻體淡黃[27]，白爛病的葉色淡褐和白化，綠爛病的綠色腐爛，黑斑病的黑色斑點，白斑病的白色斑塊等，其顏色變化都是相應病害中典型的病理表征[5,7,28]。成山和俚島海帶表現(xiàn)為點狀白爛，其L*和b*值均顯著高于瓦屋石海帶，反應出成山和俚島海帶葉片顏色較淺且偏黃，這與點狀白爛海帶葉片發(fā)白的顏色癥狀相吻合[22]。在相關性分析中，成山和俚島海帶的生長指標與L*和b*色度值的相關性雖不顯著，但均為正值，表明在生長過程中點狀白爛病使海帶葉片顏色變淺發(fā)黃的趨勢。瓦屋石海帶為綠爛，其a*值在4個群體中最低，反應出瓦屋石海帶顏色相對偏綠，這與觀察者對海帶綠爛病葉片顏色明顯發(fā)綠的感官認知也相一致[5]，相關性分析中，瓦屋石和尋山群體的生長指標與a*值呈顯著負相關，說明海帶在生長過程中a*值降低，表明了綠爛病使葉片發(fā)綠的趨勢。但除了病害作用，海帶顏色也受到生長階段等其他因素的影響，海帶孢子體在生長發(fā)育過程中葉片顏色會隨生長而慢慢加深，由幼齡期的淡褐色逐漸變?yōu)楹癯善诘臐夂稚玔27]。這解釋了尋山海帶L*和b*值高于成山、俚島和瓦屋石海帶的原因，反應了成山、俚島和瓦屋石海帶的生長。

3.3 海帶組織成分

海帶病害過程中生理生化反應的改變會造成色素、可溶性糖、可溶性蛋白等組織成分含量和抗氧化能力的變化[7,12]。葉綠素含量影響植物的光合速率和光合能力，反映了植物體的生產力水平[29]，類胡蘿卜素是光合作用的輔助色素，二者對自由基的清除具有共同作用，有一定的抗氧化活性[30]。健康海帶中色素含量通常隨海帶的生長而增加，與海帶生長環(huán)境中光強、光周期及水溫等因素的變化節(jié)律相協(xié)調[31]。在本研究中，病癥較為嚴重的成山和俚島海帶色素含量，特別是葉綠素a 含量，均顯著低于病癥最輕且尚處于幼苗暫養(yǎng)期的尋山海帶，相比之下葉綠素a 含量降低了41.3%～54.3%。瓦屋石和尋山海帶色素含量雖然高于成山和俚島海帶，但也低于以往報道的新鮮海帶葉綠素a 的含量0.877 mg·g-1[30]（表5）。在Wang 等[7]對海帶白斑病的相關研究中，也發(fā)現(xiàn)了病害減緩海帶體內色素積累的現(xiàn)象，并指出低色素含量在海帶抵御病害中發(fā)揮重要作用。色素含量是海帶病害發(fā)生過程中變化較為明顯的組織成分之一。

光照影響海藻體內葉綠素a 和類胡蘿卜素的含量，隨光照強度的增加，兩種色素的含量往往降低[32-34]，而色素含量的降低也會反過來有助于海帶調節(jié)光合作用以適應環(huán)境壓力[31]。栽培水層光照的突然增強又往往會引起點狀白爛病的發(fā)生[10]。推測光照強度的增大可能是成山和俚島海帶發(fā)生點狀白爛，并使其色素含量降低的重要原因。調查中了解到榮成近岸海帶養(yǎng)殖區(qū)同期曾遭受赤潮影響，海水中藻細胞密度一度達到3×106個/L，赤潮過后海水水色由鐵銹色變澄清，海水透明度升高，這也證實了強光照射造成海帶發(fā)病的推測。

可溶性蛋白和可溶性糖是衡量植物代謝水平的成分指標，同時作為抵御逆境脅迫的重要組分，在面臨高溫、重金屬脅迫及病爛發(fā)生時，海帶及其他褐藻往往會因為體內產生抗體蛋白而使可溶性蛋白含量先有小幅上升，在防御遭到破壞后含量逐漸下降[12,35,36]。本研究中，瓦屋石和尋山海帶的病害癥狀相對較輕，對應著較高的可溶性蛋白含量；病情較重的成山和俚島海帶與尋山相比，可溶性蛋白含量降低了26.4%～56.0%，也恰好可以反應出病害對海帶產生影響的作用過程。不同病害群體的可溶性糖含量均低于桑溝灣養(yǎng)殖海帶的可溶性糖含量水平[37]（表5），表明了病害影響下海帶可溶性糖含量下降的趨勢[12]。

3.4 養(yǎng)殖海區(qū)營養(yǎng)鹽

氮、磷是海帶生長必需的營養(yǎng)元素，在自然海水中濃度不高，又時常由于浮游藻類的生長繁殖而消耗[38]，常成為海藻生長的限制性營養(yǎng)鹽[39]。海帶養(yǎng)殖中，氮、磷濃度分別在0.1 mg·L-1和0.004 mg·L-1以上更為適宜，氮濃度在0.05 mg·L-1以下時，會影響海帶生長[27]。歷史資料表明，榮成近岸海區(qū)的營養(yǎng)鹽水平較低，夏季浮游植物的生長常受到磷的限制，且營養(yǎng)鹽波動與海帶的生長周期有一定的關系。在11 月海帶生長初期營養(yǎng)鹽濃度較高，5 月海帶生長后期營養(yǎng)鹽濃度較低[40,41]。本調查研究在1月開展，處于海帶生長前期，但無機氮和活性磷酸鹽的整體濃度分別為（0.045±0.028）mg·L-1和（0.003±0.002）mg·L-1，與榮成愛蓮灣3、4 月份的水平類似。愛蓮灣海帶養(yǎng)殖海區(qū)低區(qū)3、4 月的氮、磷濃度分別為0.04 mg·L-1和0.002 mg·L-1，已達到限制營養(yǎng)水平[42]，說明本次調查中榮成近岸養(yǎng)殖海區(qū)的營養(yǎng)鹽提前進入了貧瘠狀態(tài)。而且成山和尋山海區(qū)的氮磷比高達94∶1 和27∶1，均高于Redfield比值16∶1[43]，存在不同程度的磷限制，而俚島和瓦屋石海區(qū)氮磷比分別為3.4∶1 和6.3∶1，存在不同程度的氮限制。相關分析中海區(qū)無機氮濃度與海帶色素、可溶性糖、可溶性蛋白等組織成分的含量存在一定的正相關關系。也有研究表明，氮加富會促進氮在色素中的分配，使葉綠素a 和類胡蘿卜素含量增加[39]，因此氮、磷限制會影響海帶組織成分的積累，影響海帶的正常生長。赤潮時浮游藻類的生長繁殖會消耗大量的營養(yǎng)鹽，因此極有可能是赤潮導致了榮成近岸養(yǎng)殖海區(qū)營養(yǎng)鹽濃度的異常偏低，加劇了氮磷的限制和光照強度的變化，引發(fā)了海帶病害。