石蒜堿對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用研究①

徐振宇,盧林俠,吉夫次里,王佩珊,趙 勇,張小萌,李卓爾

(佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

宮頸癌是最常診斷的癌癥之一,同時(shí)也是女性癌癥死亡的常見(jiàn)原因之一[1]。且近年來(lái)發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì),并逐漸向年輕化發(fā)展,嚴(yán)重威脅女性身體健康[2]。同時(shí),由于人口老齡化的加速以及性觀念的改變,宮頸癌的防控形勢(shì)愈加嚴(yán)峻。石蒜堿屬于異喹啉類生物堿,作為傳統(tǒng)的藥用植物,具有抗炎,抗病毒等多種生物活性,且對(duì)多種腫瘤具有較好的抑制作用[3]。體外實(shí)驗(yàn)表明,石蒜堿對(duì)非小細(xì)胞肺癌[4],人結(jié)直腸癌細(xì)胞[5],前列腺癌[6]等都有明顯的抑制作用。然而,石蒜堿對(duì)宮頸癌的作用未見(jiàn)報(bào)道。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活可參與多種腫瘤的病理發(fā)生過(guò)程,腫瘤細(xì)胞在PI3K活化后,通過(guò)激活下游的Akt,對(duì)凋亡的誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受,異常增加細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。在卵巢癌和乳腺癌病理過(guò)程中,可引起腫瘤細(xì)胞的遷移、加速細(xì)胞周期、減少細(xì)胞凋亡。在宮頸癌細(xì)胞中PI3K/AKT可影響其增殖凋亡,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)加入石蒜堿并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定,探討石蒜堿抗宮頸癌HeLa細(xì)胞影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 Hela細(xì)胞

人宮頸癌Hela細(xì)胞由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物及試劑

石蒜堿(成都曼思特生物科技有限公司,HPLC≥98%),采用含有0.1% DMSO的DMEM配置成不同濃度;培養(yǎng)基、血清購(gòu)自Gibco公司; CCK8、BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司; PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、Cleaved Caspase-3、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司;Annexin V-FITC/7AAD凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將Hela接種在96孔板中,待細(xì)胞融合至80%時(shí),換無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓處理24h。按空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組和溶劑對(duì)照組的分組并加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)24h,向每孔中加入CCK8試劑10μL,培養(yǎng)2h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處各孔的光密度(OD)值,以其表示細(xì)胞增殖活性。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率 = (細(xì)胞對(duì)照組OD值-給藥組OD值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)的測(cè)定

將Hela接種到6孔板中,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至密度70%～80%時(shí)更換為無(wú)血清培養(yǎng)液餓處理24h。使用200μL的無(wú)菌槍頭直在細(xì)胞板上均勻劃線造成幾條劃痕。PBS洗滌3次去除劃的細(xì)胞加含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備不同濃度的石蒜堿溶液,將石蒜堿溶液加入劃痕區(qū)域的細(xì)胞中,每個(gè)劃痕組設(shè)置不同濃度的石蒜堿。加入相應(yīng)藥物每隔12h顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕開(kāi)口率并采集圖像。每組設(shè)3復(fù)孔,三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡

從待檢測(cè)的細(xì)胞中抽取樣本,在顯微鏡下觀測(cè)其生長(zhǎng)發(fā)育情況,確保無(wú)環(huán)境污染,細(xì)胞覆蓋率到達(dá)90%之上。然后棄掉舊液,進(jìn)行常規(guī)清洗、消解、離心,吸出上清液,最后加入PBS進(jìn)行細(xì)胞沉積2遍。采取適當(dāng)?shù)膭?dòng)作,以免損害細(xì)胞,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后將500μLBinding Buffer加入細(xì)胞懸液中,輕柔攪拌,然后加入5μL Annexin V和5μL 7-AAD染液,在室溫下避光染色15min,以獲得最佳的染色效果。完成后,1h內(nèi)送流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡。記錄檢測(cè)數(shù)據(jù),計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例,并加以數(shù)據(jù)分析,以便描繪圖形。

1.6 Western blot 法

使用BCA法進(jìn)行蛋白定量,5×上樣緩沖液與樣品蛋白以1:4的比例混勻,100℃煮沸15min。配制電泳膠凝膠后,蛋白樣品上樣、電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉(或5%BSA),37℃水浴搖床封閉1h。TBST洗膜5次,一抗4℃過(guò)夜。使用TBST洗膜5次,每次6min。二抗37℃孵育1h,TBST洗膜5次,每次6min。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)服務(wù)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及處理,多樣本均數(shù)對(duì)比采用單因素方差分析(ANVOA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石蒜堿對(duì)Hela增殖的抑制作用

不同濃度石蒜堿作用Hela細(xì)胞可降低人宮頸癌細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。與對(duì)照組比較石蒜堿作用Hela細(xì)胞24h、48h、72h的細(xì)胞活力從1.25μM開(kāi)始的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 石蒜堿對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

2.2 石蒜堿對(duì)Hela細(xì)胞遷移能力影響

與對(duì)照組組比較,隨著石蒜堿濃度的升高細(xì)胞遷移數(shù)顯著降低(P<0.01)。與此同時(shí),隨著石蒜堿濃度作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞遷移數(shù)也顯著降低,見(jiàn)圖2。

圖2 石蒜堿對(duì)Hela細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 石蒜堿誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡

不同濃度的石蒜堿(0、1.25、2.5μM)作用于人宮頸癌Hela細(xì)胞24h后,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞調(diào)亡率隨著石蒜堿給藥濃度的增加而增加,且呈劑量依賴性關(guān)系,各給藥組細(xì)胞調(diào)亡率與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖3。

圖3 石蒜堿對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

2.4 石蒜堿抗宮頸癌Hela細(xì)胞對(duì)PI3K/Akt通路的影響

不同濃度的石蒜堿(0、1.25、2.5μM)作用于人宮頸癌Hela細(xì)胞24h后,經(jīng)Western Blot檢測(cè),與對(duì)照組相比,隨著石蒜堿濃度的升高,PI3K、AKT蛋白不變,P-PI3K、P-AKT蛋白水平逐漸降低,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3蛋白逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖4。

圖4 石蒜堿對(duì)Hela細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

宮頸癌在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率高居第一位[7]。每年全世界約有46.5萬(wàn)人罹患宮頸癌疾病,我國(guó)新增病例占其中30%,約13.15萬(wàn),死亡數(shù)約為5萬(wàn)。在我國(guó)由于經(jīng)濟(jì)等因素影響,80%的患者確診時(shí)已是浸潤(rùn)癌,而且出現(xiàn)了患病逐漸年輕化的趨勢(shì)[8-9]。宮頸癌中晚期主要以泰素及鉑類的化療作為主要的治療手段,但化療不敏感是導(dǎo)致治療失敗的重要因素,使得宮頸癌的治療處于瓶頸階段。尋找新的治療方法和有效的治療藥物成為宮頸癌研究關(guān)鍵的問(wèn)題之一,從中藥中尋找有效抗癌成分為化療藥物的研究熱點(diǎn)。

石蒜堿(lycorine)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和豐富的藥理活性,是從我國(guó)廣泛分布的草本植物石蒜鱗莖中分離出的一種化學(xué)單體。研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株均顯示良好的抗腫瘤活性[10],且作用機(jī)制與其抗增殖、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用有關(guān)。然而,石蒜堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響卻留有空白,因此本實(shí)驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn),開(kāi)展石蒜堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的研究。本實(shí)驗(yàn)分別在24h、48h、72h檢測(cè)不同濃度的石蒜堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞的活力,發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)現(xiàn)石蒜堿的作用時(shí)間和作用濃度與宮頸癌細(xì)胞的存活率相關(guān)。石蒜堿作用時(shí)間延長(zhǎng)或作用濃度增加可使宮頸癌細(xì)胞增殖率逐漸降低。與此同時(shí),通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了石蒜堿抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移?；谝陨鲜鈮A對(duì)宮頸癌的影響,我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)石蒜堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)隨著石蒜堿濃度的增加,宮頸癌細(xì)胞的凋亡逐漸增強(qiáng)。

由于石蒜堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移都產(chǎn)生了影響,他們共同的上游通路成為我們的研究目標(biāo)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC)中,PI3K/AKT信號(hào)的激活抑制NSCLC的增殖、遷移和侵襲[11];在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中,miR-20a通過(guò)靶向CCND3的水平抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活,抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。因此,PI3K/AKT可對(duì)癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移都可產(chǎn)生影響。在宮頸癌細(xì)胞中,大量研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路可影響宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng):黏蛋白家族基因CDH3通過(guò)激活PI3K/AKT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13];右美托咪定通過(guò)PI3K/AKT對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響[14]。在肝癌細(xì)胞中,石蒜堿也可通過(guò)影響AKT的磷酸化從而對(duì)凋亡產(chǎn)生影響[15]。綜合分析,一方面,PI3K/AKT作為與癌癥發(fā)展相關(guān)的重要通路,在宮頸癌細(xì)胞中也被證實(shí)可發(fā)揮作用;另一方面,石蒜堿也可通過(guò)AKT的磷酸化發(fā)揮抗癌作用,因此我們?cè)噲D研究石蒜堿能否通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。我們采用不同濃度的石蒜堿作用于宮頸癌細(xì)胞24h后,Western Blot檢測(cè)證實(shí)隨著石蒜堿濃度的增加,P-PI3K、P-AKT蛋白水平逐漸降低,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3蛋白逐漸升高,表明石蒜堿可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,石蒜堿可降低宮頸癌Hela細(xì)胞活力,抑制細(xì)胞增殖、遷移并增加細(xì)胞凋亡。石蒜堿抗宮頸癌的功效可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的下調(diào)有關(guān),但其中的下游調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。