模擬增溫對木荷葉際抗生素抗性基因的影響

林小如,李子歆,孫安琪,金圣圣,徐超蝶,陳仕東,2,劉小飛,2,沈菊培*

模擬增溫對木荷葉際抗生素抗性基因的影響

林小如1,李子歆1,孫安琪1,金圣圣1,徐超蝶1,陳仕東1,2,劉小飛1,2,沈菊培1*

(1.福建師范大學濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點實驗室培育基地,福建師范大學地理科學學院/碳中和未來技術(shù)學院,福建 福州 350007；2.福建三明森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站,福建 三明 365002)

為探究增溫對葉際抗生素抗性基因(ARGs)分布的影響及其季節(jié)變化特征,本研究在夏季、秋季和冬季3個季節(jié)采集木荷葉片樣品,設(shè)置對照(土壤不增溫)與增溫(土壤增溫4℃)兩個處理,采用高通量熒光定量PCR技術(shù)測定葉際ARGs的種類及相對豐度.結(jié)果表明:在所有葉際樣品中共檢測到255種ARGs和10種MGEs,其中多重耐藥類是葉際優(yōu)勢抗生素抗性基因類型,相對豐度占總體的47.4%,而抗生素外排泵為主要抗性機制.方差分析和主坐標分析表明季節(jié)對葉際抗性基因的分布有顯著影響,秋季和冬季葉際ARGs的相對豐度分別為(0.614±0.303)拷貝/16S rRNA和(0.589±0.218)拷貝/16S rRNA,高于夏季((0.291±0.101)拷貝/16S rRNA),且ARGs多樣性同樣表現(xiàn)為秋冬季高于夏季.研究檢測到7種抗性基因(2-03-02-01-01-02)的相對豐度在增溫處理中顯著下降(<0.05),而僅有-01基因相對豐度顯著上升(<0.05).冗余分析和結(jié)構(gòu)方程模型顯示,季節(jié)通過改變土壤理化性質(zhì)間接影響葉際ARGs的分布,而增溫對其沒有產(chǎn)生顯著影響.

抗生素抗性基因；季節(jié)變化；植物葉際；全球氣候變化

抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用對提高人類健康和壽命有非常重要的作用,但近年來由于其在醫(yī)療、畜牧養(yǎng)殖中的濫用,導致大量抗生素耐藥菌的出現(xiàn),引起社會對抗生素及抗生素抗性基因(ARGs)的重視和關(guān)注[1-2].由于微生物的內(nèi)在抗性,土壤環(huán)境中本身就存在大量ARGs[3].通過對我國跨域近4000km天然森林生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)[4],森林土壤中存在8個大類共計160余種ARGs,且ARGs多樣性與草本植物多樣性、細菌多樣性及可移動遺傳元件(MGEs)多樣性顯著相關(guān).另外,環(huán)境中的ARGs可借助MGEs,如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等在同種甚至不同種細菌之間實現(xiàn)水平基因轉(zhuǎn)移(HGT),從而加快了ARGs的傳播和擴散,對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在的危害,故ARGs被認為是一種新型的生物污染物[5].因此,認識和探究ARGs的分布及其對環(huán)境變化的響應(yīng)對保護生態(tài)環(huán)境和人類健康具有重要作用.

葉際由植物地上部分組成,以葉片為主[6].據(jù)估計,全球植物葉表面積達108km2,每km2包含細菌數(shù)量超過1016[6-7].葉際微生物是環(huán)境中ARGs的重要儲存庫[3,8-9].通過對比分析不同來源的生菜葉片ARGs[10],共檢測到134種ARGs和6種MGEs,其絕對拷貝數(shù)達1.76×108.葉際是一個相對開放的生境,與土壤、大氣等外界環(huán)境緊密聯(lián)系.攜帶ARGs的土壤微生物可通過根內(nèi)-葉內(nèi)-葉際的植物體內(nèi)途徑進行轉(zhuǎn)移,也能借助大氣氣溶膠以植物體外遷移途徑到達葉表[11-12].同時,宿主植物周圍的環(huán)境因子,包括溫度、太陽輻射、濕度、土壤類型等非生物因素,以及植物種類和基因型、對資源分泌物(如初級和次級代謝產(chǎn)物)的適應(yīng)性等生物因素,也會影響葉際微生物的組成[6,13].例如,植物葉片在生長過程會釋放揮發(fā)性有機物(VOCs),其中萜烯類VOCs具有抗菌作用,可能會抑制葉際細菌活性[14-15].微生物群落結(jié)構(gòu)是ARGs組成的決定因素,因此環(huán)境因子會通過葉際微生物對葉際ARGs產(chǎn)生影響.由此可見,葉際ARGs種類豐富,相對豐度高,且易受外界環(huán)境的影響,具有潛在的風險[9].目前已有大量的研究報道農(nóng)作物葉際ARGs的賦存情況,但對受人類影響較小的森林生態(tài)系統(tǒng)樹木葉際ARGs的分布還知之甚少[8].

據(jù)IPCC預計到21世紀末,全球平均氣溫將上升2.6～4.8 ℃[16].氣候變暖作為全球氣候變化的一個主要特征,對元素循環(huán)和陸地生態(tài)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生重要影響[17],進而改變植物群落組成和葉際微生物組[13].一方面,增溫會改變植物根系營養(yǎng)吸收狀況,影響葉際微生物組成,使其攜帶的ARGs可能發(fā)生改變.另一方面,增溫會直接影響微生物的生長速率和群落結(jié)構(gòu)[18-19],提高水平基因轉(zhuǎn)移風險[20].因此,增溫會直接或間接地影響葉際ARGs 組成.有研究發(fā)現(xiàn)土壤增溫4℃將導致部分天然林和人工林土壤ARGs相對豐度顯著增加[21].另有研究采用黃河水進行室內(nèi)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)ARGs的豐度隨著溫度升高而增加[22].然而,目前僅有關(guān)于增溫對土壤和水體ARGs影響的研究[21-22],卻鮮有關(guān)注增溫對葉際ARGs多樣性和豐度的報道.除了溫度外,季節(jié)變化也被認為是影響葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[23-24].因此,研究季節(jié)變化對ARGs的影響,可以更加全面地了解增溫背景下抗生素抗性組的分布和變化特征.

亞熱帶森林是我國典型的森林生態(tài)系統(tǒng),具有重要的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能,對全球變暖的響應(yīng)十分敏感[25].木荷()作為亞熱帶常綠闊葉林中分布最為廣泛的優(yōu)勢樹種之一,具有重要生態(tài)和經(jīng)濟價值,在我國南方林業(yè)和亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位.因此,本文依托福建省三明市長期土壤增溫實驗平臺,以亞熱帶天然林木荷葉片為研究對象,運用高通量熒光定量PCR技術(shù)分析增溫對葉際ARGs豐度和多樣性的影響及季節(jié)變化特征,同時分析環(huán)境因子對ARGs組成的影響,為闡明氣候變暖情景下環(huán)境ARGs的傳播擴散機制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究地概況與實驗設(shè)計

試驗區(qū)位于福建三明森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站的格氏栲天然林增溫平臺(26?9?～26?12?N,117?27?～117?29?E).該地區(qū)地貌以低山丘陵為主,海拔250～500m,屬中亞熱帶型季風氣候,年均溫19.5 ℃,年均降水量1700mm.增溫平臺試驗地的相對濕度為81%.研究區(qū)內(nèi)以黃崗巖發(fā)育的黃壤和紅壤為主.植被類型屬亞熱帶常綠闊葉林,主要為格氏栲(),其他樹種包括米櫧()、木姜子()、木荷()、杜英()等.

研究于2014年10月在格氏栲天然林隨機設(shè)置10個6m×6m的試驗樣地,設(shè)增溫(+4 ℃)和對照(不增溫)兩種處理,每種處理5個重復.土壤增溫處理,在樣地地面以下10cm處鋪設(shè)平行電纜進行加熱,相鄰電纜的距離為20cm[21].同時在每個樣地布設(shè)多個溫度和濕度傳感器來監(jiān)測不同土層的土壤溫、濕度的變化.增溫平臺樣地于2015年10月開始增溫,期間盡量減少外來擾動對土壤的影響.

1.2 樣品采集與處理

分別于2019年7月(夏季)、2019年10月(秋季)、2020年1月(冬季)在每個樣地中采集葉際與土壤樣品.每個樣地隨機選取幾棵長勢一致的木荷,在同一高度處(距地面1.4～1.6m,避免高度過低受到土壤影響),剪取20g成熟葉片放入自封袋中[26],同一樣地葉片混合為一個葉際樣品.同時,每個樣地用直徑5cm的土芯取樣器隨機取5點采集0～15cm的表層土壤,同一樣地的5份土壤混合成一個土樣.葉際樣品和土壤樣品均在冰盒中運送至實驗室.葉際樣品保存于-20℃的冰箱用于DNA提取.土壤樣品過 2mm篩,4℃保存用于理化性質(zhì)分析.

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量用烘干法測定.土壤pH值(土水比為1:5)用pH計(FE20Mettler Toledo,德國)測定.土壤銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)用2mol/L的KCl進行浸提(土水比為1:4),振蕩離心后通過0.45 μm濾膜用連續(xù)流動分析儀(Skalar San++,荷蘭Skalar)測定.土壤微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法,再分別用總有機碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,日本Shimadzu)和連續(xù)流動分析儀(Skalar San++,荷蘭Skalar)測定.土壤總氮(TN)和總碳(TC)使用碳氮元素分析儀(Vario MAX C / N,德國Elementar)測定.土壤可溶性有機碳(DOC)和可溶性有機氮(DON)用去離子水(土水比為1:4)浸提,分別用總有機碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,日本Shimadzu)和連續(xù)流動分析儀(Skalar San++,荷蘭Skalar)測定.土壤理化性質(zhì)的詳細信息見表1[21].

1.4 葉際DNA提取

將5g木荷葉片剪碎后置入250mL錐形瓶,加入100mL滅菌磷酸緩沖鹽溶液,超聲5min,然后置于搖床中180r/min振蕩1h后取出[10].用滅菌紗布過濾出植物組織,濾液全部通過0.22 μm濾膜.剪碎濾膜后用FastDNA Spin試劑盒(美國MP Biomedicals)提取植物葉際 DNA,并用紫外分光光度計ND-1000測定DNA濃度及純度,儲存于-20℃冰箱備用.

1.5 ARGs與MGEs的高通量熒光定量PCR分析

利用WaferGen SmartChip Real-time PCR Systems高通量熒光定量PCR分析平臺測定天然林葉際微生物所攜帶的ARGs與MGEs多樣性(即檢測到的靶基因數(shù)目)和豐度.PCR過程中設(shè)置296對引物,包括285個環(huán)境中廣泛存在的ARGs(涵蓋9類常見抗生素:氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽霉素B類、磺胺類、四環(huán)素類、萬古霉素類、多重耐藥類和其他類)、10個MGEs基因(2個整合子基因、8個轉(zhuǎn)座子基因)和1個16S rRNA基因.WaferGen平臺一次可進行5184個反應(yīng),每個PCR反應(yīng)100nL.PCR反應(yīng)體系為: 25μL TB Green Premix Ex TaqII,前后引物各0.4μL, DNA模板1μL,RNA-free water 0.7μL.熱循環(huán)過程: 95℃預變性10min;95℃變性30s,60℃退火延30s,共40個循環(huán).T值為PCR反應(yīng)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù).根據(jù)儀器的檢測限和靈敏度,設(shè)置T值的檢測閾值為31.每個樣品包含3個技術(shù)重復,3次重復T值均小于31時認為是陽性擴增.

采用2-?CT法計算每個樣品中ARGs和MGEs的相對豐度,其中ΔT=(T detected ARGs-T 16S rRNA gene)[27].

1.6 數(shù)據(jù)分析與繪圖

采用重復測量方差分析以探究季節(jié)和增溫處理及其交互作用對葉際ARGs的影響.利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較檢驗不同季節(jié)及各處理之間ARGs的差異.利用Levene′s法檢驗方差齊性,方差齊性時使用鄧肯法進行多重比較,方差不齊時則使用塔姆黑尼T2進行多重比較.使用獨立樣本檢驗分析增溫處理對于ARGs亞型的影響.上述統(tǒng)計檢驗均在SPSS 26中進行.冗余分析(RDA)和主坐標分析(PCoA)分別采用R 4.2.2的vegan軟件包的rda函數(shù)和pcoa函數(shù)進行.結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)使用AMOS 25 生成,其中數(shù)據(jù)包括增溫處理(設(shè)置為種類變量,對照處理為0,增溫處理為1)、季節(jié)因素(采用采樣月平均溫度)、土壤理化性質(zhì)(選取10個土壤理化性質(zhì)指標的主坐標分析第一主成分作為結(jié)構(gòu)方程模型分析數(shù)據(jù))、MGEs及ARGs的相對豐度.合格模型需滿足以下標準:(1)非顯著性2檢驗:>0.05;(2)近似誤差均方根RMSEA<0.08;(3)擬合優(yōu)度指數(shù)GFI>0.9;(4)比較擬合指數(shù)CFI>0.9.應(yīng)用Origin 2021繪制餅圖、柱狀圖與箱線圖,采用R 4.2.2進行主坐標分析和冗余分析可視化.

表1 不同處理土壤基本理化性質(zhì)和月平均溫度的季節(jié)差異[21]

2 結(jié)果與分析

2.1　葉際ARGs和MGEs多樣性和豐度

采用高通量定量PCR技術(shù),在木荷葉際樣品中共檢測到255種ARGs和10種MGEs,表明ARGs在受人類干擾較少的自然環(huán)境中廣泛存在.如圖1(a)所示,各樣本中檢測到的ARGs數(shù)量范圍為77～115種,其中多重耐藥類(48種)和β-內(nèi)酰胺類(47種)的數(shù)量最多,其他數(shù)量較高的ARGs包括MLSB類(42種)、氨基糖苷類(32種).在相對豐度組成方面,9類ARGs中相對豐度占比較高的為多重耐藥類(47.4%)、β-內(nèi)酰胺類(20.3%)和氨基糖苷類(11.8%)(圖1b),表明多重耐藥類ARGs為葉際優(yōu)勢ARGs類型.ARGs主要抗性機制包括:抗生素失活機制(104種)、抗生素外排泵機制(78種)、細胞核糖體保護機制(64種),其中抗生素外排泵的相對豐度最高(52.8%)(圖1c,d),在ARGs的抗性機制中占主導地位,其次為抗生素失活機制(35.6%).

圖1 不同種類的ARGs多樣性、相對豐度占比和不同抗生素抗性機制的多樣性、相對豐度占比

ARGs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移主要由MGEs介導.在檢測到的10種MGEs中,包含2個整合子基因()和8個轉(zhuǎn)座子基因().整合子基因的相對豐度占比達97%,其次為整合子基因(2%),這表明基因在MGEs中具有絕對優(yōu)勢地位.

2.2 不同季節(jié)與增溫處理對于 ARGs 與 MGEs 多樣性及豐度的影響

總體上看,冬季木荷葉際ARGs數(shù)量顯著高于夏季(0.05),秋季和冬季ARGs相對豐度顯著高于夏季(0.05),而MGEs數(shù)量和相對豐度在不同季節(jié)間均無顯著差異(0.05)(圖2),說明季節(jié)對ARGs的影響較大.同一季節(jié)不同處理間,秋季增溫ARGs相對豐度顯著低于對照(0.05),而夏季MGEs數(shù)量則表現(xiàn)為增溫顯著高于對照(0.05).

圖2 不同季節(jié)與處理葉際中ARGs和MGEs的多樣性、相對豐度

表2 重復測量方差分析季節(jié)、增溫對ARGs和MGEs的多樣性和相對豐度的影響

注:表中加粗數(shù)字和*表示<0.05.

具體來說,對照處理葉際磺胺類ARGs數(shù)量、萬古霉素類ARGs相對豐度及整合子類MGEs數(shù)量均表現(xiàn)為秋季顯著高于夏季(<0.05),-內(nèi)酰胺類ARGs相對豐度為冬季顯著高于夏季(<0.05).而增溫處理葉際氨基糖苷類ARGs數(shù)量冬季顯著高于夏季和秋季(0.05),整合子類MGEs數(shù)量在夏季和冬季顯著高于秋季(0.05).大部分ARGs的數(shù)量和相對豐度在同一季節(jié)不同處理間無顯著差異(>0.05),僅秋季四環(huán)素類ARGs相對豐度的增溫顯著低于對照(<0.05).在MGEs中,夏季整合子類數(shù)量的增溫顯著高于對照(<0.05),但其秋季的增溫顯著低于對照(<0.05).這意味著增溫對MGEs的作用會受到季節(jié)影響.

重復測量方差分析結(jié)果顯示,季節(jié)對ARGs數(shù)量和相對豐度產(chǎn)生了顯著影響(<0.05),而增溫對MGEs數(shù)量有顯著影響(<0.05)(表2).另外,季節(jié)與增溫的交互作用對ARGs及MGEs的數(shù)量和相對豐度均無顯著影響(>0.05).基于ARGs相對豐度進行主坐標分析(PCoA)(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn)主成分PC1和PC2對ARGs分布變異的解釋分別為25.6%和12.8%.從圖中可以看出不同季節(jié)葉際ARGs有明顯差異(Adonis test,<0.001),主要表現(xiàn)在夏季和其他兩個季節(jié)間的差異,而對照和增溫處理之間則差異不顯著(Adonis test,>0.05).

進一步對所有 ARGs 亞型的相對豐度進行獨立樣本t檢驗,發(fā)現(xiàn)8 種ARGs在對照和增溫處理之間相對豐度差異顯著(<0.05),表明其對溫度變化較為敏感(圖4).這8種ARGs亞型分別屬于多重耐藥類、氨基糖苷類、MLSB類和四環(huán)素類.其中,僅在增溫處理下顯著富集(<0.05),其余7種 ARGs亞型(包括)的相對豐度則在增溫處理下顯著下降(<0.05),說明增溫對不同種類ARGs的影響存在差異.

圖3 基于Bray-Curtis距離的不同季節(jié)和處理的ARGs主坐標分析

三角形為增溫處理,正方形為對照

圖4 對溫度敏感的葉際ARGs亞型的對照和增溫處理的相對豐度

2.3 環(huán)境因子對ARGs的影響

為探究不同因子對木荷葉際ARGs的影響,本文將土壤理化性質(zhì)、MGEs、月平均溫度與ARGs相對豐度進行spearman相關(guān)性分析.結(jié)果表明總ARGs數(shù)量、總ARGs相對豐度與DOC分別呈顯著(<0.05)和極顯著正相關(guān)(<0.01),而總ARGs數(shù)量、總ARGs相對豐度與SMC、DON、MBN、MMT呈顯著(<0.05)或極顯著負相關(guān)(<0.01)(表3),并分別與MBC、pH值呈極顯著負相關(guān)(<0.01).這意味著總ARGs數(shù)量和相對豐度受到多種環(huán)境因子的影響.不同季節(jié)中,夏季ARGs相對豐度與pH值呈顯著負相關(guān)(<0.05).秋季、冬季ARGs數(shù)量與DON呈顯著(<0.05)和極顯著負相關(guān)(<0.01).冬季ARGs相對豐度與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、TN和TC顯著正相關(guān)(<0.05).說明不同季節(jié)ARGs的主要影響因子不同.在所有環(huán)境因子中,僅MGEs與ARGs各種指標均無顯著關(guān)系,可能是因為季節(jié)對MGEs的影響不顯著.

選取主要土壤性質(zhì)、月平均溫度和MGEs與ARGs相對豐度進行冗余分析.由圖5可得,第1和第2排序軸分別解釋了葉際ARGs組成分布差異的25.77%和17.91%.夏季ARGs與秋季、冬季ARGs沿第1排序軸明顯分開.影響ARGs組成的主要環(huán)境因子為DON、DOC、MBN和MMT,而pH值、MGEs和銨態(tài)氮的影響較小.

表3 ARGs數(shù)量、相對豐度與環(huán)境因子的spearman相關(guān)系數(shù)

注: * 和加粗數(shù)字表示<0.05, ** 表示<0.01.

圖5 環(huán)境因子與ARGs的冗余分析

三角形表示增溫處理,正方形為對照

采用結(jié)構(gòu)方程模型進一步解釋季節(jié)、增溫處理、土壤理化性質(zhì)與MGEs對ARGs作用的效應(yīng)(圖6).為了降低模型的復雜性,使用2001～2019年三明1月、7月和10月的月平均溫度(分別為10 ,29 ,22 ℃)代表季節(jié)因子,且對土壤理化性質(zhì)進行主坐標分析并提取第一主成分作為SEM分析的土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù).土壤理化性質(zhì)第一主成分解釋總變異的48.29%,因此提取的變量能較好地反映相關(guān)數(shù)據(jù)的貢獻.最終SEM解釋了葉際ARGs變化的29.2%.通過模型計算和評估,結(jié)果顯示模型參數(shù)為= 1.00,GFI = 1.00,CFI = 1.00,RMSEA = 0.00,表明所建的結(jié)構(gòu)方程模型較為可靠.在4個環(huán)境因子中,對 ARGs 影響最大的因素為季節(jié)因素,對ARGs具有間接的負效應(yīng).其次為土壤理化性質(zhì),對ARGs的影響主要為直接正效應(yīng).模型的所有路徑中僅季節(jié)因素對土壤理化性質(zhì)具有極顯著負作用(<0.01),其余路徑作用效果不顯著.這意味著季節(jié)因素可能通過土壤理化性質(zhì)而間接影響葉際ARGs組成.MGEs對ARGs的影響為直接正效應(yīng).增溫處理對ARGs的影響為直接負效應(yīng),與月平均溫度和總ARGs數(shù)量、相對豐度呈極顯著負相關(guān)一致.

圖6 結(jié)構(gòu)方程模型解析不同因子對ARGs分布的影響

虛線箭頭表示路徑系數(shù)為正, 實線箭頭表示路徑系數(shù)為負, *表示路徑系數(shù)顯著(<0.05)

3 討論

3.1 葉際ARGs的多樣性和相對豐度

以往關(guān)于土壤-植物系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)土壤比葉際含有更豐富的ARGs和MGEs種類[11,28–30],而在本研究亞熱帶天然林木荷葉際上檢測到255種ARGs和10種MGEs,說明亞熱帶天然林中葉際ARGs的多樣性比土壤豐富[21].Do等[31]同樣發(fā)現(xiàn)草地植物葉際ARGs、MGEs和細菌多樣性比土壤高,表明葉際ARGs組成受多種因子的影響[12].本研究葉片采集高度為1.4～1.6m之間,取成熟的中間層葉片,采樣部位能有效避免來自土壤顆粒的影響.此外,有學者認為在貧營養(yǎng)環(huán)境中,微生物是通過釋放抗生素裂解敏感菌株而獲得到營養(yǎng),為生存提供了物質(zhì)[32].植物葉際生存條件苛刻,葉際微生物不僅面臨水分、營養(yǎng)物質(zhì)不足、劇烈變化的強光、高溫和高紫外線照射等問題,還要面對植物或其他微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)[6].因此,葉際微生物在惡劣的葉際環(huán)境會釋放更多的抗生素,增加環(huán)境對ARGs的選擇壓力,導致葉際ARGs多樣性較高.本研究中,葉際ARGs的優(yōu)勢抗性基因種類為多重耐藥類,這與已有研究一致[12,33-34].需要注意的是,攜帶多重耐藥類基因的微生物會對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性從而成為超級細菌,對人類健康造成嚴重威脅.在抗性機制方面,抗生素外排泵類和抗生素失活類的ARGs(共計88.4%)占主導地位,這可能是因為外排泵在排除抗生素的同時排出重金屬和其他有毒分子,從而有助于微生物更好地適應(yīng)不利環(huán)境條件[35].在大多數(shù)情況下,它是土壤中主要的抗性機制[12],而抗生素失活機制是細菌通過對抗生素的降解或取代活性基團來改變抗生素的結(jié)構(gòu),使抗生素失活.其中,產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶使β-內(nèi)酰胺類抗生素失活是細菌耐藥的最常見和最重要的機制,而在本研究中β-內(nèi)酰胺類ARGs相對豐度占比達20.3%的研究結(jié)果也佐證了以上推測.已在各種環(huán)境中被頻繁檢出,人類活動(如醫(yī)院污水、工業(yè)污染等)可導致大量的釋放,因此與人類活動緊密相關(guān)[36-37].本文發(fā)現(xiàn)基因豐度占所測的10種MGE的97%,這意味天然林植被ARGs具有較高的傳播潛力[8].在One Health視角下,不僅要制定防止ARGs在人類活動場所中傳播的對策,還需要研究控制抗性基因在野外傳播擴散的措施,這對人類和動物的健康具有重要影響[3,38].

3.2 增溫對ARGs分布的影響

隨著抗生素耐藥性問題的日漸嚴重及全球氣候的持續(xù)變化,人們越來越關(guān)注這兩個全球性問題之間的潛在聯(lián)系.已有研究發(fā)現(xiàn)氣溫升高與人類常見病原體的抗生素耐藥性上升和抗生素耐藥率增加相關(guān)[39-40].然而本研究發(fā)現(xiàn),增溫對葉際總ARGs的多樣性和相對豐度無顯著影響,但月平均溫度與總ARGs數(shù)量和相對豐度呈極顯著負相關(guān).這可能是因為葉際溫度主要受大氣溫度影響[41],土壤增溫對植物葉際ARGs的直接影響較小.研究中增溫對MGEs數(shù)量有顯著影響,ARGs與MGEs并無顯著相關(guān).這表明增溫并未通過影響MGEs進而影響ARGs.本文前期關(guān)于增溫對土壤ARGs和MGEs的研究中也得到類似的結(jié)果[21].同時,發(fā)現(xiàn)不同種類ARGs對溫度的響應(yīng)不同.大部分ARGs亞型的對照與增溫處理間無顯著差異.在檢測到的255種ARGs中,僅7 種 ARGs亞型(包括和)的相對豐度在增溫處理下顯著降低,基因則在增溫處理下顯著富集.Yu等[22]和Yang等[42]通過宏基因組測序技術(shù)探究黃河水ARGs對系列溫度梯度(23,26,29,32,35℃)的響應(yīng),同樣發(fā)現(xiàn)少量ARGs和MGEs對溫度變化較為敏感,但增溫會導致某些高風險ARGs豐度上升.Li等[21]前期研究也發(fā)現(xiàn)增溫使8種天然林土壤ARGs亞型的相對豐度顯著上升.這可歸因于攜帶ARG微生物的熱敏感性不同.增溫會導致更適應(yīng)環(huán)境變化的細菌類群數(shù)量增多[19],或影響細胞膜的通透性,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性和代謝酶失活,導致一些敏感微生物無法生存[22],從而改變?nèi)~際細菌群落組成.亞熱帶木荷葉際細菌門水平上,變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門的豐度較高[43],且研究表明增溫處理導致放線菌門的相對豐度顯著增加,變形菌門的相對豐度顯著減少[19].因此在木荷葉際中,增溫可能通過改變不同類型ARGs宿主菌豐度使相應(yīng)ARGs的豐度上升或下降.必須注意的是,葉際微生物中人類病原體、動物寄生蟲或共生體等功能分組的相對豐度則在增溫處理下顯著增加[19].這將增加ARGs進入人類或動物致病菌的風險,所以我們?nèi)匀徊豢珊鲆曉鰷貤l件下ARGs對人類健康的影響.盡管已有一些研究發(fā)現(xiàn)增溫會影響樹木葉片生理特征,進而影響葉際微生物,而對ARGs產(chǎn)生潛在的影響[44-46],然而,迄今尚缺乏直接證據(jù)證明增溫可以通過影響宿主植物的生理狀態(tài)而間接影響葉際ARGs的組成,相關(guān)內(nèi)容有待未來進一步研究.總之,溫度對于ARGs的作用是一個復雜的過程,具體影響機制還需要深入研究和探討,以便更好應(yīng)對全球變暖情境下的抗生素耐藥問題.

3.3 季節(jié)對ARGs的影響

方差分析和PCoA結(jié)果表明,葉際ARGs的組成具有季節(jié)性差異,具體表現(xiàn)為冬季和秋季ARGs的多樣性和相對豐度高于夏季.微生物群落結(jié)構(gòu)是ARGs組成變化的重要驅(qū)動因素,葉際ARGs的季節(jié)差異性可能源于植物葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)動態(tài)變化[23-24].這種季節(jié)動態(tài)受到溫度、太陽輻射、水分可利用性等環(huán)境因素,與植物生長過程中產(chǎn)生的碳水化合物、有機酸、揮發(fā)性有機物等影響[6,41,47]. Pe?uelas等[48]報道,在地中海夏季惡劣環(huán)境條件下,葉際細菌和真菌群落的豐富度和均勻度低于春季.研究發(fā)現(xiàn)木荷枝葉VOCs以萜烯類化合物為主,秋季的萜烯類化合物的總相對含量較低[49].因此,夏季較高的溫度與釋放較多的萜烯類VOCs,可能導致葉際細菌多樣性下降,降低了夏季葉際的ARGs多樣性和相對豐度.

除生物因素外ARGs 也會受到環(huán)境因子的直接影響.例如水庫中的 ARGs 的豐度和總基因拷貝數(shù)與水質(zhì)富營養(yǎng)元素TN,TP,TOC和重金屬含量顯著相關(guān)[50-51].土壤的鹽濃度,pH 值以及營養(yǎng)狀況的改變會使細菌群落發(fā)生變化并且進一步影響抗生素耐藥性[52-53].Li等[21]利用隨機森林模型發(fā)現(xiàn)DOC和銨態(tài)氮是預測土壤ARGs組成變化主要的非生物因子.本研究也發(fā)現(xiàn),總ARGs數(shù)量和相對豐度與多個土壤理化指標顯著相關(guān),且冗余分析表明DON、DOC和MBN是主要預測因子.當環(huán)境因素季節(jié)變化將會導致ARGs的季節(jié)性變化[54].本研究中,夏季ARGs相對豐度與pH值呈顯著負相關(guān),而秋冬季ARGs數(shù)量與DOC呈顯著負相關(guān).且冬季ARGs相對豐度與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、TC和TN呈顯著正相關(guān).可能是因為夏季ARGs受到pH值影響,而秋冬季ARGs受到養(yǎng)分因子限制.賈世杰等[55]同樣發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)影響ARGs的主導環(huán)境因子不同,風速和溫度是影響冬季氣溶膠ARGs組成最重要的因素,春季氣溶膠中ARGs的分布則主要受到溫度和濕度的影響.結(jié)構(gòu)方程模型進一步證明季節(jié)因素通過改變土壤環(huán)境因子而對葉際ARGs產(chǎn)生間接影響.

因此,季節(jié)變化可以通過生物和非生物等多種途徑對ARGs產(chǎn)生直接或間接的影響,使得ARGs呈現(xiàn)季節(jié)動態(tài)變化.本研究結(jié)果表明,冬季木荷葉際ARGs多樣性和相對豐度較高.Sun等[56]研究發(fā)現(xiàn)冬季是人們大量使用抗生素如青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類的季節(jié)高峰.因此,冬季環(huán)境中較高的ARGs多樣性和豐度可能會削減臨床上抗生素的治療效果,是人類健康的重大隱患.全球氣候變化將會影響四季更替,這可能會對植物微生物群落的組成以及植物抗性組產(chǎn)生重大影響[57].故需深入研究增溫背景下葉際ARGs的季節(jié)變化,為緩解全球耐藥問題提供更多信息.

4 結(jié)論

4.1 在天然林木荷葉際中檢測到255種ARGs和10種MGEs,其中多重耐藥類為優(yōu)勢ARGs類型(相對豐度占比47.4%),抗生素外排泵為主要抗性機制(相對豐度占比52.8%).MGEs中占據(jù)絕對優(yōu)勢地位(相對豐度占比97%).ARGs與MGEs之間無顯著相關(guān)(>0.05).

4.2 木荷葉際ARGs的組成具有季節(jié)性差異,表現(xiàn)為ARGs多樣性和相對豐度在秋季(93.5種,0.614±0.303拷貝/16S rRNA)、冬季(101.4種,(0.589±0.218)拷貝/16S rRNA)較夏季(87.2種,(0.291±0.101)拷貝/ 16S rRNA)高.季節(jié)因子主要通過改變土壤理化性質(zhì)(DON、DOC、MBN)間接影響葉際ARGs的組成.

4.3 增溫導致acrA-01基因相對豐度顯著上升(<0.05),7種抗性基因(2-03、-02、、/、-01、-01、-02)的相對豐度顯著下降(<0.05).

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Effect of stimulated warming on phyllosphere antibiotic resistance genes of.

LIN Xiao-ru1, LI Zi-xin1, SUN An-qi1, JIN Sheng-sheng1, XU Chao-die1, CHEN Shi-dong1,2, LIU Xiao-fei1,2, SHEN Ju-pei1*

(1.State Key Laboratory for Subtropical Mountain Ecology of the Ministry of Science and Technology and Fujian Province, School of Geographical Sciences/School of Carbon Neutrality Future Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China；2.Fujian Sanming Forest Ecosystem National Observation and Research Station, Sanming 365002, China)., 2023,43(12)：6689～6699

To understand the effect of warming on the distribution and seasonal dynamics of antibiotic resistance genes (ARGs) in the phyllosphere, we conducted a study involving collection of foliar samples from natural forest leaves during summer, autumn and winter from two treatments: control and warming (+4℃). The numbers and relative abundance of ARGs in the phyllosphere were determined by high-throughput quantitative PCR. Results showed that a total of 255 ARGs and 10 MGEs were detected in all phyllosphere samples, among which multidrug resistance was the dominant gene type in the phyllosphere, accounting for 47.4% of the total. The antibiotic efflux pump was the main resistance mechanism. ANOVA analysis and principal coordinate analysis showed that season significantly influenced the distribution of phyllosphere ARGs. The relative abundance of phyllosphere ARGs in autumn and winter was (0.614 ± 0.303)copies/16S rRNA and (0.589 ± 0.218)copies/16S rRNA, respectively, which was higher than that in summer ((0.291 ± 0.101)copies/16S rRNA), and the diversity of ARGs in autumn and winter was also higher than that in summer. We found that the relative abundance of seven ARGs(2-03,-02,,/,-01,-01,-02) decreased significantly (<0.05), while the relative abundance of the-gene increased significantly (<0.05) in the warming treatment. Redundancy analysis and structural equation modeling showed that seasonality was the main factor driving the composition of phyllosphere ARGs via mediating soil physicochemical properties, while warming had no significant effect.

antibiotic resistance genes；seasonal variation；plant phyllosphere；global climate change

X713

A

1000-6923(2023)12-6689-11

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2023-04-15

福建省自然科學基金資助項目(2022J02026);福建省“閩江學者獎勵計劃”項目(2021)

* 責任作者, 研究員, Jpshen@fjnu.edu.cn

林小如(2001-),女,廣東潮州人,福建師范大學本科生,研究方向為微生物生態(tài)學.linxiaoru0310@foxmail.com.