不同液體培養(yǎng)基質(zhì)與模式對(duì)星孢寄生菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響

彭澤琴，唐榮平，周會(huì)明，王 婷，肖龍濱，王 穎，朱遠(yuǎn)愛(ài)，崔羽彤，李賢林

（滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院 云南臨滄 677000）

星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）是一種兼有寄生與腐生營(yíng)養(yǎng)方式的寄生菇屬（Asterophora）真菌，既寄生于紅菇屬真菌黑菇（Russula adusta）、稀褶黑菇（R.nigricans）、密褶黑菇（R.densifolia）等變黑且腐爛的子實(shí)體菌蓋中央、菌褶及菌柄之上并擁有擔(dān)孢子與厚垣孢子兩大孢子體系，又在人工培養(yǎng)基上比普通菇類(lèi)更容易栽培出菇[1-2]。營(yíng)養(yǎng)生理是眾多野生珍稀菇類(lèi)人工馴化解決的首要問(wèn)題，個(gè)體發(fā)育是菇類(lèi)營(yíng)養(yǎng)生理在菌體轉(zhuǎn)化與形態(tài)發(fā)生不同階段的直觀體現(xiàn)，獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)方式又是菇類(lèi)基于遺傳特性對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)脅迫的一種生存適應(yīng)性，因此，獨(dú)特的星孢寄生菇是研究擔(dān)子菌個(gè)體發(fā)育的理想材料，探究營(yíng)養(yǎng)因子變化對(duì)其個(gè)體發(fā)育的影響，有助于弄清該菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及其與基質(zhì)的關(guān)系，同時(shí)也為弄清其他腐生與寄生野生菇類(lèi)營(yíng)養(yǎng)需求機(jī)制提供有利的理論參考。

目前，針對(duì)星孢寄生菇的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[3]、形態(tài)學(xué)分類(lèi)[4]、親緣關(guān)系分析[5]等研究報(bào)道居多，而有關(guān)營(yíng)養(yǎng)生理的研究比較滯后。王建東等[6]采用固體基質(zhì)培養(yǎng)法對(duì)其基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳氮源、pH 以及溫度僅進(jìn)行了初步試驗(yàn)，然而，目前諸多野生菇類(lèi)生長(zhǎng)環(huán)境遭到人為破壞[7]且未受到有效保護(hù)與利用[8]，菇類(lèi)個(gè)體發(fā)育因缺乏合適的材料已成為食用菌領(lǐng)域研究的難點(diǎn)[9]，且受外界條件[10-14]與內(nèi)在因素[15-16]的影響極為顯著。因此，針對(duì)星孢寄生菇個(gè)體發(fā)育與營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)關(guān)系的研究，尋找影響菇體馴化出菇的營(yíng)養(yǎng)障礙，對(duì)開(kāi)發(fā)其他珍稀菇類(lèi)有重要的參考意義。

菇類(lèi)的個(gè)體發(fā)育過(guò)程受營(yíng)養(yǎng)條件影響較大[17-19]。液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)更容易觀察和測(cè)定菇類(lèi)菌絲體的生長(zhǎng)變化情況。筆者基于星孢寄生菇容易培養(yǎng)出菇的特性，采用液體搖動(dòng)與靜置培養(yǎng)相結(jié)合的方法，分析了營(yíng)養(yǎng)變化對(duì)該菇整個(gè)生活史中菌絲生長(zhǎng)期、子實(shí)體形成期、厚垣孢子形成期3 個(gè)重要時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的影響，以期為其他珍稀大型真菌的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 星孢寄生菇保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，菌株編號(hào)：YAASM4665。新鮮的水葫蘆采集于滇西科技師范學(xué)院人工湖，靈芝、荷葉離褶傘、香菇由食用菌課題組提供新鮮完整子實(shí)體和靈芝菌糠，剩余添加材料均購(gòu)買(mǎi)于云南省臨滄市批發(fā)市場(chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、水1 L，pH 自然）為對(duì)照配方1，添加經(jīng)200 目篩且80 ℃下烘干處理的水葫蘆（配方2）、木屑（配方3）、棉籽殼（配方4）、雞糞（配方5）、黑豆（配方6）、菌糠（配方7）、靈芝（配方8）、荷葉離褶傘（配方9）、香菇（配方10）、野生香菇（配方11）、灰肉紅菇（配方12）的超細(xì)粉各3 g 依次制備成液體培養(yǎng)基配方，取100 mL 培養(yǎng)液分裝于250 mL 的三角瓶中，每處理9 次重復(fù)，采用封口膜及4 層報(bào)紙封口，121 ℃下滅菌30 min，冷卻至30 ℃左右接種。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與接菌 試驗(yàn)于2022 年5 月在滇西科技師范學(xué)院食用菌實(shí)訓(xùn)室內(nèi)進(jìn)行。將該菇母種在室溫下培養(yǎng)6 d，然后接種于PSA（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1 L，pH 自然）培養(yǎng)基平板中，于25 ℃下培養(yǎng)7 d。在無(wú)菌操作下取5 塊直徑5 mm 的同心圓菌落接入上述液體培養(yǎng)基內(nèi)[20]并將搖瓶置于搖床內(nèi)在25 ℃下靜置培養(yǎng)。

1.2.2 液體搖動(dòng)培養(yǎng) 搖瓶靜置培養(yǎng)24 h 后，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速，在150 r·min-1下進(jìn)行搖動(dòng)培養(yǎng)，記錄菌絲萌發(fā)和菌球形成的時(shí)間（d）。培養(yǎng)12 d 后，每組隨機(jī)選取3 個(gè)搖瓶，測(cè)定菌絲形成期培養(yǎng)液的體積（mL）、pH、顏色、氣味，菌球顏色、形狀、氣味、數(shù)量（個(gè)·mL-1）、直徑（mm）及生長(zhǎng)速度（mm·d-1）。將菌球（培養(yǎng)液經(jīng)5 層紗布過(guò)濾）在80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，然后稱(chēng)質(zhì)量即菌球生物量（mg·mL-1）[21]。菌球形成率/%=菌球干質(zhì)量/基質(zhì)干質(zhì)量×100。

1.2.3 液體靜置培養(yǎng) 在培養(yǎng)物經(jīng)搖動(dòng)培養(yǎng)12 d后轉(zhuǎn)為靜置培養(yǎng)，記錄其表面原基、菌膜、菇蕾、幼菇、厚垣孢子初期（第一朵子實(shí)體出現(xiàn)厚垣孢子）、厚垣孢子中期（超過(guò)1/2 的子實(shí)體出現(xiàn)厚垣孢子）、厚垣孢子后期（全部子實(shí)體出現(xiàn)厚垣孢子）形成時(shí)間（d）。當(dāng)菌液表面出現(xiàn)10～25 個(gè)子實(shí)體時(shí)，隨機(jī)選取3 瓶培養(yǎng)物，測(cè)定子實(shí)體形成期上述各項(xiàng)參數(shù)，菌膜與子實(shí)體生物量的測(cè)定方法與菌球生物量相同，生物量=菌球生物量+菌膜生物量+子實(shí)體生物量，絕對(duì)生物學(xué)效率/%=子實(shí)體鮮質(zhì)量/基質(zhì)干質(zhì)量×100。當(dāng)培養(yǎng)物表面所有子實(shí)體均出現(xiàn)厚垣孢子時(shí)為厚垣孢子形成期，測(cè)定參數(shù)同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇個(gè)體發(fā)育的影響

由圖1 可知，不同基質(zhì)對(duì)該菇3 個(gè)發(fā)育時(shí)期的培養(yǎng)液色澤、菌球、菌膜等生長(zhǎng)特征、周期、顏色及氣味影響較大。添加棉籽殼、黑豆、香菇以及灰肉紅菇的基質(zhì)上該菇子實(shí)體發(fā)育正常，其余基質(zhì)上均出現(xiàn)不同程度的畸形菇，以木屑與荷葉離褶傘基質(zhì)畸形菇最為嚴(yán)重。培養(yǎng)液多為淡黃色、腐木味或菇香味；菌球以枯茶色、腐木味、球形略多，但添加木屑、棉籽殼、菌糠的基質(zhì)中菌球?yàn)闄E球形；菌膜在子實(shí)體形成期主要為亞麻色與淡黃色，厚垣孢子形成期以香色、亞麻色及練色為主，添加黑豆的基質(zhì)上為淡黃色，添加荷葉離褶傘與野生香菇的基質(zhì)上為亞麻色，添加菇類(lèi)的基質(zhì)上以亞麻色居多；子實(shí)體在其形成期以灰白色、菇香味為主，少數(shù)為白色、無(wú)味；厚垣孢子形成期以肌色為主，部分乳白色、灰白色及象牙色，菇香味，添加黑豆的基質(zhì)上為灰白色，越到后期其菇香味越明顯。

圖1 不同基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇發(fā)育特征的影響Fig.1 Effects of different matrix on the developmental characteristics of Asterophora lycoperdoides

液體搖動(dòng)培養(yǎng)階段，與對(duì)照相比，除添加木屑的基質(zhì)不利于該菇菌絲萌發(fā)（3 d）和菌球形成（5 d）外，在其他基質(zhì)上菌絲萌發(fā)（2 d）和菌球形成（3 d）的時(shí)間相同（圖2）。液體靜置培養(yǎng)階段，該菇在不同基質(zhì)上從原基形成至所有子實(shí)體上出現(xiàn)厚垣孢子的周期由長(zhǎng)至短依次為添加雞糞、黑豆、灰肉紅菇、棉籽殼、菌糠、水葫蘆、對(duì)照、荷葉離褶傘、野生香菇、香菇、靈芝、木屑的基質(zhì)。與對(duì)照相比，添加木屑的基質(zhì)最有利于縮短原基、菌膜、菇蕾等農(nóng)藝性狀的形成時(shí)間，尤其是所有子實(shí)體上布滿厚垣孢子的周期最短（14 d），其次是靈芝、香菇、野生香菇基質(zhì)，而添加雞糞的基質(zhì)上，該菇上述農(nóng)藝性狀的形成時(shí)間最長(zhǎng)，其中厚垣孢子布滿所有子實(shí)體的周期達(dá)到30 d，與其余配方相比呈極顯著差異，其次是黑豆、灰肉紅菇、棉籽殼。

圖2 不同基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇發(fā)育周期的影響Fig.2 Effect of different matrix on the development cycle of Asterophora lycoperdoides

2.2 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇培養(yǎng)液pH與體積的影響

由表1 可知，不同基質(zhì)滅菌后pH 發(fā)生了不同程度的下降，其中對(duì)照降低幅度最小。接菌后，菌絲生長(zhǎng)期培養(yǎng)液pH 除對(duì)照降低外，其余配方均快速上升；子實(shí)體形成期至厚垣孢子形成期，其pH 保持緩慢上升的趨勢(shì)，除添加雞糞、黑豆的基質(zhì)外，厚垣孢子形成期菇類(lèi)基質(zhì)（配方8～12）pH 均大于其余配方，該菇在添加灰肉紅菇的基質(zhì)上接種后其pH提高最快且在3 個(gè)時(shí)期均最高，分別為8.49、8.53、8.61，在菌絲生長(zhǎng)期、子實(shí)體形成期、厚垣孢子形成期pH 最低分別為對(duì)照、添加菌糠、棉籽殼的基質(zhì)，分別為6.08、7.45、7.70。

表1 不同基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇培養(yǎng)液pH 與體積的影響Table 1 Effect of different matrix on pH and volume of culture liquid of Asterophora lycoperdoides

該菇接菌后培養(yǎng)液總體積（100.00 mL）隨著個(gè)體發(fā)育的推進(jìn)逐漸減少，其中菌絲生長(zhǎng)期在添加野生香菇的基質(zhì)上體積減少最多（10.00 mL），在菌糠基質(zhì)上減少最小（7.00 mL）；子實(shí)體形成期在添加香菇的基質(zhì)上體積減少最多（19.00 mL），在棉籽殼和菌糠基質(zhì)上減少最?。?1.00 mL）；厚垣孢子形成期在添加菌糠的基質(zhì)上體積減少最多（19.97 mL），在對(duì)照上減少最?。?4.67 mL）。在菌絲生長(zhǎng)期菌糠培養(yǎng)液總體積最大，為93.00 mL；在子實(shí)體形成期棉籽殼與菌糠培養(yǎng)液總體積最大，為89.00 mL；在厚垣孢子形成期對(duì)照培養(yǎng)液總體積最大，為85.33 mL，均與添加荷葉離褶傘與野生香菇基質(zhì)呈極顯著差異，3 個(gè)時(shí)期培養(yǎng)液總體積最小的分別為添加野生香菇、香菇、菌糠的培養(yǎng)基，分別為90.00、81.00、80.03 mL。

2.3 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇菌球直徑、數(shù)量及生長(zhǎng)速度的影響

由表2 可知，該菇菌球數(shù)量在菌絲生長(zhǎng)期、子實(shí)體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加荷葉離褶傘、野生香菇、水葫蘆的基質(zhì)上最多，分別為29.20、35.20、8.42 個(gè)·mL-1，在添加木屑、黑豆、棉籽殼基質(zhì)上最少，分別為4.20、0.10、1.25 個(gè)·mL-1。菌球直徑在各期分別以添加木屑、雞糞、木屑的基質(zhì)上發(fā)育最大，分別為2.60、5.44、4.13 mm，在水葫蘆、靈芝、對(duì)照基質(zhì)上最小，分別為1.08、0.74、1.75 mm。菌球的生長(zhǎng)速度在各期分別以添加木屑[（0.37±0.03）mm·d-1]、雞糞[（0.18±0.03）mm·d-1]、木屑[（0.11±0.02）mm·d-1]的基質(zhì)上最快，且與其余配方相比呈極顯著差異，在添加水葫蘆[（0.12±0.01）mm·d-1]、黑豆[（0.03±0.00）mm·d-1]、對(duì)照[（0.02±0.00）mm·d-1]基質(zhì)上的菌球生長(zhǎng)速度最慢。

表2 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇菌球直徑、數(shù)量及生長(zhǎng)速度的影響Table 2 Effect of different liquid matrix on diameter,quantity and growth rate of mycelium ball of Asterophora lycoperdoides

總之，該菇菌球數(shù)量在添加荷葉離褶傘的基質(zhì)上均值最多，雞糞基質(zhì)上菌球數(shù)量均值最少，菌球直徑與生長(zhǎng)速度在添加雞糞的基質(zhì)上均值最大，棉籽殼基質(zhì)上均值均最小。

2.4 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇菌膜與子實(shí)體的影響

由表3 可知，該菇菌膜厚度在子實(shí)體形成期以添加靈芝的基質(zhì)上最大（5.00 mm），添加木屑的基質(zhì)上最小（1.20 mm），厚垣孢子形成期以添加棉籽殼的基質(zhì)上最大（4.50 mm），添加木屑的基質(zhì)上最?。?.33 mm）。菌膜生長(zhǎng)速度在子實(shí)體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加靈芝[（1.67±0.09）mm·d-1]、雞糞[（0.21±0.03）mm·d-1]的基質(zhì)上最大，除棉籽殼、灰肉紅菇基質(zhì)外，均與其余配方呈顯著差異，但均在木屑基質(zhì)上最小。該菇子實(shí)體數(shù)量在各期以添加野生香菇（0.49 個(gè)·mL-1）、木屑（1.03 個(gè)·mL-1）的基質(zhì)上最多，以添加荷葉離褶傘（0.04 個(gè)·mL-1）、雞糞（0.13 個(gè)·mL-1）的基質(zhì)上最少。

總之，該菇菌膜厚度與生長(zhǎng)速度在添加靈芝的基質(zhì)上均值最大，木屑基質(zhì)上最小，子實(shí)體數(shù)量在添加木屑的基質(zhì)上均值最多，雞糞基質(zhì)上最少。

2.5 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇生物量、菌球形成率及絕對(duì)生物學(xué)效率的影響

由表4 可知，該菇生物量在菌絲生長(zhǎng)期以添加野生香菇的基質(zhì)上最大[（5.60±0.11）mg·mL-1]，其次是黑豆基質(zhì)[（5.52±0.11）mg·mL-1]，與其余配方呈極顯著差異，而對(duì)照基質(zhì)上該值最小，與其余配方呈極顯著差異；生物量在子實(shí)體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加棉籽殼[（6.47±0.47）mg·mL-1]、菌糠[（6.10±0.76）mg·mL-1]的基質(zhì)上最大，除荷葉離褶傘基質(zhì)外，均與其余配方呈顯著差異，而在對(duì)照基質(zhì)上均最小。菌球形成率在菌絲生長(zhǎng)期、子實(shí)體形成期、厚垣孢子形成期分別以添加黑豆（4.41%）、靈芝（3.00%）、菌糠（2.35%）的基質(zhì)上最大，在添加雞糞（2.40%）、對(duì)照（0.71%）、對(duì)照（0.64%）的基質(zhì)上最小。絕對(duì)生物學(xué)效率在后2 個(gè)時(shí)期分別以添加木屑（6.59%）、靈芝（7.73%）的基質(zhì)上最大，在雞糞（0.35%）、棉籽殼（0.25%）的基質(zhì)上最小。

表4 不同液體基質(zhì)對(duì)星孢寄生菇生物量、菌球形成率及絕對(duì)生物學(xué)效率的影響Table 4 Effect of different liquid matrix on biomass,mycelium ball formation rate and absolute biological efficiency of Asterophora lycoperdoides

總之，該菇生物量在添加棉籽殼的基質(zhì)上均值最大，對(duì)照最??；菌球形成率在添加靈芝的基質(zhì)上均值最大，對(duì)照最?。唤^對(duì)生物學(xué)效率在添加木屑的基質(zhì)上均值最大，在添加雞糞的基質(zhì)上均值最小。

3 討論與結(jié)論

菇類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)是營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)[23-26]，其原基的發(fā)生是基于特定營(yíng)養(yǎng)條件下菌絲對(duì)外界脅迫的響應(yīng)，子實(shí)體的發(fā)育是遺傳物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)條件及外界環(huán)境共同互作的結(jié)果。

試驗(yàn)表明，星孢寄生菇在不同基質(zhì)上的農(nóng)藝性狀、培養(yǎng)物體積、培養(yǎng)液pH 等差異較大，添加棉籽殼、黑豆、香菇和灰肉紅菇有利于該菇在液體培養(yǎng)下子實(shí)體的形成，上述結(jié)果可能與基質(zhì)養(yǎng)分利用、氮素含量、有機(jī)酸分泌等因素有關(guān)。

菇類(lèi)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)兩個(gè)階段利用的養(yǎng)分種類(lèi)不同，前者以無(wú)氮浸出物為主，后者則通過(guò)胞外酶降解大分子物質(zhì)（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等）為主[27]。氮素在基質(zhì)中通過(guò)促進(jìn)菇類(lèi)菌絲細(xì)胞中酶、輔酶、核酸等[28]物質(zhì)合成的數(shù)量進(jìn)而影響其新陳代謝與營(yíng)養(yǎng)元素的吸收轉(zhuǎn)化速度。因此，基質(zhì)中的養(yǎng)分利用和氮素含量不同會(huì)影響該菇類(lèi)的形態(tài)發(fā)生特征和菌體轉(zhuǎn)化速度，最終影響其農(nóng)藝性狀和培養(yǎng)物體積?；|(zhì)pH 的變化主要與有機(jī)酸產(chǎn)生有關(guān)，且有機(jī)酸分泌受多種因素的影響[29-31]?；|(zhì)加熱、菇體代謝、代謝產(chǎn)物互相反應(yīng)等可能是該菇培養(yǎng)液pH 存在差異的主要原因。同時(shí)，棉籽殼含有豐富的無(wú)氮浸出物（39.5%）和粗纖維（34.5%）[32]，黑豆素有“植物蛋白之王”的美譽(yù)且蛋白質(zhì)（36.1%）和碳水化合物（23.3%）含量高[33]，添加上述兩種物質(zhì)均能滿足該菇的養(yǎng)分需求，促進(jìn)其子實(shí)體發(fā)育。香菇與灰肉紅菇極有可能與黑紅菇[2]一樣其菇體中的某些物質(zhì)對(duì)星孢寄生菇的子實(shí)體的形成有促進(jìn)作用。此外，菌株種類(lèi)、滅菌時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間等是否是改變上述試驗(yàn)結(jié)果的因素之一有待進(jìn)一步研究。

在12 種培養(yǎng)基質(zhì)與2 種培養(yǎng)模式下，星孢寄生菇的個(gè)體發(fā)育與農(nóng)藝性狀存在一定程度的差異。棉籽殼、黑豆、香菇、灰肉紅菇4 種基質(zhì)有利于該菇子實(shí)體的發(fā)育。與對(duì)照相比，雞糞、黑豆、灰肉紅菇、棉籽殼能顯著延長(zhǎng)該菇生命周期，而木屑、靈芝、香菇、野生香菇則相反。在搖瓶發(fā)酵階段，黑豆、野生香菇、香菇、荷葉離褶傘、灰肉紅菇和靈芝能夠提高該菇的生物量。在靜置發(fā)酵階段，棉籽殼和菌糠更有利于該菇生物量的積累。在添加木屑的基質(zhì)上，該菇的絕對(duì)生物學(xué)效率最高；在添加靈芝的基質(zhì)上，該菇的菌球形成率最高。總之，筆者的研究為進(jìn)一步探究星孢寄生菇的發(fā)育機(jī)制以及其他珍稀菇類(lèi)的馴化提供了理論參考。