韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺和咯菌腈抗性評(píng)價(jià)及抗性菌株適合度分析

張艷麗，陳 娟，張藝瀟，陳燕玲

（1.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢驗(yàn)檢測(cè)中心 甘肅平?jīng)?744000； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州 730000）

韭菜是我國(guó)栽培區(qū)域最廣泛的蔬菜之一。近年來(lái)，在韭菜種植過(guò)程中灰霉病時(shí)常發(fā)生，成為影響韭菜安全生產(chǎn)的重要因素之一。韭菜灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的一種病害[1]，直接影響韭菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。防治韭菜灰霉病的登記農(nóng)藥有腐霉利、嘧霉胺和咯菌腈3 種。腐霉利作為二甲酰亞胺類(lèi)殺菌劑在我國(guó)有20～30 年的使用歷史，已表現(xiàn)出灰霉病菌對(duì)腐霉利的敏感性下降[2]，且腐霉利在蔬菜中檢出的農(nóng)藥殘留頻率最高[3-4]。研究表明，其他蔬菜上灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗性頻率已達(dá)到43.64%[5]，不同地區(qū)灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗性水平有差異，但其抗性菌株的適合度鮮有報(bào)道?？┚鎸?duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)有較高的抑制作用，在國(guó)內(nèi)已有灰霉病病菌對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性的報(bào)道[6]。陳淑寧等[7]研究表明，在咯菌腈藥劑條件下，灰霉病菌敏感菌株可以在競(jìng)爭(zhēng)中淘汰掉多重抗性菌株。目前在甘肅省內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺和咯菌腈抗藥性的報(bào)道，且GB 2763-2021[8]中還未規(guī)定嘧霉胺在韭菜中的最大殘留限量值。為此，筆者通過(guò)對(duì)甘肅省7 個(gè)地州市（張掖、武威、隴南、慶陽(yáng)、平?jīng)?、蘭州、白銀）的韭菜灰霉病菌進(jìn)行分離及敏感性檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，以期研究抗性菌株的適合度，用于指導(dǎo)甘肅省境內(nèi)田間韭菜種植的科學(xué)用藥和殺菌劑抗性管理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

99.9%嘧霉胺、咯菌腈原液1000 μg·mL-1，由北京萊鉑銳科技有限公司提供。嘧霉胺、咯菌腈原液用丙酮配制成100 μg·mL-1母液，冰箱冷藏保存。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[9]用于韭菜灰霉病菌對(duì)咯菌腈的敏感性測(cè)定；L-asp 培養(yǎng)基[10]用于韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的敏感性測(cè)定。

試驗(yàn)于2020 年3-11 月在甘肅省隴中（蘭州、白銀），隴東（慶陽(yáng)、平?jīng)鍪校]南和河西（張掖、武威市）等7 個(gè)市的設(shè)施大棚內(nèi)開(kāi)展。采集韭菜灰霉病病葉，采用何烈干等[11]的方法純化分離菌株，得到54 株菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[12]，所有菌株在4 ℃下保存。菌株命名以“采樣市州+序列號(hào)”表示。

1.2 敏感基線建立及抗性水平測(cè)定

采用抗藥性鑒定MIC 法（最低抑制濃度法），在分離出的54 株灰霉病菌菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，分別接種至含系列濃度的嘧霉胺和咯菌腈的L-asp、PDA 培養(yǎng)基上，每處理3 次重復(fù)。在25 ℃培養(yǎng)12 d 后，不能或幾乎不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的藥劑濃度為嘧霉胺和咯菌腈對(duì)韭菜灰霉病菌的最低抑制濃度，以此劃分敏感菌株和抗性菌株。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[11]分別測(cè)定韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺、咯菌腈的敏感性，對(duì)嘧霉胺敏感菌株濃度（ρ）設(shè)定分別為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 μg·mL-1，抗性菌株濃度設(shè)定分別為1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 μg·mL-1；咯菌腈濃度設(shè)定分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 μg·mL-1。以不加藥劑作為對(duì)照，將打取的菌餅（5 mm）接種于平板培養(yǎng)基上，每處理3 次重復(fù)，在25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，利用Graphpad prism 5.0 軟件處理后得出EC50值。

分別選取嘧霉胺壓力下32 株和咯菌腈壓力下54 株菌株EC50值進(jìn)行正態(tài)分布驗(yàn)證，以符合該正態(tài)分布所有菌株的平均EC50值為敏感基線，作為比較抗性有無(wú)和抗性水平高低的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)抗性菌株與敏感基線EC50的比值確定抗性倍數(shù)[13]，1≤抗性倍數(shù)≤5 時(shí)，為低抗菌株（LR）；5＜抗性倍數(shù)≤10 時(shí)，為中抗菌株；抗性倍數(shù)＞10 時(shí)，為高抗菌株。

1.3 抗性菌株穩(wěn)定性測(cè)定

在嘧霉胺壓力下，挑選菌株P(guān)L-2（低抗）、BY-6（中抗）和LZ-3（高抗）；在咯菌腈壓力下選取菌株QY-6（低抗菌株）分別在L-asp 和PDA 無(wú)藥培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8 次后，分別測(cè)定第2、4、6、8 代菌株對(duì)藥劑的敏感性，比較繼代前后菌株間抗藥性水平（EC50）差異。

1.4 抗性菌株適合度測(cè)定

1.4.1 抗/敏菌株菌絲生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量的測(cè)定選取菌株ZY-3、PL-2、BY-6、LZ-3 和PL-4、QY-6，在其菌落邊緣打取直徑5 mm 菌餅，分別接種于L-asp、PDA 平板上，在25 ℃下培養(yǎng)，分別測(cè)量生長(zhǎng)12、24、48、72 和96 h 后的菌落直徑，計(jì)算菌株生長(zhǎng)速率。將上述菌株繼續(xù)培養(yǎng)10 d 后，用10 mL 無(wú)菌水沖洗孢子，尼龍紗布過(guò)濾，定容后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每個(gè)菌株3 次重復(fù)。

1.4.2 抗/敏菌株致病性測(cè)定 采用任璐等[14]的方法。將采集到的同葉位韭菜葉清洗消毒后，制成3 cm 的葉盤(pán)。分別配置嘧霉胺、咯菌腈最低抑制濃度溶液，將葉盤(pán)浸入藥液2 min 后，晾干，以浸入無(wú)菌水為對(duì)照；將1.4.1 中制備的孢子液稀釋至1×104個(gè)·mL-1，均勻噴灑于葉盤(pán)，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿4 片，每處理3 次重復(fù)，用透明坐標(biāo)紙統(tǒng)計(jì)葉盤(pán)發(fā)病面積，按公式（1）計(jì)算發(fā)病率。

1.4.3 抗/敏菌株分生孢子競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定 參照史曉晶等[15]的方法，對(duì)嘧霉胺和咯菌腈的敏感菌株與抗性菌株孢子液按體積比1∶1 配置成不同的組合：Cp1 為ZY-3+PL-2，Cp2 為ZY-3+BY-6，Cp3 為ZY-3+LZ-3，Cf4 為PL-4+QY-6。將孢子混合液用毛筆涂抹于無(wú)菌韭菜葉片上，在25 ℃培養(yǎng)，發(fā)病后打取1 cm 病斑葉片懸浮于嘧霉胺、咯菌腈最低抑制濃度溶液中繼續(xù)培養(yǎng)，記錄病斑數(shù)量并觀察病斑是否擴(kuò)大，每個(gè)處理檢測(cè)病斑數(shù)50 個(gè)。按公式（2）計(jì)算抗性突變體頻率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與表格繪制；采用Graphpad prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，數(shù)值采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感基線建立及抗性水平測(cè)定

所測(cè)嘧霉胺、咯菌腈最低抑制濃度（MIC）分別為4.80、0.15 μg·mL-1。54 株菌株對(duì)嘧霉胺和咯菌腈的EC50值變化范圍分別為0.280～6.280 μg·mL-1、0.019 2～0.146 0 μg·mL-1。采用Graphpad prism 5.0軟件通過(guò)KS normailty 驗(yàn)證，其中32 株菌株對(duì)嘧霉胺和54 株菌株對(duì)咯菌腈敏感性（EC50）均符合正態(tài)分布（p＞0.01）（圖1），因此可將這32 株灰霉病菌株對(duì)嘧霉胺的平均EC50值（0.407 7±0.401 7）和54 株灰霉病菌株對(duì)咯菌腈的平均EC50值（0.085 9±0.312 1）作為敏感基線。

圖1 甘肅韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺和咯菌腈的敏感性Fig.1 Sensitivity to pyrimethanil and fludioxonil of Chinese chive gray mold in Gansu province

由表1 可知，采集的54 株韭菜灰霉病菌株，有19 株對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗性，抗性頻率為35.2%。各地區(qū)均已出現(xiàn)不同抗性的菌株，高抗菌株出現(xiàn)在隴中（蘭州、白銀）和河西（武威）地區(qū)，隴南地區(qū)抗性菌株均為低抗菌株。54 株灰霉病菌中僅有5 株對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性，均為低抗菌株，抗性頻率為9.3%（表2）。

表1 甘肅各地韭菜灰霉病菌抗嘧霉胺分布Table 1 Distribution of pyrimethanil in chinese chiv gray mold in Gansu province

表2 甘肅各地韭菜灰霉病菌抗咯菌腈分布Table 2 Distribution of fludioxonil in chinese chiv gray mold in Gansu province

2.2 抗性菌株遺傳穩(wěn)定性

對(duì)嘧霉胺和咯菌腈的不同抗性菌株在連續(xù)轉(zhuǎn)接8 代后，各EC50值通過(guò)Graphpad Prism 5.0 系統(tǒng)t檢測(cè)分析（圖2）。在嘧霉胺壓力下，菌株BY-6 和LZ-3 轉(zhuǎn)代后的EC50與轉(zhuǎn)代前相比差異不顯著；菌株P(guān)L-2 轉(zhuǎn)接第6 代的EC50與轉(zhuǎn)代前比較差異顯著，且第8 代與第6 代差異顯著。在咯菌腈壓力下，菌株QY-6 轉(zhuǎn)代前后的EC50無(wú)顯著差異。

圖2 韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺及咯菌腈抗性遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of resistance to pyrimethanil and fludioxonil in Chinese chive gray mold

2.3 抗性菌株適合度測(cè)定

2.3.1 抗/敏菌株菌絲生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量的測(cè)定由表3 可見(jiàn)，對(duì)嘧霉胺敏感性而言，不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速率有所差異，敏感菌株ZY-3 的生長(zhǎng)速率最快，抗性菌株P(guān)L-2 和BY-6 的生長(zhǎng)速率顯著高于LZ-3；在產(chǎn)孢量方面，LZ-3 和BY-6 間無(wú)顯著性差異，但LZ-3 顯著高于ZY-3 和PL-2，BY-6 顯著高于ZY-3。對(duì)咯菌腈敏感性而言，敏感菌株P(guān)L-4 和抗性菌株QY-6 的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異，但產(chǎn)孢量PL-4 顯著高于QY-6。

表3 抗/敏菌株的生長(zhǎng)速率及產(chǎn)孢量Table 3 The growth rate and spore production of resistant and sensitive strains

2.3.2 抗/敏菌株致病性測(cè)定 由圖3 可知，在無(wú)嘧霉胺藥劑處理的葉盤(pán)上，各抗性菌株的發(fā)病率均顯著低于敏感菌株ZY-3，菌株發(fā)病率從高到低依次為：ZY-3＞PL-2＞BY-6＞LZ-3；在嘧霉胺處理的葉盤(pán)上，各抗性菌株發(fā)病率均顯著高于敏感菌株ZY-3，其中菌株P(guān)L-2 發(fā)病率顯著低于BY-6 和LZ-3。在無(wú)咯菌腈藥劑處理的葉盤(pán)上，低抗菌株QY-6 的發(fā)病率顯著低于敏感菌株P(guān)L-4，在咯菌腈處理的葉盤(pán)上兩者的發(fā)病率無(wú)顯著差異。

圖3 抗/敏菌株發(fā)病率Fig.3 Pathogenic frequency of resistant and sensitive strains

2.3.3 抗/敏菌株分生孢子競(jìng)爭(zhēng)力測(cè)定 由圖4 可知，組合Cp1、Cp2、Cp3 及Cf4 中，敏感菌株侵染所致的病斑頻率均高于抗性菌株，說(shuō)明敏感菌株孢子競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)于抗性菌株。在組合Cp1～Cp3 間，組合Cp3 中的抗性菌株孢子競(jìng)爭(zhēng)力最大。在組合Cf4中，抗性菌株孢子競(jìng)爭(zhēng)力達(dá)到了48%，幾乎與敏感菌株持平。

圖4 抗/敏菌株孢子競(jìng)爭(zhēng)力Fig.4 Spore competitiveness between resistant and sensitive isolate

3 討論與結(jié)論

在甘肅省境內(nèi)采集分離得到的54 株韭菜灰霉病菌，對(duì)嘧霉胺的抗性表現(xiàn)為中抗、高抗水平，且具有地域性特點(diǎn)，高抗菌株出現(xiàn)在隴中（蘭州、白銀）和河西地區(qū)（武威），隴東地區(qū)（慶陽(yáng)、平?jīng)觯┮灾?、低抗菌株為主，隴南均為低抗菌株。甘肅省境內(nèi)韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的敏感性處于下降趨勢(shì)，這與賈曉華[10]、Shattock[16]、紀(jì)明山等[17]研究結(jié)果相符。嘧霉胺屬于苯氨基嘧啶類(lèi)殺菌劑，但是苯氨基嘧啶類(lèi)殺菌劑作用靶點(diǎn)單一，容易產(chǎn)生抗藥性[17]，在農(nóng)藥壓力選擇下，中、高抗菌株將占據(jù)有利的選擇優(yōu)勢(shì)，逐漸成為主導(dǎo)菌株，不利于韭菜灰霉病菌的防治。采集的5 株韭菜灰霉病菌經(jīng)檢測(cè)對(duì)咯菌腈產(chǎn)生了低抗藥性，與普繼雄等[3]研究一致。相關(guān)研究表明，灰霉病菌對(duì)咯菌腈抗性適合度低于野生菌株，優(yōu)勢(shì)種群不易形成[18-19]，這也可能是抗性菌株比率較低的原因。對(duì)不同抗性菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)8 次后，低抗菌株對(duì)嘧霉胺的敏感性差異顯著，有向敏感菌株轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)；中、高抗菌株敏感性無(wú)顯著變化，抗性水平可穩(wěn)定遺傳。韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生低抗藥性初期，應(yīng)加強(qiáng)田間菌株敏感性動(dòng)態(tài)變化及抗藥性監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握其抗性水平的動(dòng)態(tài)變化，適時(shí)調(diào)整用藥策略，可避免抗性菌株向中、高抗性發(fā)展。對(duì)咯菌腈產(chǎn)生低抗藥性的菌株轉(zhuǎn)接8 代后抗性水平可穩(wěn)定遺傳。

在抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、繁殖能力、抗性菌株致病性等適合度參數(shù)是評(píng)價(jià)抗性風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)，特別是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和繁殖能力，能夠快速生長(zhǎng)繁殖就意味著適合度更高[20]。當(dāng)韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺和咯菌腈產(chǎn)生抗性后，抗性菌株適合度的群體變化會(huì)在田間有所體現(xiàn)。通過(guò)對(duì)適合度研究，表明對(duì)嘧霉胺、咯菌腈產(chǎn)生抗性的菌株其菌絲生長(zhǎng)速率均低于其敏感菌株，但是產(chǎn)孢量卻高于敏感菌株，這與史曉晶等[15]研究結(jié)果一致。任璐等[14]的研究表明，在相同生長(zhǎng)環(huán)境中，抗性菌株菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、致病力等適合度指標(biāo)均低于敏感菌株，筆者的研究在產(chǎn)孢量方面與其不一致。有研究表明，適合度與環(huán)境條件有密切關(guān)系[21]，這可能是因?yàn)槭覂?nèi)培養(yǎng)為抗性菌株提供了充足養(yǎng)分、適宜溫度等條件，有利于抗性菌株孢子產(chǎn)生，因此特定環(huán)境對(duì)適和度的影響還有待進(jìn)一步研究。對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗性的菌株，環(huán)境適合度下降，特別是中、高抗菌株，適合度顯著低于低抗菌株，與敏感菌株不具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，在田間不易形成優(yōu)勢(shì)群體。對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性的低抗菌株致病性低于敏感菌株，但是孢子競(jìng)爭(zhēng)力幾乎與敏感菌株保持相當(dāng)水平。這表明對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性的低抗菌株有一定的生存能力，有必要重視可能發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌群的風(fēng)險(xiǎn)。

甘肅省部分區(qū)域韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺已經(jīng)產(chǎn)生了中、高水平抗藥性，但是抗性菌株適合度指標(biāo)均下降，生存能力下降，在與敏感群體生存競(jìng)爭(zhēng)中不占優(yōu)勢(shì)。韭菜灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性水平較低，但低抗菌株表現(xiàn)一定的適合度，生產(chǎn)中應(yīng)避免單一使用該藥劑，防止抗性菌株成為田間優(yōu)勢(shì)菌群。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)田間抗性監(jiān)測(cè)，根據(jù)不同區(qū)域韭菜灰霉病菌對(duì)藥劑的抗性水平，科學(xué)制定防治策略以期達(dá)到緩解韭菜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺和咯菌腈的抗藥性壓力，有望延長(zhǎng)此類(lèi)藥劑的使用年限。