鈣通路基因預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后及其免疫狀態(tài)

曾 盛 陳 華 楊 頎

1 徐聞縣人民醫(yī)院 廣東徐聞 524100; 2 廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣東廣州 510080

結(jié)腸癌是全球第二致命的癌癥,也是第三大常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。然而,由于缺乏有意義的生物標(biāo)志物,早期診斷和治療結(jié)腸癌患者變得異常困難,導(dǎo)致大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期[2]。此外,由于結(jié)腸癌位于人體內(nèi)的特定位置,其診斷和治療比直腸癌更具挑戰(zhàn)性。遺憾的是,許多患者在確診后錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療機(jī)會(huì),只能接受放療和化療,這導(dǎo)致了不良的預(yù)后和生存率[3-4]。盡管現(xiàn)代免疫治療領(lǐng)域取得了一些進(jìn)展,但結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移(包括淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)仍然是新診斷結(jié)腸癌患者死亡的主要原因[5]。

腫瘤轉(zhuǎn)移涉及多種生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞周期控制異常、正常細(xì)胞骨架破壞和細(xì)胞外基質(zhì)改變。鈣離子(Ca2+)作為人體內(nèi)含量最豐富的金屬元素,已被確定為所有細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能,如細(xì)胞增殖、代謝、遷移、凋亡和基因表達(dá)[6-7]。在過(guò)去的十年中,人們對(duì)癌癥中鈣信號(hào)通路基因的重組和鈣信號(hào)在關(guān)鍵事件中的作用有了更深入的了解[8-10]。研究表明,無(wú)論是低濃度還是高濃度的鈣都可以降低癌變細(xì)胞的增殖程度,從而有助于預(yù)防結(jié)腸癌[11]。CACNA1G是一個(gè)編碼T型鈣通道的基因,已被發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤中高度甲基化,其失活可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣信號(hào)通路在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用,從而影響包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞增殖和凋亡[12]。在藥物篩選方面,抑制鈣-鈣調(diào)蛋白激酶(CAMK)活性已被證明可以阻止11種抗結(jié)腸癌藥物對(duì)基因的再激活和對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用,這表明靶向鈣信號(hào)可能是一種前景廣闊的癌癥治療方法[13]。因此,發(fā)展新的腫瘤特異性診斷生物標(biāo)志物或前瞻性治療靶點(diǎn)至關(guān)重要,它們可能有助于預(yù)測(cè)預(yù)后并指導(dǎo)更有效的治療。

考慮到鈣通路基因在結(jié)腸癌生長(zhǎng)控制和癌癥發(fā)展的關(guān)鍵作用,本研究旨在利用公共組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘并構(gòu)建基于鈣通路基因的結(jié)腸癌預(yù)后模型,對(duì)模型的預(yù)測(cè)效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià),并探討這些潛在的生物標(biāo)志物及其風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后以及免疫狀態(tài)的影響。為結(jié)腸癌的診斷和治療策略提供支持。

1 方法

1.1 結(jié)腸癌數(shù)據(jù)收集與整理

收集來(lái)自TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)腸癌患者隊(duì)列(TCGA-COAD)的454例結(jié)腸癌患者組織樣本以及42例癌旁組織的RNA-seq數(shù)據(jù)及其對(duì)應(yīng)的臨床信息作為訓(xùn)練集隊(duì)列。結(jié)腸癌驗(yàn)證集隊(duì)列來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE143985隊(duì)列,其包含了85例結(jié)腸癌患者的RNA微陣列數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中,排除了那些基因表達(dá)值為0的數(shù)據(jù),并將多個(gè)重復(fù)值取平均以獲得最終的RNA表達(dá)值。log2(表達(dá)值+1)的方法用于標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)值。從kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了包含254個(gè)鈣信號(hào)通路基因的信息(https://www.genome.jp/entry/map04020)。

1.2 差異分析

使用R語(yǔ)言中的“l(fā)imma”包進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。篩選的標(biāo)準(zhǔn)包括設(shè)置截?cái)嘀禐閘og|fold change| >2,并確保錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)小于0.05采用火山圖和熱圖的可視化方法來(lái)呈現(xiàn)結(jié)腸癌樣本與癌旁組織樣本之間的基因表達(dá)差異。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)用于進(jìn)行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,以深入了解差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系。

1.3 構(gòu)建以及驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)后模型

對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析,隨后通過(guò)迭代分析,利用Step函數(shù)挑選出最優(yōu)模型作為最終模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算公式如下:Risk score=(gene1的表達(dá)水平×系數(shù)1)+ (gene2的表達(dá)水平×系數(shù)2)…+ (geneN的表達(dá)水平×系數(shù)N)。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的閾值,結(jié)腸癌患者被分為高危險(xiǎn)組和低危險(xiǎn)組。Kaplan-Meier曲線分析用于評(píng)估危險(xiǎn)組之間的生存差異。R包“time ROC”用于分析判別模型的準(zhǔn)確性。使用GSE143985隊(duì)列數(shù)據(jù)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型進(jìn)行模型效能驗(yàn)證。

1.4 構(gòu)建臨床列線圖

結(jié)合結(jié)腸癌患者臨床信息,通過(guò)單因素變量和多因素變量的Cox回歸確定了與預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)基因。使用R包中的“forestplot”函數(shù)繪制了森林圖?；诙嘁蛩鼗貧w分析的結(jié)果,使用了R包中的“rms”函數(shù)構(gòu)建了臨床預(yù)測(cè)列線圖,用于預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者在1年、2年、3年和5年的總生存率。校準(zhǔn)曲線用于分析模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

基于TIMER數(shù)據(jù)庫(kù),使用Spearman相關(guān)性分析探究單個(gè)基因以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與6種免疫細(xì)胞間的相關(guān)性。多基因相關(guān)性圖通過(guò)R軟件包pheatmap進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。R軟件包“immunedeconv”中的CIBERSORT算法被用于進(jìn)一步評(píng)估免疫情況,并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連線圖來(lái)展示結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

以上所有分析方法均由R v4.0.3實(shí)現(xiàn)。若無(wú)特殊說(shuō)明,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定結(jié)腸癌患者中差異表達(dá)的鈣通路基因

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了454例結(jié)腸癌患者的組織樣本以及42例癌旁組織樣本。如圖1A所示,39個(gè)基因在結(jié)腸癌患者中表達(dá)上調(diào),而11個(gè)基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。圖1B展示了這些差異表達(dá)的鈣通路基因在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)譜情況。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖1C)顯示了50個(gè)差異表達(dá)的鈣通路基因之間的蛋白互作關(guān)系,其中CACNA1S和CACNA1D與其他蛋白的互作關(guān)系最為密切,可能在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。

注:圖A,火山圖;圖B,基因熱圖;圖C,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作分析網(wǎng)絡(luò)圖。

2.2 基于鈣通路基因的結(jié)腸癌預(yù)后評(píng)分模型

為了構(gòu)建結(jié)腸癌預(yù)后評(píng)分模型,多因素Cox回歸分析結(jié)果篩選了50個(gè)鈣通路基因。然后,通過(guò)使用Step函數(shù)進(jìn)行迭代分析,最終確定了9個(gè)鈣通路基因作為模型基因,它們分別是ATP2A1,CACNA1D,CALML6,FGF17,GRM5,HTR2C,P2RX2,PLN,VEGFA。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的計(jì)算公式如下:

riskscore=(0.608 1)×ATP2A1+(-0.333 1)×CACNA1D+(0.642)×CALML6+(-0.719 4)×FGF17+(-7.545 3)×GRM5+(0.743 8)×HTR2C+(0.886 4)×P2RX2+(0.184 3)×PLN+(0.319)×VEGFA

根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(圖2A),TCGA結(jié)腸癌患者隊(duì)列被分為高危險(xiǎn)組(227例)和低危險(xiǎn)組(227例)。隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加,結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間驟減,死亡人數(shù)增加,并且9個(gè)鈣通路基因的表達(dá)也呈現(xiàn)明顯差異。Kaplan-Meier曲線顯示低危險(xiǎn)組患者的總生存率明顯高于高危險(xiǎn)組(圖2B,P=1.62×10-6)。另外,隨時(shí)間變化的受試者操作特征(ROC)曲線評(píng)估結(jié)果表明,鈣通路基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)后預(yù)測(cè)中具有較高的準(zhǔn)確性,其1年時(shí)曲線下面積(AUC)為0.689,3年時(shí)為0.751(圖2C)。

注:圖A,TCGA結(jié)腸癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、生存狀態(tài)散點(diǎn)圖以及鈣信號(hào)通路風(fēng)險(xiǎn)基因隨風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布的基因表達(dá)熱圖;圖B,Kaplan-Meier生存曲線顯示高危險(xiǎn)組(紅色)的生存差于低危險(xiǎn)組(藍(lán)色);圖C,鈣通路基因風(fēng)險(xiǎn)模型在不同時(shí)間(1,3,5-年)的受試者操作特征曲線(ROC)曲線與曲線下面積(AUC)。

2.3 GEO結(jié)腸癌隊(duì)列患者驗(yàn)證鈣通路基因預(yù)后評(píng)分模型

為了驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)效能,使用了GEO結(jié)腸癌患者隊(duì)列GSE143985進(jìn)行外部驗(yàn)證。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,GSE143985結(jié)腸癌患者被分為高危險(xiǎn)組和低危險(xiǎn)組(圖3A)。同樣,隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分增加,結(jié)腸癌患者的死亡人數(shù)增加,生存時(shí)間降低。Kaplan-Meier曲線顯示低危險(xiǎn)組患者總生存率明顯高于高危險(xiǎn)組(圖3B,P=0.003 436)。ROC曲線分析顯示該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)后預(yù)測(cè)中具有極高的精度,其1年時(shí)曲線下面積(AUC)為0.946,2年時(shí)AUC為0.834,3年時(shí)AUC為0.819(圖3C)。

注:圖A,左圖為GEO結(jié)腸癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布,其中以圖中位風(fēng)險(xiǎn)值為截?cái)帱c(diǎn),紅色代表高危險(xiǎn)組,藍(lán)色代表低危險(xiǎn)組;右圖為不同樣本風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間和生存狀態(tài)散點(diǎn)圖分布;圖B,Kaplan-Meier生存曲線顯示高危險(xiǎn)組(紅色)的生存差于低危險(xiǎn)組(藍(lán)色);圖C,鈣通路基因風(fēng)險(xiǎn)模型在不同時(shí)間(1,2,3年)的受試者操作特征曲曲線與曲線下面積。

2.4 基于鈣通路基因和結(jié)腸癌患者臨床特征構(gòu)建的臨床列線圖

接下來(lái),采用單因素和多因素COX分析分析9個(gè)鈣通路基因和結(jié)腸癌患者臨床特征(年齡,性別,種族,TNM分期)與結(jié)腸癌預(yù)后之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示,CALML6、HTR2C、P2RX2、年齡TNM分期與預(yù)后獨(dú)立相關(guān)(圖4A～B)?；诙嘁蛩鼗貧w分析結(jié)果,構(gòu)建了一個(gè)列線圖,用于預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者在未來(lái)1、2、3和5年的總生存率(圖4C)?；颊呖梢愿鶕?jù)不同因素對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)(Point)來(lái)計(jì)算總得分(Total Point),以估計(jì)其未來(lái)的生存率。該列線圖的C-index為0.723,表明其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。校準(zhǔn)曲線顯示模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性良好,接近理想虛線(圖4D)。

注:圖A,單因素COX分析鑒定與生存相關(guān)的鈣通路基因和臨床特征;圖B,多因素COX分析鑒定與生存相關(guān)的鈣通路基因和臨床特征;圖C,基于多因素回歸結(jié)果構(gòu)建的臨床列線圖預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的1,2,3和5年總生存期;圖D,列線圖的校準(zhǔn)曲線。對(duì)角虛線表示理想的列線圖,紅色線,藍(lán)色線,橘色線,和紫色線表示觀察到的1年,2年,3年和5年列線圖校準(zhǔn)曲線。

2.5 鈣通路基因風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫相關(guān)性

通過(guò)分析TIMER免疫數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)了9個(gè)鈣通路基因及其構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型與6個(gè)常見(jiàn)免疫細(xì)胞之間存在相關(guān)性。如圖5A所示,除HTR2C外,其他8個(gè)鈣通路基因與免疫細(xì)胞存在顯著相關(guān)性。具體而言,ATP2A1、CALML6、FGF17、VEGFA與免疫細(xì)胞尤其是CD8+T細(xì)胞,呈現(xiàn)顯著正相關(guān),而PLN、P2RX2、GRM5與免疫細(xì)胞,特別是CD4+T細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和髓樣樹(shù)突細(xì)胞,呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。如圖5B所示,多種免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞,Neutrophil細(xì)胞,Microphage細(xì)胞,Myeloid dendritic細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈現(xiàn)正相關(guān)性,這表明高危險(xiǎn)組患者可能存在更高水平的腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。

注:圖A,鈣通路基因與六種免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖。紅色代表正相關(guān)性,藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)性。顏色越深代表二者之間相關(guān)性越強(qiáng),其中*P<0.05, **P<0.01。圖B,鈣通路基因模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫評(píng)分間的Spearman相關(guān)性分析。橫坐標(biāo)為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,縱坐標(biāo)為免疫評(píng)分。上側(cè)密度曲線代表風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布趨勢(shì),右側(cè)密度曲線代表免疫評(píng)分分布趨勢(shì)。

2.6 鈣通路基因風(fēng)險(xiǎn)模型與21種免疫細(xì)胞相關(guān)性

為了深入探究鈣通路基因風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián),采用了CIBERSORT算法進(jìn)行可靠的免疫評(píng)分評(píng)估。如圖6所示,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與memory B cell、CD8+T cell、T cell follicular helper、T cell regulatory (Tregs)、activated Mast cell等免疫細(xì)胞呈顯著正相關(guān),而與resting memory CD4+T cell、activated Myeloid dendritic cell、resting Mast cell等免疫細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果反映了免疫系統(tǒng)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素做出的復(fù)雜調(diào)節(jié)反應(yīng)。

注:圖中藍(lán)色圓圈代表負(fù)相關(guān)性,紅色圓圈代表正相關(guān)性。顏色越深或圓圈越大代表相關(guān)性越強(qiáng)。圖中紅色連線代表負(fù)相關(guān)性,綠色則代表正相關(guān)性。

3 討論

作為全球第二大癌癥相關(guān)死因,結(jié)腸癌的診斷和治療一直是人類健康關(guān)注的焦點(diǎn)[14]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究致力于尋找結(jié)腸癌患者中差異表達(dá)的生物標(biāo)志物候選物,以改善治療效果和預(yù)后[15-17]。這些研究旨在發(fā)現(xiàn)新的分子特征和生物標(biāo)志物,以更深入地了解結(jié)腸癌的發(fā)展和進(jìn)展機(jī)制,為個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)估提供有價(jià)值的信息。本研究分析了254個(gè)鈣通路基因,篩選出了50個(gè)差異表達(dá)的鈣通路基因。隨后,STEP函數(shù)篩選了最優(yōu)模型,并構(gòu)建了一個(gè)由9個(gè)鈣通路基因組成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。該預(yù)測(cè)模型能夠?qū)⒔Y(jié)腸癌患者分為不同風(fēng)險(xiǎn)層次,并顯著表明高危險(xiǎn)組的總生存率比低危險(xiǎn)組低。ROC曲線分析顯示,該模型預(yù)測(cè)TCGA結(jié)腸癌患者隊(duì)列3年的生存AUC值大于0.7,而在GEO驗(yàn)證集中的1年AUC甚至高于0.9,這表明該模型具有較高的預(yù)后預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和穩(wěn)健性。此外兩種免疫細(xì)胞算法,TIMER和CIBERSOFT,被用于分析鈣通路基因及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與免疫評(píng)分之間的相關(guān)性,進(jìn)一步拓展了鈣通路基因在結(jié)腸癌預(yù)后及免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用。

本研究具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先,使用了STEP函數(shù)構(gòu)建逐步回歸模型,以篩選最佳預(yù)測(cè)變量,并確定了9個(gè)鈣通路基因作為結(jié)腸癌的預(yù)后生物標(biāo)志物,包括ATP2A1、CACNA1D、CALML6、FGF17、GRM5、HTR2C、P2RX2、PLN、VEGFA。相對(duì)于常見(jiàn)的多元回歸分析以及LASSO回歸算法,STEP方法更加簡(jiǎn)便,它可以自動(dòng)從眾多可選的變量中挑選出最為重要的變量,以建立回歸分析的預(yù)測(cè)模型[18]。在這9個(gè)鈣通路基因中,ATP2A1、CACNA1D、CALML6、FGF17、GRM5、HTR2C以及VEGFA在TCGA結(jié)腸癌組織表達(dá)中呈現(xiàn)顯著上調(diào),而P2RX2和PLN則在結(jié)腸癌組織表達(dá)呈現(xiàn)明顯下調(diào)。ATP2A1、CACNA1D、CALML6是激活鈣離子結(jié)合活性和酶調(diào)節(jié)劑活性的主要基因。先前的研究表明,CACNA1D和ATP2A1在突變型腺瘤中具有特定的組織病理學(xué)表型[19],提示其在腫瘤細(xì)胞增殖中具有重要作用。FGF17是編碼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的一個(gè)成員,它具有廣泛的有絲分裂和細(xì)胞存活活性,參與多種生物學(xué)過(guò)程如腫瘤生長(zhǎng)和侵襲等[20]。GRM5和HTR2C屬于G蛋白偶聯(lián)受體蛋白家族,主要參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)和突觸可塑性的調(diào)節(jié)。研究表明,通過(guò)靶向假定的mu阿片樣物質(zhì)/ GRM5異構(gòu)體可以有效抑制小鼠骨癌的發(fā)展[21]。另外,HTR2C可以通過(guò)激活WNT信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)人癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[22]。VEGFA是促進(jìn)腫瘤增殖的一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高可促進(jìn)CREB的磷酸化,從而激活VEGFA轉(zhuǎn)錄并最終促進(jìn)內(nèi)皮血管生成[23]。P2RX2和PLN與ATP的活性有關(guān),但其在結(jié)腸癌中的作用仍未見(jiàn)廣泛報(bào)道,但這值得進(jìn)一步深入研究,因?yàn)樗鼈兛赡艹蔀樾碌脑\斷和治療標(biāo)志物。其次,本研究表明鈣通路基因在免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用。

已有研究表明,腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[24- 25]。鈣信號(hào)在免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。舉例來(lái)說(shuō),T細(xì)胞和B細(xì)胞在抗原識(shí)別過(guò)程中需要細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加[26]。本研究研究了免疫浸潤(rùn)細(xì)胞與9個(gè)鈣通路基因表達(dá)之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示這9個(gè)基因和6種免疫細(xì)胞水平存在一定的相關(guān)性。值得注意的是,PLN與這6種免疫細(xì)胞呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性,這可能表明PLN低表達(dá)的患者腫瘤免疫浸潤(rùn)水平較高。此外,CIBERSOFT算法的結(jié)果顯示,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與memory B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、T細(xì)胞輔助因子(Tfh)、T細(xì)胞調(diào)節(jié)因子 (Tregs)、活化肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞呈顯著正相關(guān)。這些免疫細(xì)胞在抵御感染、清除異常細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面起著關(guān)鍵作用。例如,memory B cell能夠產(chǎn)生高親和力的抗體,提供持久的保護(hù)免疫[27];CD8+T細(xì)胞能夠殺傷感染的細(xì)胞[28];Tfh細(xì)胞在淋巴結(jié)中激活B細(xì)胞,促進(jìn)抗體產(chǎn)生[29];活化肥大細(xì)胞參與炎癥和過(guò)敏反應(yīng)[30]。Tregs則能夠抑制免疫應(yīng)答,維持免疫平衡。這些正相關(guān)的細(xì)胞提示高危險(xiǎn)組患者可能處于免疫應(yīng)答的狀態(tài)。相反,低危險(xiǎn)組患者與休息狀態(tài)的記憶CD4+T細(xì)胞、活化的髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞以及休息狀態(tài)的肥大細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān),這表明低危險(xiǎn)組患者可能在免疫應(yīng)答方面處于較低的狀態(tài)[31-32]?？傊?這些結(jié)果表明鈣通路基因相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與多種類型的免疫細(xì)胞之間存在相關(guān)性,進(jìn)一步研究可能有助于更深入地理解免疫系統(tǒng)在不同鈣通路基因相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境下的功能和調(diào)控機(jī)制。

最后,本研究構(gòu)建了一個(gè)包含鈣通路基因和臨床指標(biāo)的列線圖,以為臨床醫(yī)生的預(yù)后評(píng)估提供有益的指導(dǎo)。臨床醫(yī)生可以借助此列線圖中的信息,結(jié)合患者的個(gè)體特征和病情發(fā)展,更準(zhǔn)確地評(píng)估患者的預(yù)后情況。同時(shí),通過(guò)深入了解鈣通路基因在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制,醫(yī)生可以根據(jù)患者的基因表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)病情的進(jìn)展和治療反應(yīng)。這種個(gè)性化的預(yù)后評(píng)估將協(xié)助醫(yī)生制定更為精準(zhǔn)的治療方案,并提供更準(zhǔn)確的治療建議。

然而,本研究仍存在一些限制。首先,雖然本研究已經(jīng)利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)腸癌患者數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行了外部驗(yàn)證,但仍需要更大規(guī)模的多中心結(jié)腸癌患者隊(duì)列驗(yàn)證,以增強(qiáng)研究的臨床意義。其次,需要進(jìn)行更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步理解鈣通路基因在結(jié)腸癌患者中的具體生物學(xué)功能,以及其在結(jié)腸癌發(fā)展中的作用機(jī)制。最后,其他因素,如遺傳、環(huán)境和個(gè)體健康狀況等,也可能對(duì)免疫細(xì)胞水平和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分產(chǎn)生影響,需要進(jìn)一步分析。因此,對(duì)鈣通路基因的深入研究將有助于更全面地了解其在結(jié)腸癌發(fā)展中的作用,為患者提供更準(zhǔn)確的治療策略和預(yù)后評(píng)估。

總之,本研究首次利用STEP函數(shù)構(gòu)建了包含9個(gè)鈣通路基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。該模型可用于分析結(jié)腸癌患者的預(yù)后和免疫狀況,這為進(jìn)一步研究這些基因在結(jié)腸癌的診斷和治療機(jī)制中的作用提供了臨床基礎(chǔ)。