菲脅迫對泥鰍肝臟氧化毒性及可逆性研究

王 琪，楊超超，明 艷，馮宇宇，唐 緒，雷 忻

（延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；延安市生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000）

菲（Phenanthrene，Phe）是廣泛分布于水體中的一類多環(huán)芳烴類污染物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs），由3 個(gè)苯環(huán)組成［1］。由于大氣沉積以及石油泄漏等原因，水生環(huán)境中的Phe 濃度大幅增加。Phe 在水體中脂溶性高，易富集到有機(jī)體內(nèi)［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，Phe 對魚類具有一定的氧化毒性。閻波等［3］在Phe 對毛蚶氧化脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，50 mg/L 脅迫下毛蚶體內(nèi)活性氧含量均高于對照組，整體呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢，且隨著Phe濃度的增加存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；在Phe對中華倒刺鲃的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著飼料Phe濃度的升高，實(shí)驗(yàn)魚肝胰臟和腸組織中總的抗氧化能力顯著降低，表明Phe 食物暴露會導(dǎo)致魚體組織器官的氧化損傷并抑制魚體相應(yīng)解毒酶系統(tǒng)的活性，可引起魚類肝臟和腸道出現(xiàn)組織增大等形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的改變［4］。

污染物通過不同途徑進(jìn)入魚體會誘發(fā)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）［5］，這種活性氧自由基會導(dǎo)致生物體內(nèi)出現(xiàn)氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的效用，包括抗氧化酶活性的改變，例如：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等［6］。在反應(yīng)過程中SOD 會通過歧化反應(yīng)將活性超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，SOD 基因有幾種亞型：Cu/Zn-SOD、Fe-SOD等，在動(dòng)物細(xì)胞乃至魚類細(xì)胞中較為常見的是Cu/Zn-SOD基因［7］。CAT 可將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2［8］，其中CAT1和CAT3是對氧化劑反應(yīng)最高的基因。同時(shí)，機(jī)體的氧化損傷也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激指數(shù)丙二醛（malondialdehyde，MDA）、發(fā)生DNA損傷的標(biāo)志性指數(shù)8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG）的值發(fā)生改變。這種氧化應(yīng)激反應(yīng)是由細(xì)胞過氧化和抗氧化劑的不平衡以及氧化的偏向引起的，最終會導(dǎo)致細(xì)胞損傷［9-10］。XIE 等［11］在對黃鯰魚腸道抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)，鎘暴露會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抑制抗氧化活性，其特征在于MDA 水平的升高以及抗氧化酶的活性和轉(zhuǎn)錄水平的降低。綜合生物標(biāo)志物指數(shù)（integrated biomarker response，IBR）可以準(zhǔn)確詳細(xì)地預(yù)測各種標(biāo)志物綜合聯(lián)系的指數(shù)，它是衡量評估污染物嚴(yán)重性的有力工具［12］。

泥鰍（Misgurnusanguillicaudatus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、泥鰍屬（Misgunus），常棲息在河流淤泥底部，具備較強(qiáng)適應(yīng)能力，易在實(shí)驗(yàn)室條件馴養(yǎng)，在檢測污染物毒性過程中具有一定指示性。本研究以泥鰍為材料，檢測在Phe 脅迫下其肝臟SOD、CAT 活性和MDA、8-OHdG 含量的變化，測定Cu/Zn-SOD、CAT3基因mRNA 相對表達(dá)量的變化，探究Phe 對泥鰍抗氧化和代謝解毒過程的影響，并運(yùn)用IBR 模型，綜合分析Phe 對泥鰍的氧化毒性效應(yīng)及其可逆性，以期為其污染治理和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菲（純度>95%）購自源葉生物）；MDA、8-OHdG ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；泥鰍購買于江蘇生態(tài)泥鰍養(yǎng)殖基地，實(shí)驗(yàn)前泥鰍在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中用自然脫氯的水馴養(yǎng)15 d，每天定時(shí)投喂泥鰍食少量，泥鰍養(yǎng)殖水溫保持在（25 ± 2）℃，pH為（7.5 ± 0.2）。

1.2 方法

1.2.1 染毒實(shí)驗(yàn)與恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)室前期對泥鰍進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，尋找Phe 脅迫下泥鰍的安全濃度，在安全濃度范圍內(nèi)等對數(shù)設(shè)置5個(gè)Phe濃度處理組：0.15、1.33、1.77、2.36、3.13 mg/L，同時(shí)設(shè)置空白對照組和溶劑對照組（丙酮溶液），采用半靜態(tài)亞急性毒性法，設(shè)置3組重復(fù)，每組均放入泥鰍25 條，每24 h 更換Phe 試劑，同時(shí)觀察并記錄泥鰍行為變化情況，脅迫45 d 后將其轉(zhuǎn)入自然水體中馴養(yǎng)30 d，并設(shè)置對照組。短期脅迫15、30、45 d以及恢復(fù)期馴養(yǎng)30 d后，取不同濃度泥鰍約3～5條，剖取肝臟等組織，置于-80 ℃冷凍保存待測。

1.2.2 SOD、CAT活性及MDA、8-OHdG含量測定

將剖取的肝臟組織稱重記錄，加入PBS 緩沖液（按重量：體積=1∶9），混至勻漿，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理后取上清，利用ELISA 試劑盒檢測MDA、8-OHdG 含量以及SOD、CAT 酶活性。8-OHdG 和MDA 含量測定采用雙抗體夾心法，SOD 活性使用氮藍(lán)四唑光化還原法測定［13］，CAT 活性使用鉬酸銨比色法測定［14］。

1.2.3Cu/Zn-SOD、CAT3基因的表達(dá)測定

采用qRT-PCR 方法檢測Cu/Zn-SOD、CAT3兩種基因mRNA 表達(dá)量，選擇β-actin基因作為相對定量內(nèi)參。引物由上海生工生物工程股份有限公司（西安分部）合成，引物序列下表1所示。

表1 特異性引物

利用Trizol 試劑盒從泥鰍中提取肝臟組織總RNA，取少量DEPC（diethylprocarbonate）水迅速溶解，檢測其RNA 濃度和質(zhì)量，后通過試劑盒取少量進(jìn)行去除gDNA 和反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。采用SYBR Green Pro Tap HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒進(jìn)行后續(xù)熒光定量qPCR 實(shí)驗(yàn)，需注意保持干燥，防止污染。以β-actin作為相對定量內(nèi)參，采用2-△△Ct法［15］計(jì)算Cu/Zn-SOD、CAT3的mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 泥鰍肝臟組織切片制作與觀察

將脅迫30 d 不同濃度處理組泥鰍各取3 尾，解剖肝臟部位并置于Bouin’s 固定液中1 d，清洗組織數(shù)次，采用石蠟包埋，使用輪式切片機(jī)制作切片，hematoxylin-eosin（H.E）染色法對切片染色、鏡檢、觀察并拍照。

1.2.5 IBR綜合指數(shù)

IBR 綜合指數(shù)采用第二代綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)法［16］，計(jì)算各濃度組中多種生物標(biāo)志物數(shù)值，采用公式Y(jié)=log（X/X0）、Zi=（Y-M）/SD、A=Zi-Z0分別計(jì)算出標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化值、均一化值和偏離指數(shù)，最后計(jì)算IBR總值。

其中，X及X0代表生物標(biāo)志物在不同染毒組和對照組的平均值，Y代表各標(biāo)準(zhǔn)化值，Z代表所得的均一化值，A為生物標(biāo)志物偏離指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 25統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan 法比較組間差異，使用graphpad 9.0 和 Origin 2022 作圖。當(dāng)0.01

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Phe脅迫下泥鰍肝臟MDA和8-OHdG含量變化

Phe 對泥鰍肝臟MDA 和8-OHdG 含量的影響如圖1 所示。由圖1A 可知，各Phe 濃度處理組暴露下MDA 含量均高于對照組；Phe 脅迫30 d 時(shí)，2.36 mg/L 濃度組MDA 含量最高。在不同脅迫時(shí)間下，隨著脅迫濃度的增加，中低濃度組（0.15、1.33、1.77 mg/L）MDA 含量顯著上升（P<0.05）；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 時(shí)，Phe 各濃度處理組MDA 含量略有降低，但與對照組相比呈顯著上升趨勢（P<0.01）。由圖1B 可知，各Phe 濃度處理組脅迫下8-OHdG含量均高于對照組；在脅迫10 d 時(shí)，0.15 mg/L 濃度組8-OHdG 含量最高；在脅迫15、30、45 d 過程中，隨著Phe 濃度的不斷增大，8-OHdG 含量先呈下降趨勢后呈上升趨勢；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 時(shí)，各濃度組含量仍高于對照組。

圖1 Phe脅迫下泥鰍肝臟MDA和8-OHdG含量的變化

2.2 Phe 脅迫下泥鰍肝臟SOD、CAT 活性及其基因表達(dá)的變化

Phe 脅迫對肝臟抗氧化酶活性及其基因表達(dá)的影響如圖2所示。由圖2A可知，與對照組相比，毒性脅迫15、30 d 時(shí)，低濃度組（0.15、1.33 mg/L）肝臟SOD 活性低于對照組，隨著脅迫濃度增大，SOD 活性逐漸增加；在脅迫45 d以及恢復(fù)馴養(yǎng)30 d時(shí)，中高濃度組（1.77、2.36、3.13 mg/L）SOD 活性顯著上升（P<0.01）；在脅迫45 d時(shí)，3.13 mg?L-1濃度組SOD活性最大；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d時(shí)，各濃度組SOD活性與脅迫15 d 時(shí)各濃度組活性相似但略高于脅迫初期。由圖2B 可知，與對照組相比，各濃度組Cu/Zn-SOD基因mRNA相對表達(dá)量均高于對照組；在脅迫15 d時(shí)，隨著脅迫濃度的不斷增加，中高濃度組（1.77、2.36、3.13 mg/L）Cu/Zn-sod相對表達(dá)量顯著上升（P<0.01），且脅迫45 d 時(shí)，中高濃度組Cu/Zn-SOD相對表達(dá)量均高于其他濃度組；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 時(shí)各濃度組Cu/Zn-SOD相對表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢。

圖2 Phe脅迫下泥鰍肝臟抗氧化酶活性及其基因表達(dá)的變化

由圖2C 可知，當(dāng)泥鰍分別脅迫15、30、45 d 時(shí)，隨著脅迫濃度的增加，各濃度組CAT 活性顯著上升（P<0.01），表現(xiàn)出一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)；脅迫45 d時(shí)，3.13 mg/L 濃度組CAT 活性最大；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d時(shí)，泥鰍肝臟CAT 活性仍隨脅迫濃度增大顯著上升（P<0.01），恢復(fù)馴養(yǎng)后CAT活性略低于毒性脅迫30、45 d，但仍高于對照組。由圖2D 可知，相較于對照組，各濃度組CAT3基因mRNA相對表達(dá)量均高于對照組，在低濃度脅迫下，泥鰍肝臟CAT3表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，中濃度組（3.13 mg/L）CAT3表達(dá)量呈顯著上升趨勢，恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 后，中低脅迫濃度組CAT3表達(dá)量呈顯著上升趨勢（P<0.01）；但低于45 d 各脅迫組。

2.3 Phe暴露對泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

Phe 暴露30 d 對泥鰍肝臟組織的影響如圖3 所示。由圖可知，毒性脅迫下泥鰍肝細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的變化，對照組泥鰍細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核較為清晰且位于各細(xì)胞中央呈圓球狀，肝細(xì)胞、紅細(xì)胞、肝板等其余細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見（圖3A、B）。與對照組相比，當(dāng)Phe 最低濃度脅迫時(shí)，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，細(xì)胞核溶解清晰可見（圖3C、D）；隨著脅迫濃度增大，細(xì)胞組織間隙增大，細(xì)胞核空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度壞死；（圖3E、F）Phe 處理最高濃度組較低濃度組損傷較為明顯，細(xì)胞核溶解和核偏移較為明顯，細(xì)胞間隙較對照組大（圖3G）。

2.4 Phe脅迫下泥鰍肝臟IBR指數(shù)

Phe 不同濃度組脅迫不同時(shí)間下，SOD、CAT、MDA、8-OHdG 4 個(gè)指標(biāo)的變化IBR 雷達(dá)圖如圖4所示。雷達(dá)圖面積代表著IBR 指數(shù)，與對照組相比，長時(shí)間脅迫下的雷達(dá)圖面積高于對照組，但不同處理組的圖形面積也存在較大差異；在毒性暴露15 d 時(shí)，高濃度組（2.36、3.13 mg/L）IBR 指數(shù)呈上升趨勢；毒性暴露15、45 d 時(shí)，0.15 mg/L 濃度組IBR 指數(shù)最大，在Phe 脅迫下，泥鰍肝臟IBR 指數(shù)總體表現(xiàn)為45 d>15 d>30 d；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 時(shí)，與對照組相比，各濃度處理組IBR 指數(shù)仍高于對照組，3.13 mg/L 濃度組IBR 指數(shù)最大。雷達(dá)圖中輻射線長度代表著各生物標(biāo)志物存在的組間差異，在Phe各濃度組中，5 個(gè)生物標(biāo)志物指標(biāo)組間差異較大，且Phe 脅迫下肝臟SOD、8-OHdG 活性所受的影響最大。

圖4 Phe脅迫下泥鰍肝臟IBR分析

3 討論

污染物可以在魚體誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激。這些氧化應(yīng)激反應(yīng)都是由于毒性作用使魚體的ROS 大量積累，這是一種特異性損傷也是魚類病害的普遍原因［5，10，17］。MDA 是衡量氧化脅迫程度的常用指標(biāo)之一。王汩等［4］在Phe 對長江上游魚類的毒性作用研究中發(fā)現(xiàn)，Phe 脅迫下，中華倒刺鲃肝臟中MDA含量隨Phe 濃度的增高而增高。在本研究中，不同濃度Phe 脅迫對泥鰍肝臟MDA 含量均高于對照組。出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這可能是由于Phe脅迫初期泥鰍表現(xiàn)出應(yīng)激性，泥鰍體內(nèi)ROS 積累，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害，自身清除能力受損并導(dǎo)致大量MDA 增加。在恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 后，泥鰍肝臟MDA含量略低于濃度處理組但仍高于對照組，說明恢復(fù)馴養(yǎng)可以減少泥鰍對污染物的吸收，但不能完全恢復(fù)機(jī)體的抗氧化能力。8-OHdG水平作為DNA損傷的生物標(biāo)志物已被應(yīng)用于評估DNA 損傷［18］。本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn)，高濃度多菌靈脅迫泥鰍后，8-OHdG 含量呈上升趨勢，恢復(fù)馴養(yǎng)下也呈上升趨勢［19］。在本研究中，Phe 脅迫泥鰍8-OHdG 活性短時(shí)間內(nèi)顯著升高，隨濃度的上升呈先下降后升高的趨勢，說明毒性脅迫引發(fā)了泥鰍DNA 損傷，恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 后8-OHdG 活性略有下降但遠(yuǎn)高于對照組，說明恢復(fù)馴養(yǎng)不能完全修復(fù)Phe 對DNA 造成的氧化損傷。

SOD 在解毒和維持體內(nèi)平衡的過程中起著不可或缺的作用，通過歧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基是生物體內(nèi)正常的代謝物。但是毒性作用下，自由基不斷積累使細(xì)胞膜因過氧化作用而裂變，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。SOD 活性及Cu/Zn-SOD的相對表達(dá)量的變化可在一定程度上反映機(jī)體清除ROS 的能力［20-21］。在本研究中SOD 酶活性在低濃度脅迫初期低于對照組。這可能是由于低濃度組誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)較弱，隨著染毒時(shí)間的延長以及毒性濃度的增加，Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量顯著升高、SOD活性升高，從而防止ROS 對肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的損害，這與徐文菊［22］的研究結(jié)果相似?；謴?fù)馴養(yǎng)30 d時(shí)，低濃度組SOD活性仍低于對照組，但中高濃度組毒性作用較濃度組略有下降但仍高于對照組，說明恢復(fù)馴養(yǎng)不能完全減少機(jī)體的氧化損傷。CAT通過催化H2O2降解為水（H2O）和O2，提供對ROS 衍生的氧化應(yīng)激的保護(hù)［23］。在本研究中，隨Phe 毒性脅迫時(shí)間和脅迫濃度的增加，泥鰍肝臟CAT 活性顯著上升。說明脅迫時(shí)間和脅迫濃度的增加會使泥鰍肝臟出現(xiàn)一定程度的氧化應(yīng)激，Phe 會促進(jìn)泥鰍肝臟CAT 酶的分泌，提高機(jī)體清除過氧化氫的能力，使機(jī)體免受H2O2的毒害。這一結(jié)果與先前研究類似，郭紅會［24］研究發(fā)現(xiàn)，亞慢性氨氮暴露可導(dǎo)致肝臟CAT 活性及基因CAT3的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性升高，從而降低氨誘導(dǎo)的活性氧代謝產(chǎn)物。在本研究中，經(jīng)過30 d 的恢復(fù)馴養(yǎng)后，機(jī)體的抗氧化水平有一定程度的恢復(fù)趨勢，但未能恢復(fù)到正常狀態(tài)，說明在恢復(fù)馴養(yǎng)后泥鰍肝臟體內(nèi)的毒性有部分減弱，但仍有殘留，機(jī)體仍發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化保護(hù)作用。兩種抗氧化酶活性及其基因的表達(dá)結(jié)果顯示，Phe 脅迫下兩種酶活性和基因表達(dá)呈正相關(guān)，表現(xiàn)出時(shí)間-劑量效應(yīng)，因此可就不同時(shí)間、劑量Phe脅迫對魚類的抗氧化酶活性及基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行深入研究。

肝臟是魚類自體代謝解毒的重要器官，肝組織結(jié)構(gòu)的變化可以反映污染物對魚類的氧化毒性作用。楊超超等［25］在Phe 對泥鰍肝臟毒性研究中發(fā)現(xiàn)，Phe 在肝臟中的累積量隨著毒性脅迫時(shí)間和濃度的增大而增強(qiáng)，低濃度組出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象，隨毒性增強(qiáng)，肝細(xì)胞核溶解、細(xì)胞空泡化等現(xiàn)象明顯；宋楚心［26］在全氟己磺酸對斑馬魚的肝臟毒性研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，染毒組細(xì)胞排列緊密，肝細(xì)胞膜不清晰，有消失的趨勢，肝細(xì)胞核溶解等現(xiàn)象較為明顯。本研究觀察到，30 d 時(shí)泥鰍肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核偏移、細(xì)胞核溶解現(xiàn)象，隨著脅迫時(shí)間增加，高濃度組也出現(xiàn)了部分細(xì)胞壞死，說明一定劑量的Phe 脅迫會導(dǎo)致泥鰍肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常。這可能是由于Phe 暴露時(shí)間過長，肝臟產(chǎn)生氧化毒性和DNA 損傷逐漸演變?yōu)榧?xì)胞損傷。這與BRANDTS等［27］的研究結(jié)果相似。

SOD、CAT、MDA 和8-OHdG 作為機(jī)體環(huán)境脅迫下的重要生物標(biāo)志物，可以通過IBR 指數(shù)對毒性暴露下生物的毒性效應(yīng)進(jìn)行簡明全面的評估［28］。在評估砷酸鹽和全氟辛烷磺酸對蚯蚓聯(lián)合毒性效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)或聯(lián)合暴露的高劑量組表現(xiàn)出的IBR 值更高，表明綜合毒性應(yīng)激隨著暴露水平的增加而增加［29］。本研究中，Phe 脅迫下泥鰍肝臟IBR 指數(shù)在最長時(shí)間45 d 下高于對照組，說明綜合應(yīng)激水平隨著Phe 的暴露時(shí)間不斷增加；在脅迫后期高濃度組的IBR 值最大，說明高濃度組在毒性暴露過程中的生物累積性較高；恢復(fù)馴養(yǎng)30 d 后，Phe各濃度組IBR指數(shù)有降低，但仍高于對照組，說明一定劑量的Phe長期脅迫對泥鰍的氧化損傷有一定程度逆轉(zhuǎn)，但并不能完全恢復(fù)正常。

4 結(jié)論

考察了菲脅迫對泥鰍肝臟氧化毒性及可逆性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定劑量Phe 對泥鰍肝臟MDA、8-OHdG 含量、SOD、CAT 活性、Cu/Zn-SOD、CAT3基因mRNA 表達(dá)量有明顯誘導(dǎo)作用?；謴?fù)馴養(yǎng)30 d 后，其含量和氧化毒性不能完全恢復(fù)正常狀態(tài)。Phe 對30 d 泥鰍肝臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷效應(yīng)，其中脅迫濃度越大，肝臟損傷越嚴(yán)重。