電針通過調(diào)控TLR4介導的炎癥信號通路改善糖尿病干眼大鼠角膜炎癥的機制研究△

傅張倚天 萬咪咪 賴思華 孫心怡 李小穎 高衛(wèi)萍

干眼是糖尿病常見的并發(fā)癥,目前研究已明確將糖尿病列為干眼發(fā)生的危險因素之一[1]。糖尿病干眼發(fā)病與炎癥密切相關[2],糖尿病干眼患者眼表的炎癥會導致角膜上皮屏障破壞及角膜神經(jīng)損傷[3-4],造成患者眼部干澀感、燒灼感及異物感等不適癥狀[5]。Toll樣受體4(TLR4)是介導炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)[6],廣泛參與糖尿病及其相關并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展,且在小鼠模型中被證實參與并加速了干眼的發(fā)病[7]。研究表明,電針能通過調(diào)節(jié)TLR4介導的炎癥信號通路,減輕糖尿病大鼠機體的炎癥反應[8],但電針對糖尿病干眼的作用鮮見報道。因此,本研究旨在觀察電針對糖尿病干眼大鼠眼表體征的影響,比較角膜TLR4、磷酸化核因子-κB P65 (P-NF-κB P65)、白細胞介素(IL)-1β及IL-18的表達變化,探討電針能否通過調(diào)控TLR4介導的炎癥信號通路改善糖尿病干眼大鼠角膜的炎癥,為臨床電針治療糖尿病干眼提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠50只,鼠齡7周齡,體質(zhì)量180～240 g,由南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[SCXK(蘇)2019-001]。動物被安置在南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院基礎藥理實驗室,環(huán)境溫度為(21±2)℃,相對濕度為40%～60%,可自由飲水和進食。動物實驗符合國家實驗動物福利倫理的有關規(guī)定,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批號：2022NL-KS093)。

1.1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(STZ;S0130,Sigma公司,美國);TLR4抗體(GB11519,Servicebio公司,中國);IL-18抗體(10663-1-AP,Proteintech公司,中國);P-NF-κB P65(Ser536)抗體(bs-0982R,Bioss公司,中國);IL-1 Beta抗體(AF4006,Affinity公司,中國);β-Tubulin (10094-1-AP,Proteintech公司,中國)。針灸針具(0.18 mm×13.00 mm,蘇州醫(yī)療器械廠,中國);電針儀(華佗牌SDZ-II B型,蘇州醫(yī)療器械廠,中國);Cochet-Bonnet角膜知覺儀(8630-1490-29-Aesthesiometer12/100,Luneau公司,法國)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病干眼模型造模

隨機選取32只大鼠先予高糖高脂飼料(豬油+蔗糖+膽固醇+膽酸鹽+普通飼料,質(zhì)量比例：10.0%20.0%2.5%1.0%66.5%)飼養(yǎng) 4周后開始造模,腹腔注射含10 g·L-1STZ的檸檬酸緩沖液,STZ的劑量為30 mg·kg-1,在15 min內(nèi)注射完畢[9]。注射后第3、7、9、11天相同時間段各測1次,連續(xù)3次隨機血糖測量≥16.7 mmol·L-1,視為2型糖尿病大鼠模型造模成功[10]。然后待大鼠淚液分泌每20 s<7 mm、淚膜破裂時間(BUT)<5 s、角膜熒光素鈉染色(FL)陽性,即認為糖尿病干眼模型成功建立[11]。最終,32只大鼠第12周成功誘導糖尿病干眼模型25只,4只大鼠不能誘導模型,2只大鼠死亡,成功率78%。

1.2.2 干預方法及分組

第12周糖尿病干眼模型成立,將造模成功的糖尿病干眼大鼠隨機分成模型組、電針組、假針刺組、氟米龍組,共4個實驗組,每組6只。另選取6只正常雄性SD大鼠作為空白組,用以對照?？瞻捉M予普通飼料飼養(yǎng),其他4組繼續(xù)予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。模型組不做干預處理。電針組選取大鼠雙側(cè)“睛明”“攢竹”“絲竹空”“太陽”“瞳子髎”針刺,電針接“攢竹”“瞳子髎”,每次15 min,每天1次。電針儀參數(shù)為：疏密波,頻率2 Hz/20 Hz,脈沖寬度0.2 ms,強度1 mA。假針刺組穴位刺激處同電針組,但用鈍頭針點刺治療,不刺入以避免得氣。氟米龍組大鼠雙眼滴1 g·L-1氟米龍滴眼液,分別在每天8點鐘、13點鐘、18點鐘進行干預,每天3次,每次1滴。各組干預時間均為2周。

1.2.3 隨機血糖檢測

分別在造模前、造模后、干預2周后采集大鼠尾尖靜脈全血,利用快速血糖儀檢測隨機血糖濃度。

1.2.4 干眼相關指標檢測

造模前、造模后、干預后各組大鼠均行BUT、FL、淚液分泌實驗(PRT)、角膜機械知覺閾值(CTT)檢測。其中,(1)BUT：生理鹽水濕潤熒光素鈉試紙后輕觸大鼠雙眼下穹隆,使大鼠眨眼數(shù)次,熒光素鈉均勻分布在角膜后睜眼,在手持式裂隙燈下記錄第 1個角膜干燥斑出現(xiàn)的時間。(2)FL：角膜熒光素鈉染色方法同上,在角膜中心做垂直和水平兩條線將角膜劃分為4個象限,手持裂隙燈下觀察每個象限染色情況并評分,4個象限評分相加即為單目熒光染色分數(shù)。每個象限評分標準：無染色記為0分;點狀染色少于30個記為1分;點狀染色超過30個但無融合記為2分;點狀染色超過30個且融合成片記為3分。(3)PRT：將酚紅棉線末端向后折疊,將其放置于大鼠下眼瞼穹隆部的外1/3處,輔助大鼠閉眼并保持20 s,取出線,測量淚液浸濕酚紅后浸入線上的長度。(4)CTT：使用Cochet-Bonnet角膜知覺儀測量,將尼龍線調(diào)節(jié)至60 mm,尖端垂直輕觸大鼠角膜的中心區(qū)域,進行3次重復刺激,如果有2次觸發(fā)眨眼反射,則尼龍線的長度代表大鼠角膜機械知覺閾值。如果大鼠眨眼反射不滿足上述條件,則將尼龍線依次遞減5 mm,重復上述操作,直到滿足條件為止。

1.2.5 HE染色觀察大鼠角膜上皮細胞變化

干預2周后,各組大鼠均隨機取3只吸入異氟烷(2 L·min-1)深度麻醉后,用40 g·L-1多聚甲醛灌注,取大鼠左眼角膜組織,進行石蠟包埋、切片。將切片置于載玻片后60 ℃烘烤,待水干后室溫放置 30 min,進行HE染色,光學顯微鏡觀察角膜組織形態(tài)學的變化。

1.2.6 免疫熒光組織化學染色法觀察大鼠角膜組織中TLR4的表達

取1.2.5中灌流固定后的大鼠右眼角膜組織,進行石蠟包埋、切片。脫蠟后用 PBS 液洗滌,羊血清封閉,TLR4抗體(1500)4 ℃孵育過夜,Cy3標記山羊抗兔抗體(1600)室溫孵育1 h。切片取出,組織染核后洗滌,用熒光淬滅密封劑密封。在熒光顯微鏡下觀察、拍照。觀察各組大鼠角膜組織中TLR4的表達。

1.2.7 Western blot檢測大鼠角膜組織中TLR4、P-NF-κB、IL-1β及IL-18的表達

干預2周后,各組剩余3只大鼠吸入異氟烷(2 L·min-1)深度麻醉,斷頸處死,即刻取出大鼠左眼角膜組織,-80 ℃保存?zhèn)溆?。取角膜組織,提取蛋白、測定蛋白濃度;制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,用50 g·L-1的BSA封閉1 h;加入TLR4(11 000)、IL-18(15 000)、IL-1β(11 000)、P-NF-κB p65(11 000)及β-Tubulin(110 000)抗體4 ℃孵育過夜;加入山羊抗兔抗體(13 000)或山羊抗鼠抗體(13 000)室溫孵育1 h,洗膜后加ECL顯影、定影。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析,計算出目的蛋白條帶相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠隨機血糖檢測結(jié)果

造模前,各組大鼠隨機血糖比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。造模后及干預后,各實驗組大鼠與空白組大鼠相比,隨機血糖均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)(表1)。

表1 各組大鼠造模前、造模后及干預后大鼠隨機血糖比較

2.2 各組大鼠干眼相關指標檢測結(jié)果

干眼相關指標檢測結(jié)果顯示,造模后,與空白組比較,各實驗組大鼠BUT、淚液分泌量、CTT均下降,FL評分均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01);干預后,模型組大鼠FL評分、BUT、淚液分泌量、CTT分別為(8.17±2.79)分、(3.17±1.17) s、(4.00±1.26) mm、(20.83±5.85) mm。與模型組比較,電針組大鼠FL評分[(4.00±1.41)分]降低,BUT[(5.50±1.05)s]、淚液分泌量[(9.33±1.51)mm]及CTT[(34.17±5.85)mm]均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);干預后,氟米龍組大鼠淚液分泌量為(6.33±1.63)mm,CTT為(25.00±6.32)mm,與氟米龍組比較,電針組大鼠淚液分泌量及CTT均升高,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠角膜HE染色結(jié)果

角膜HE染色顯示,模型組和假針刺組大鼠角膜表面不光滑,角膜上皮細胞增厚且排列紊亂;電針組及氟米龍組大鼠角膜表面光滑,角膜上皮細胞排列整齊(圖1)。

圖1 各組大鼠干預2周后角膜HE染色結(jié)果

2.4 各組大鼠角膜TLR4陽性表達熒光強度比較

干預后,各組大鼠角膜TLR4陽性表達平均熒光強度結(jié)果顯示(圖2),與空白組(83.0±4.1)比較,各實驗組大鼠角膜TLR4表達均升高(模型組：139.2±7.2,電針組：103.2±13.0,假針刺組：139.2±5.5,氟米龍組：105.4±14.6),差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與模型組比較,電針組及氟米龍組大鼠角膜TLR4表達均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01。圖2 各組大鼠干預2周后角膜TLR4陽性表達平均熒光強度比較

2.5 各組大鼠角膜TLR4、P-NF-κB P65、IL-1β和IL-18 Western blot檢測結(jié)果比較

干預后,與空白組(TLR4：0.8±0.2,P-NF-κB P65：0.7±0.1,IL-1β：0.5±0.3,IL-18：0.2±0.1)比較,模型組與假針刺組大鼠角膜TLR4(1.2±0.1,1.2±0.2)、P-NF-κB P65(1.3±0.1,1.2±0.1)、IL-1β(1.0±0.2,0.9±0.1)及IL-18(1.0±0.1,0.8±0.1)蛋白表達均增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05);與模型組比較,電針組與氟米龍組角膜TLR4(0.9±0.1,0.8±0.1)、P-NF-κB P65(0.8±0.1,0.7±0.1)、IL-1β(0.5±0.2,0.5±0.2)和IL-18(0.3±0.1,0.4±0.2)蛋白表達均降低,差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(圖3)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與電針組比較,△P<0.05,△△P<0.01。圖3 各組大鼠干預2周后角膜TLR4、P-NF-κB P65、IL-1β和IL-18蛋白表達

3 討論

炎癥是糖尿病干眼的重要發(fā)病機制。高血糖、晚期糖基化終未產(chǎn)物積累、氧化應激及NF-κB信號通路的激活會引起持續(xù)的促炎反應,持續(xù)的炎癥反應會損傷眼表組織和影響淚膜穩(wěn)態(tài)[12-13]。角膜上皮損傷是糖尿病干眼炎癥的主要病理特征之一,炎癥常導致角膜上皮細胞的減少及角膜神經(jīng)損傷[14]。角膜神經(jīng)損傷會降低角膜敏感性,導致眨眼頻率降低,淚液蒸發(fā)過快從而加重干眼[15]。此外,高血糖會導致淚膜高滲,角膜結(jié)構(gòu)(包括角膜上皮和角膜緣)暴露于淚膜高滲環(huán)境會導致一連串的炎癥反應,進一步加重眼表炎癥[16]。因此,抑制角膜的炎癥反應對于治療糖尿病干眼至關重要。

TLR4能介導慢性炎癥性疾病,是預防和控制糖尿病及相關并發(fā)癥的新興靶點之一[17]。NF-κB作為TLR4的下游效應因子,是眼表炎癥和疾病的重要樞紐,可介導多種炎癥過程并促進細胞炎癥基因的表達[18]。在葡萄糖水平高的部位,TLR4會在細胞表面表達上調(diào),與髓樣分化因子(MyD88)結(jié)合,刺激下游 NF-κB 磷酸化,并促進其核轉(zhuǎn)移,隨后促炎細胞因子和趨化因子(如IL-1β、IL-18等)表達上調(diào),從而產(chǎn)生炎癥反應[19-20]。

目前臨床上常用于糖尿病干眼的滴眼液有人工淚液與類固醇激素滴眼液[21]。人工淚液沒有直接的抗炎作用,治標不治本;類固醇激素滴眼液長期使用后,會產(chǎn)生眼壓升高、白內(nèi)障等不良反應[22-23]。因此,針對糖尿病干眼需要探尋有效且安全的治療策略。

中醫(yī)學中,糖尿病干眼歸屬于“白澀病”“消渴癥”的范疇 。糖尿病干眼病位在目,多因肺、脾、肝、腎各臟腑陰虛化火,上攻于目,津液虧損所致[24]。針刺可促進經(jīng)絡循環(huán),緩解眼表炎癥,提高淚液分泌,從而達到持久療效[25-26]。本實驗選取“睛明”“攢竹”“絲竹空”“太陽”“瞳子髎”等眼周穴位進行研究干預。睛明穴作為五脈交會穴,與絲竹空穴及攢竹穴配伍使用,可加強清熱明目之功;太陽穴作為經(jīng)外奇穴之一,可與瞳子髎穴共同主治眼目疾患。諸穴合用,可達到滋陰清熱,活絡明目的效果。

本研究成功建立2型糖尿病干眼大鼠模型,并觀察了電針對其的治療作用。本研究結(jié)果顯示,電針能提高2型糖尿病干眼大鼠的BUT、CTT及淚液分泌量,同時顯著降低其FL評分。干預后,與氟米龍組相比,電針組大鼠CTT、淚液分泌量均增加,提示電針改善糖尿病干眼大鼠的角膜知覺與促進淚液分泌的效果可能優(yōu)于氟米龍,體現(xiàn)出電針治療糖尿病干眼的優(yōu)勢。此外,免疫熒光組織化學染色法和Western blot檢測結(jié)果表明,電針能降低糖尿病干眼大鼠角膜中TLR4、P-NF-κB、IL-1β及IL-18的表達,說明電針能有效改善糖尿病干眼大鼠眼表的炎癥。

4 結(jié)論

電針可以改善2型糖尿病干眼大鼠的眼表體征,并抑制角膜中TLR4、P-NF-κB P65、IL-1β及IL-18的表達,其作用機制可能與電針調(diào)控TLR4介導的炎癥信號通路,從而抑制糖尿病干眼大鼠眼表炎癥相關。電針可能是未來治療糖尿病干眼有效且安全的策略,本實驗不足之處在于未使用TLR4的拮抗劑和激動劑,電針對TLR4介導的炎癥信號通路的調(diào)控作用還需進一步探索與證實。