中藥益母草致肝腎毒性:基于動物模型的meta分析*

王 芳,閻星旭,赫俊杰,李 霞,王 玥,韓利文,李遇伯△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250000)

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1檢索策略 利用計算機(jī)檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普、PubMed和Web of Science數(shù)據(jù)庫,中文檢索詞為“益母草”“茺蔚”“坤草”“紅花艾”“苦草”“毒性”。英文檢索詞為“l(fā)eonurus”“motherwort”“motherworts”“toxicity”“toxic potential”“margin of safety”。檢索時間為各數(shù)據(jù)庫建立至2022年7月9日。

1.1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) (1)動物實(shí)驗(yàn);(2)有明確結(jié)局量化指標(biāo);(3)益母草的制劑、化學(xué)成分或提取物給藥;(4)空白對照組給予等體積蒸餾水或生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組給予益母草制劑、化學(xué)成分或提取物。

1.1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)綜述類文獻(xiàn);(2)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn);(3)益母草其他方面的文獻(xiàn)(治療作用、藥物動力學(xué)研究、機(jī)制研究);(4)無法獲取全文的文獻(xiàn);(5)數(shù)據(jù)缺失的文獻(xiàn);(6)主題不符的文獻(xiàn)。

1.2方法

不等司機(jī)想法把車靠邊，雪螢突然拉開車門跳下去，從幾排等紅燈的汽車之間擠出去，跳上那輛摩托車，在擁擠的車流間飛魚一樣穿行。

1.2.1文獻(xiàn)資料提取 由2名研究者分別進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,由Endnote文獻(xiàn)管理器管理,根據(jù)研究者擬定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)對文獻(xiàn)內(nèi)容進(jìn)行篩選和相關(guān)數(shù)據(jù)的提取,最后進(jìn)行交叉核對,如有異議,可通過討論或由第3名研究者決定。資料提取內(nèi)容包括:作者、出版年份、動物種屬、動物樣本量、給藥時間、給藥劑量、益母草提取方式、結(jié)局指標(biāo)。選取谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)為結(jié)局指標(biāo)。在提取數(shù)據(jù)的過程中,部分研究中根據(jù)藥物劑量的不同會出現(xiàn)多個實(shí)驗(yàn)組,所以在提取和錄入數(shù)據(jù)時需要對其進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化,本文的數(shù)據(jù)為連續(xù)型變量,則根據(jù)以下公式進(jìn)行計算:設(shè)實(shí)驗(yàn)組1的樣本量為N1,均數(shù)為M1,標(biāo)準(zhǔn)差為SD1;實(shí)驗(yàn)組2的樣本量為N2,均數(shù)為M2,標(biāo)準(zhǔn)差為SD2,合并后的樣本量為n=N1+N2。

標(biāo)準(zhǔn)差為

若有多個實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)需要合并,則可按照上述公式,先將其中2個亞組的數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,再將得到的數(shù)據(jù)與第3個亞組進(jìn)行合并,以此類推。

1.2.2文獻(xiàn)質(zhì)量評價 由2名研究者采用SYRCLE動物實(shí)驗(yàn)偏倚風(fēng)險評估工具對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行獨(dú)立評價[16]。對評價結(jié)果進(jìn)行交叉核對,如遇分歧,則進(jìn)行討論或由第三方解決,偏倚風(fēng)險評價結(jié)果以 “是”(Y)、 “否”(N)和“不確定”(U)分別代表低偏倚風(fēng)險、高偏倚風(fēng)險和不確定偏倚風(fēng)險。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用Cochrane Library協(xié)作網(wǎng)提供的Rev Man5.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。納入的結(jié)局指標(biāo)均為連續(xù)性變量,效應(yīng)量采用標(biāo)準(zhǔn)均數(shù)差(SMD)表示,并計算其95%置信區(qū)間(95%CI)。通過計算I2值來判斷納入數(shù)據(jù)的異質(zhì)性,若I2≤50%,P≥0.1,認(rèn)為各研究間不存在顯著異質(zhì)性,采用固定效應(yīng)模型分析;若I2>50%,P<0.1,認(rèn)為各研究間存在顯著異質(zhì)性,采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析;當(dāng)異質(zhì)性較高時,采用亞組分析探討異質(zhì)性的來源,進(jìn)行敏感性分析時,對其進(jìn)行剔除后再評價結(jié)果的穩(wěn)定性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1文獻(xiàn)篩選結(jié)果 初步檢索獲得文獻(xiàn)456篇,最終納入文獻(xiàn)18篇[17-34],文獻(xiàn)篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程

2.2納入文獻(xiàn)基本資料 納入的所有文獻(xiàn)均為隨機(jī)對照文獻(xiàn)動物實(shí)驗(yàn),其中16篇中文文獻(xiàn),2篇英文文獻(xiàn),總樣本量為1 112只,其中干預(yù)組852只,對照組260只;發(fā)表于2000-2019年;動物為大鼠或小鼠;所有文獻(xiàn)動物的給藥劑量均高于臨床用藥劑量;17篇文獻(xiàn)[17-33]證明了益母草的毒性作用,1篇文獻(xiàn)[34]顯示短期大劑量的益母草對大鼠未見明顯的腎臟不良反應(yīng) ,納入文獻(xiàn)基本資料見表1。

表1 納入文獻(xiàn)基本資料

2.3納入文獻(xiàn)偏倚風(fēng)險評價 將納入文獻(xiàn)根據(jù)SYRCLE動物實(shí)驗(yàn)偏倚風(fēng)險評估工具進(jìn)行評價，18篇文獻(xiàn)中，對于分配序列的產(chǎn)生或應(yīng)用，7篇文獻(xiàn)提及按體重和性別隨機(jī)，其余均提及隨機(jī)字樣未描述具體分配方式。動物基線從動物年齡和體重考慮,18篇文獻(xiàn)的各組動物基線基本相同。6篇文獻(xiàn)[17-18,24-26,34]對用于結(jié)果評價的動物進(jìn)行隨機(jī)選擇。所有文獻(xiàn)均無不完整數(shù)據(jù)報告。分配隱藏、動物安置隨機(jī)化、是否對動物飼養(yǎng)者、研究者和結(jié)果評價者實(shí)施盲法、選擇性結(jié)果報告和其他偏倚來源沒有充足的證據(jù)證明是否符合評估標(biāo)準(zhǔn),故不明確其存在的風(fēng)險偏倚。見表2。

表2 納入研究的偏倚風(fēng)險評價結(jié)果

2.4meta分析結(jié)果

2.4.1ALT 13個研究記錄ALT[17-18,21-23,25-30,32-33],干預(yù)組動物538例,對照組動物168例,各研究間存在異質(zhì)性(P<0.001,I2=80%),故采用隨機(jī)效應(yīng)模型。分析結(jié)果顯示:提取資料總的合并效應(yīng)量SMD=1.01,95%CI為(0.54,1.48),對總的模型進(jìn)行檢驗(yàn)得出差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.22,P<0.001),因此提示益母草干預(yù)組動物的ALT水平顯著升高。

2.4.2AST 13個研究記錄AST[17-18,21-23,25-30,32-33],干預(yù)組動物538例,對照組動物168例,各研究間存在異質(zhì)性(P<0.001,I2=80%),故采用隨機(jī)效應(yīng)模型。分析結(jié)果顯示:提取資料總的合并效應(yīng)量SMD=1.05,95%CI為(0.59,1.52),對總的模型進(jìn)行檢驗(yàn)得出差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.43,P<0.001),因此提示益母草干預(yù)組動物的AST水平顯著升高。

2.4.3Cr 17個研究記錄Cr[17-31,33-34],干預(yù)組動物807例,對照組動物267例,各研究間存在異質(zhì)性(P<0.001,I2=93%),故采用隨機(jī)效應(yīng)模型。分析結(jié)果顯示:提取資料總的合并效應(yīng)量SMD=1.72,95%CI為(1.06,2.38),對總的模型進(jìn)行檢驗(yàn)得出差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=5.12,P<0.001),因此提示益母草干預(yù)組動物的Cr水平顯著升高。

2.4.4BUN 16個研究記錄BUN[17-31,34],干預(yù)組動物844例,對照組動物284例,各研究間存在異質(zhì)性(P<0.001,I2=92%),故采用隨機(jī)效應(yīng)模型。分析結(jié)果顯示:提取資料總的合并效應(yīng)量SMD=1.46,95%CI為(0.89,2.03),對總的模型進(jìn)行檢驗(yàn)得出差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=5.02,P<0.001),因此提示益母草干預(yù)組動物的BUN水平明顯升高。以上meta分析的結(jié)果顯示,干預(yù)組動物的ALT、AST、BUN和Cr水平均顯著高于對照組,且本研究所納入的文獻(xiàn)給藥劑量均高于臨床上用藥劑量。由此說明,益母草的超劑量使用有一定的毒性作用,這與以往益母草毒性的研究結(jié)果基本一致。

2.5敏感性分析 為檢驗(yàn)meta分析結(jié)果是否穩(wěn)定可靠和探索異質(zhì)性來源,分別進(jìn)行益母草對ALT、AST、BUN和Cr水平影響的敏感性分析。將納入的文獻(xiàn)每次剔除1個研究,再將其他文獻(xiàn)進(jìn)行合并,逐一剔除其他文獻(xiàn)后仍具有顯著差異,說明研究結(jié)果比較穩(wěn)定。ALT、AST、BUN和Cr的敏感性分析結(jié)果表明逐一剔除任意文獻(xiàn)后未見異質(zhì)性明顯變化,益母草干預(yù)組ALT、AST、BUN和Cr水平與對照組仍有顯著性的差異,說明研究結(jié)果均較為穩(wěn)定可靠。

2.6亞組分析 鑒于益母草對結(jié)局指標(biāo)結(jié)果的研究間存在較大的異質(zhì)性,根據(jù)納入文獻(xiàn)基本情況,作者推測其異質(zhì)性可能與給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式等因素有關(guān)。本研究將根據(jù)給藥劑量、給藥時間和益母草提取方式對ALT、AST、Cr和BUN進(jìn)行亞組分析,探索可能的異質(zhì)性來源。

2.6.1ALT的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量(給藥的高低劑量分界值為所有研究的給藥劑量的均值)和益母草提取方式不同對13個記錄ALT的研究[17-18,21-23,25-30,32-33]進(jìn)行亞組分析,給藥時間和給藥劑量亞組分析結(jié)果顯示,ALT的水平在任意一個給藥時間和給藥劑量的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥時間、給藥劑量對ALT的異質(zhì)性水平影響較小。提取方式的亞組分析結(jié)果顯示,ALT的水平在水提和其他方式提取的亞組中均能維持顯著差異,并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,但在醇提的亞組中異質(zhì)性顯著降低(I2=0%),提示益母草提取方式可能會影響ALT的異質(zhì)性水平。

2.6.2AST的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式不同對13個記錄AST的研究[17-18,21-23,25-30,32-33]進(jìn)行亞組分析,給藥時間亞組分析結(jié)果顯示,AST的水平在任意一個給藥時間的亞組中均能維持顯著差異,但是在給藥15 d以上的亞組其異質(zhì)性大大降低(I2=0%),推測給藥時間可能是AST異質(zhì)性的潛在來源。給藥劑量亞組分析結(jié)果顯示,AST的水平在任意一個給藥劑量的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥劑量對AST的異質(zhì)性水平影響不大,其異質(zhì)性可能由其他因素影響。提取方式亞組分析結(jié)果顯示,AST的水平在水提和其他方式提取的亞組中均能維持顯著差異,并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,但在醇提的亞組中異質(zhì)性顯著降低(I2=0%),推測益母草提取方式可能會影響AST的異質(zhì)性水平。

2.6.3Cr的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式不同對17個記錄Cr的研究[17-31,33-34]進(jìn)行亞組分析,亞組分析結(jié)果顯示,Cr的水平在任意一個時間、劑量和提取方式的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥時間、給藥劑量及提取方式對Cr的異質(zhì)性水平影響不大,其異質(zhì)性可能由其他因影響。

2.6.4BUN的亞組分析 根據(jù)給藥時間、給藥劑量和益母草提取方式不同對16個記錄BUN的研究[17-31,34]進(jìn)行亞組分析,給藥時間和給藥劑量亞組分析結(jié)果顯示,BUN的水平在短時間、長時間給藥和任一給藥劑量的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,作者推測給藥時間和給藥劑量對BUN的異質(zhì)性水平影響不大,其異質(zhì)性可能由其他因素影響。亞組分析結(jié)果顯示,BUN的水平在水提和醇提的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,但在其他方式提取的亞組中異質(zhì)性顯著降低(I2=47%<50%),推測益母草提取方式可能會影響B(tài)UN的異質(zhì)性水平。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),干預(yù)組動物的ALT、AST、Cr和BUN 4個指標(biāo)水平均顯著高于對照組,且本研究所納入的文獻(xiàn)給藥劑量均高于臨床上用藥劑量,由此進(jìn)一步說明益母草超劑量使用有一定的毒性作用。

本研究進(jìn)行了給藥時間的亞組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ALT、Cr和BUN的給藥時間亞組分析中,3個結(jié)局指標(biāo)的水平在任意一個給藥時間的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥時間對ALT、Cr和BUN的異質(zhì)性水平影響不大。但在AST的給藥時間亞組分析中,給藥15 d以上的亞組其異質(zhì)性大大降低(I2=0%),推測給藥時間可能是AST異質(zhì)性的潛在來源。本研究還進(jìn)行了給藥劑量的亞組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ALT、AST、Cr和BUN的亞組分析中,4個結(jié)局指標(biāo)的水平在任意一個給藥時間的亞組中均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,推測給藥劑量對ALT、AST、Cr和BUN的異質(zhì)性無顯著影響。此外,本研究也對益母草提取方式進(jìn)行了亞組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Cr的亞組中其指標(biāo)水平均能維持顯著差異并且異質(zhì)性也未發(fā)生明顯變化,推測益母草提取方式對Cr的異質(zhì)性水平影響不大。但在ALT和AST提取方式的亞組分析中,ALT和AST的水平在水提和其他方式提取的亞組中顯著性和異質(zhì)性未發(fā)生明顯變化,而在醇提的亞組中異質(zhì)性均顯著降低(I2=0%),因此推測益母草提取方式可能會影響ALT和AST的異質(zhì)性水平。BUN提取方式的亞組分析結(jié)果顯示,BUN的水平在水提和醇提的亞組中顯著性和異質(zhì)性無顯著影響,但在其他方式提取的亞組中異質(zhì)性顯著降低(I2=47%<50%),因此推測益母草提取方式可能會影響B(tài)UN的異質(zhì)性水平。綜上所述,目前亞組分析結(jié)果表明給藥時間和益母草的提取方式可能影響結(jié)局指標(biāo)的異質(zhì)性,因此益母草毒性與其給藥時間及提取方式存在一定的相關(guān)性,其中給藥劑量對異質(zhì)性無顯著影響的原因,作者推測,可能是所納入文獻(xiàn)的給藥劑量本來就相當(dāng)于臨床給藥的20 ～160倍劑量,亞組中的高低劑量組也是相當(dāng)于衡量超劑量給藥的程度,所以給藥劑量可能不是影響異質(zhì)性的主要因素。由于本次meta分析納入研究中的干預(yù)組均包含多個劑量組,為了最大限度地納入更具有代表性的數(shù)據(jù),作者使用公式對提取的各劑量組結(jié)局指標(biāo)的M和SD進(jìn)行整合,并使用各組劑量的平均值作為每個研究的合并劑量。因此,由于給藥劑量的不同所導(dǎo)致的數(shù)據(jù)整合與變換,可能也是異質(zhì)性來源之一。

有研究表明,益母草可能造成腎臟損傷,然而也有文獻(xiàn)報道益母草及含有益母草的制劑可能具有保護(hù)腎臟的功效[35-37]。2020年版《中國藥典》規(guī)定益母草的用藥劑量為9～30 g,其鮮品服用量為12～40 g,因而對藥典劑量范圍內(nèi)益母草的安全性問題進(jìn)行深入研究就顯得尤為迫切。本研究結(jié)果提示,控制服用時間、使用合適的提取方式及控制用量是預(yù)防益母草中毒的關(guān)鍵,作者的分析結(jié)果有助于提升臨床上用藥安全性,有效控制不良反應(yīng)和風(fēng)險事件的發(fā)生。

本次meta分析的局限性包括以下幾點(diǎn):(1)納入的研究均未提及并說明分配隱藏動物安置是否服從隨機(jī)化、對動物飼養(yǎng)者、研究者和結(jié)果評價者是否實(shí)施盲法、是否存在選擇性結(jié)果報告和其他偏倚來源,且文獻(xiàn)質(zhì)量整體偏低,對meta分析結(jié)果可能會產(chǎn)生一定的影響。(2)實(shí)驗(yàn)動物種屬、給藥方式、實(shí)驗(yàn)人員的操作手法等因素在納入的各項(xiàng)研究的原文中存在一定差異,可能造成meta分析的結(jié)果存在異質(zhì)性,進(jìn)而影響其可信度。(3)納入樣本量較小、部分?jǐn)?shù)據(jù)質(zhì)量不高、有一定偏倚風(fēng)險等,可能在一定程度上影響meta分析結(jié)果的可靠性。(4)納入的研究為動物實(shí)驗(yàn)而不是臨床研究,其原因是臨床研究中一般為病例及不良反應(yīng)報道,其符合meta分析的可納入的文獻(xiàn)量不如動物實(shí)驗(yàn)多。以上不足會給本研究結(jié)果帶來偏倚風(fēng)險。

綜上所述,現(xiàn)有益母草毒性研究的動物實(shí)驗(yàn)表明,益母草超劑量使用能使血液中肝腎功能指標(biāo)ALT、AST、Cr、BUN水平均明顯升高,造成一定的肝腎損傷。由于受納入文獻(xiàn)質(zhì)量和數(shù)量的限制,本研究結(jié)論尚需要大樣本、高質(zhì)量、多中心的研究來予以證實(shí)。未來需要開展大樣本、高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)/試驗(yàn),合理運(yùn)用隨機(jī)方法、分配隱藏、盲法等減少偏倚風(fēng)險,規(guī)范操作手法,從多維度探討益母草的安全性,進(jìn)而使最終的評價結(jié)果能有效指導(dǎo)臨床用藥,提供可靠的循證依據(jù)。