一株甜瓜枯萎病拮抗菌的篩選、鑒定及生防效果

郝芳敏，董文杰，臧全宇，馬二磊，丁偉紅，王毓洪

（1.寧波市特色園藝作物品質(zhì)調(diào)控和抗性育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江寧波 315040；2.浙江萬里學(xué)院 浙江寧波 315040）

甜瓜是世界十大水果之一，也是我國廣泛栽種的經(jīng)濟(jì)作物之一。在甜瓜種植面積不斷擴(kuò)大、產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)步上升的同時(shí)，甜瓜病害卻日益嚴(yán)重，特別是甜瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病等病害，極大地影響了甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，限制甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中，甜瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.melonis）引起，是一種土傳病害，在甜瓜全生育期均可發(fā)生，通常造成瓜田植株大片死亡[1]。甜瓜根腐病和黑點(diǎn)根腐病分別是由腐皮鐮刀菌（F.solani）[2]和坎諾單孢菌（Monosporascus cannonballus）[3]引起的土傳病害，均可引起根腐病，造成甜瓜藤蔓急性凋萎，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。甜瓜蔓枯病是由Stagonosporopsis cucurbitacearum引起的病害，主要危害莖蔓和葉片，該病發(fā)病極快，一旦發(fā)生蔓延很難控制[4]。由亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）引起的甜瓜果腐病，多危害半成熟和成熟的果實(shí)，發(fā)病初期果實(shí)呈水漬狀病斑，后期內(nèi)部開始腐爛，該病害初期不易發(fā)現(xiàn)，不能夠及時(shí)進(jìn)行防治，一旦發(fā)生，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量[5-6]。

目前針對上述病害主要使用傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法，但是會(huì)造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題，對人們的健康及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害，甚至可能導(dǎo)致社會(huì)普遍關(guān)注的食品安全問題。因此，急需采用高效、無公害的生物技術(shù)防治甜瓜病害，生物防治具有安全、綠色、高效等優(yōu)點(diǎn)，對甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種革蘭氏陰性菌，是植物根際微生態(tài)和土壤中的優(yōu)勢微生物種群之一，該菌能分泌多種拮抗植物病原菌的代謝產(chǎn)物[7]，對維持其生態(tài)適應(yīng)性和在復(fù)雜的根際環(huán)境中繁殖生存有重要意義，可以防治多種植物真菌或細(xì)菌類病害，作為新型生物農(nóng)藥已在防治植物病害中廣泛應(yīng)用[8]。而同時(shí)對甜瓜枯萎病菌、黑點(diǎn)根腐病菌、蔓枯病菌、腐皮鐮刀菌和亞洲鐮刀菌同時(shí)有效的生防菌較少，因此，篩選對甜瓜不同病原菌同時(shí)有效的生防菌株具有重要的理論和實(shí)踐意義。

筆者的研究在連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離到一株銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）Bc1-20，對甜瓜多種病原菌均有抑制作用，平板拮抗活性很強(qiáng)，于是進(jìn)一步測定了Bc1-20 對甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病的防治效果，以期為甜瓜病害生防菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為甜瓜病害的綠色防控提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵.oxysporum）TG-5、黑 點(diǎn) 根 腐 病 菌（M.cannonballus）Mc-30、蔓枯病菌（S.cucurbitacearum）MF-17[9]、腐皮鐮刀菌（F.solani）NG-3[10]和亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）Fa-25[11]等5 種，均由筆者實(shí)驗(yàn)室分離獲得，在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，作為供試菌株。供試甜瓜品種為厚皮甜瓜材料48 號，由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，所有試驗(yàn)在寧波市特色園藝作物品質(zhì)調(diào)控和抗性育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)園區(qū)完成，時(shí)間是2023 年4—7 月。

NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL，pH 7.0。NB 培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL，pH 7.0。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分離和鑒定 銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）Bc1-20 是從寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)園區(qū)的連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離得到的，具體做法為：取甜瓜大棚的土壤1 g放到1.5 mL 的無菌水中，混勻，然后稀釋涂平板，挑取單菌落在NB 培養(yǎng)基中，溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下進(jìn)行搖培，再次對單菌落進(jìn)行劃線純化。利用在NB 培養(yǎng)基中28 ℃搖培24 h 的菌液分別對病原菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，將具有拮抗作用的細(xì)菌采用甘油保存在-70 ℃的冰箱內(nèi)，銅綠假單胞菌Bc1-20 于2023 年2 月14 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.26547。

1.2.2 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分子鑒定 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分子鑒定過程包括：采用50 μL 的PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行16S rDNA 的擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。拮抗細(xì)菌的基因組DNA 用全式金細(xì)菌基因組試劑盒提取。擴(kuò)增菌株的16S rDNA 采用細(xì)菌通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ； 1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增[12]，擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測，對陽性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化、克隆和測序[13]。將測得的16S rDNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行核酸比對，利用軟件MEGA 7.0[14]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確拮抗菌的分類地位。

1.2.3 銅綠假單胞菌Bc1-20 的生長曲線和活菌數(shù)測定 將銅綠假單胞菌Bc1-20 菌株取出，在NA 平板上劃線活化，轉(zhuǎn)代1 次后挑取單菌落接種于NB 液體培養(yǎng)基（100 mL）搖培，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下?lián)u培，每間隔4 h 取樣，直至56 h 結(jié)束，取樣測量OD600值和活菌數(shù)等數(shù)據(jù)。

1.2.4 銅綠假單胞菌Bc1-20 的防病拮抗效果試驗(yàn) 采用平板對峙法進(jìn)行防病拮抗菌株的篩選，在PDA 培養(yǎng)基上活化尖孢鐮刀菌甜瓜?；途?、蔓枯病菌、黑點(diǎn)根腐病菌、腐皮鐮刀菌和亞洲鐮刀菌等病原菌，用直徑5 mm 的打孔器在新鮮的菌落邊緣打孔，挑取新鮮菌絲塊接種在新的PDA 平板中心，用接種環(huán)挑取少量新鮮綠假單胞菌Bc1-20 菌液于PDA 培養(yǎng)基的兩端劃線，劃線處距PDA 端部距離為1 cm，封口膜封好后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，10 d 之后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)菌株3 個(gè)皿。對照組只接種病原菌，不接種綠假單胞菌Bc1-20[15]。

1.2.5 銅綠假單胞菌Bc1-20 的促生試驗(yàn) 在溫室大棚中，利用盆栽試驗(yàn)進(jìn)行拮抗細(xì)菌對甜瓜幼苗的促生試驗(yàn)，在甜瓜種子播種3、7、10 d 后，用拮抗細(xì)菌配置的108cfu·mL-1懸浮菌液對甜瓜幼苗進(jìn)行灌根：用移液器將懸浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入，每棵幼苗用1 mL 菌液處理，共計(jì)150 棵，同時(shí)以NB培養(yǎng)基處理的甜瓜幼苗作為對照。17 d 后，拔出完整的甜瓜幼苗，每個(gè)處理取生長一致的30 棵幼苗，只保留地上部分，測量幼苗的莖粗、莖長、子葉長和寬、每株幼苗中最大真葉的長和寬及地上部分鮮質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 甜瓜枯萎病的盆栽生防試驗(yàn) 在甜瓜播種后的3、7、10 d，用108cfu·mL-1的銅綠假單胞菌Bc1-20 懸浮菌液對甜瓜幼苗進(jìn)行灌根，每棵幼苗用1 mL 菌液處理。每個(gè)處理對應(yīng)1 個(gè)穴盤，每個(gè)穴盤50 株，設(shè)置3 次重復(fù)。同時(shí)用NB 培養(yǎng)基處理的甜瓜幼苗作為CK 組。

甜瓜枯萎病接種：選用的甜瓜品種為對甜瓜枯萎病感病品種甬148（由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院培育），在2 葉1 心時(shí)，以50 株幼苗為1 組，3 次重復(fù)，左邊一半不接種，右邊一半接種。將幼苗從穴盤中取出，輕度損傷根系，洗凈根部，在4×106個(gè)·mL-1的枯萎病菌孢子液中浸根15 min，根系全部浸入，中間搖動(dòng)2 次，不接種的在清水中浸根15 min。再移栽至營養(yǎng)土中，接種前3 d 遮陰，溫度保持在25 ℃，3 d 緩苗后撤掉遮陽網(wǎng)，在溫室正常管理，15 d 后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)分析病情指數(shù)和相對防治效果[16]。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：整株無病癥為0 級；晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫為1 級；1 片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫為2 級；子葉及真葉萎蔫，阻礙發(fā)育為3 級；整株萎蔫，60%以上枯死，心葉成活為4 級；整株嚴(yán)重萎蔫并枯死為5 級[17]。病情指數(shù)＝∑（級數(shù)×該級株數(shù)）/（總株數(shù)×最高級數(shù)）×100；相對防治效果/%＝（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bc1-20的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離獲得1 株對甜瓜病原菌具有拮抗作用的細(xì)菌，編號為Bc1-20，其在NA 培養(yǎng)基上可見邊緣光滑的圓形、淡綠色菌落，在NB 培養(yǎng)基中進(jìn)行搖培24 h 后的菌液明顯為綠色（圖1）。

圖1 Bc1-20 在NA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（A）和在NB 培養(yǎng)基中的搖培情況（B）Fig.1 Colony morphology of strain Bc1-20 on NA medium（A）and was shaken in NB medium（B）

以菌株Bc1-20 的基因組DNA 為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測序，獲得銅綠假單胞菌Bc1-20 的16S rDNA 序列為1500 bp。將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明其與菌株銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）SI1（16S，GenBankAcc.OQ615324.1）的同源性最高，為100%。利用MEGA 7 對測序獲得的序列和其他相近的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株Bc1-20 與銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的菌株聚為一支，所以認(rèn)為Bc1-20 屬于銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）（圖2）。

圖2 基于16S-rRNA 構(gòu)建的拮抗菌株Bc1-20 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strain Bc1-20 based on 16S-rRNA

2.2 銅綠假單胞菌Bc1-20的生長曲線和活菌數(shù)測定

將Bc1-20 按照2%的接種量接種于100 mL 的NB 液體培養(yǎng)基中，每間隔4 h 取樣測量OD600值，結(jié)果表明，銅綠假單胞菌Bc1-20 在NB 液體培養(yǎng)基中搖培4～20 h 為對數(shù)生長期，24 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，Bc1-20 在24 h 時(shí)的菌落數(shù)有7.8×108cfu·mL-1（圖3）。

圖3 Bc1-20 在NB 中的生長情況（A）和在28 ℃下隨時(shí)間變化的菌落數(shù)（B）Fig.3 Growth curve of Bc1-20 in NB medium over time（A）and change of colony number of Bc1-20 with time at 28 ℃（B）

2.3 銅綠假單胞菌Bc1-20的防病拮抗效果

將銅綠假單胞菌Bc1-20 與甜瓜多種病原菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，在對峙培養(yǎng)10 d 后，Bc1-20 對尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵.oxysporum）、蔓枯病菌（S.cucurbitacearum）、黑點(diǎn)根腐病菌（M.cannonballus）、腐皮鐮刀菌（F.solani）和亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）的生長均有抑制作用，在對峙培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)了明顯的拮抗帶，后期對峙的病原菌也無法再生長。試驗(yàn)結(jié)果證明，銅綠假單胞菌Bc1-20 菌株對甜瓜多種病原菌抑制作用明顯，具有潛在的生防效果（圖4）。

圖4 菌株Bc1-20 對甜瓜不同病原菌的平板拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Strain Bc1-20 conducted plate antagonism tests against different pathogens in melon

2.4 銅綠假單胞菌Bc1-20的促生試驗(yàn)

用銅綠假單胞菌Bc1-20 的菌懸液處理甜瓜幼苗，17 d 后進(jìn)行數(shù)據(jù)測量，結(jié)果表明，其在莖粗、莖長、地上部鮮質(zhì)量、子葉長和寬及最大真葉的長和寬方面都極顯著高于CK，表明銅綠假單胞菌Bc1-20 對甜瓜幼苗有促生作用（圖5，表1）。

表1 菌株Bc1-20 對甜瓜幼苗生長的影響Table 1 Effects of strain Bc1-20 on the growth of melon seedlings

圖5 菌株Bc1-20 對甜瓜幼苗的促生試驗(yàn)Fig.5 Growth promotion test results of Bc1-20 strain on melon seedlings

2.5 甜瓜枯萎病的盆栽生防試驗(yàn)

用銅綠假單胞菌Bc1-20 處理甜瓜幼苗后，進(jìn)行甜瓜枯萎病的接種試驗(yàn)，接種15 d 后調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)為40.80，CK 的病情指數(shù)為85.65，用銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的相對防治效果為52.34%。由此可見，銅綠假單胞菌Bc1-20 對甜瓜枯萎病具有一定的生防作用（圖6、表2）。

表2 Bc1-20 處理相對防治效果Table 2 Relative control effect of Bc1-20 treatment

圖6 菌株Bc1-20 對甜瓜枯萎病生防試驗(yàn)Fig.6 Biological control of strain Bc1-20 against melon Fusarium wilt

3 討論與結(jié)論

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是動(dòng)物和人類的條件性致病菌[18]，但是，近年來，一些用于促生和防治植物病原菌的銅綠假單胞菌陸續(xù)被分離和鑒定，由于顯著的抑菌活性而引起了研究者的極大關(guān)注。例如銅綠假單胞菌31-2 對煙草青枯病菌拮抗活性穩(wěn)定，可在煙草根、莖和葉表面及內(nèi)部定殖，對煙草青枯病具有很好的防治作用，菌液和活性物質(zhì)粗提物分別具有39.50%和20.90%的防治效果[19]。銅綠假單胞菌FJAT-346-PA 對香蕉枯萎病病原菌具有良好的抑制作用，在香蕉組培苗、盆栽苗及大田植株體內(nèi)定殖，對香蕉有明顯的促生長作用，對香蕉枯萎病具有較好的防治效果，盆栽防效和田間防效分別為83.67%和82.00%[20]。銅綠假單胞菌F13 不僅對豆角白粉病具有良好的防治效果，而且具有很好的促生效果，株高、葉片數(shù)和莖粗均高于對照組，且產(chǎn)量高于對照組39.68%[21]。在筆者的研究中，銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的甜瓜幼苗莖粗、莖長、地上部鮮質(zhì)量、子葉及最大真葉大小都極顯著高于對照，具有一定的促生作用，由于根系在拔出穴盤時(shí)容易斷根，并沒有進(jìn)行根系強(qiáng)弱的比較。此外，銅綠假單胞菌還對昆蟲和線蟲具有一定的抑制效果，例如對松墨天牛幼蟲具有殺蟲活性[22]，銅綠假單胞菌NZM13-11 能夠高效地殺死馬尾松內(nèi)的松材線蟲，具有防控松材線蟲病的可能性[23]。

目前，銅綠假單胞菌在葫蘆科作物上的應(yīng)用比較少，1996 年分離于上海郊區(qū)甜瓜根際的銅綠假單胞菌M18 可抑制甜瓜蔓枯菌生長[24]，分泌的抗真菌物質(zhì)PCA 可以有效防治瓜類枯萎病[25]，使用M18活菌浸種處理黃瓜種子以及在大棚根基土壤澆灌的試驗(yàn)中，黃瓜枯萎病相對于對照降低70%～80%[26]，霜霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)均下降70%左右[27]。筆者研究的銅綠假單胞菌Bc1-20 對尖孢鐮刀菌引起的甜瓜枯萎病的相對防治效果為52.34%，但未做對蔓枯病菌、腐皮鐮刀菌、黑點(diǎn)根腐病菌、亞洲鐮刀菌等病菌引起的其他病害的盆栽防效試驗(yàn)，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證完善。

筆者研究分離獲得的銅綠假單胞菌Bc1-20 對甜瓜多種病害病原菌具有抑制作用，包括尖孢鐮刀菌甜瓜?；筒【⒑邳c(diǎn)根腐病菌、蔓枯病菌、亞洲鐮刀菌和腐皮鐮刀菌等病原菌；Bc1-20 對甜瓜幼苗有促生作用，包括甜瓜幼苗的莖粗、莖長、鮮質(zhì)量、子葉長和寬及最大真葉的長和寬方面都極顯著高于對照；Bc1-20 對甜瓜枯萎病具有良好的生防潛力，Bc1-20 處理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)為40.80，對照組的病情指數(shù)85.65，相對防治效果為52.34%，可很好地防治甜瓜枯萎病。