鼻咽癌表觀遺傳學的研究進展*

吳燁, 范小琴, 聶國輝

深圳市第二人民醫(yī)院/深圳大學第一附屬醫(yī)院,深圳市轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院耳鼻咽喉科,深圳市納米酶腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室 (廣東深圳 518035)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤,是一種相對罕見的惡性腫瘤,其發(fā)病率一般低于每10萬人年1例。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)編制的GLOBOCAN 2020的數(shù)據(jù)(https://gco.iarc.fr/today),2020年NPC新增病例約13.3萬例,僅占2020年診斷的所有癌癥的0.7%,新增死亡率為約8萬例,占2020年癌癥死亡病例的0.8%[1]。然而,長期以來,NPC在中國南方的廣東人中有相當高的發(fā)病率,相比之下,在東南亞、北極地區(qū)、北非、東非和中東的土著人口中呈中等的發(fā)病率[2]。男性的NPC發(fā)病率和病死率分別為女性的2.6倍和2.65倍[1]。根據(jù)中國醫(yī)學科學院國家腫瘤中心的數(shù)據(jù)(http://www.chinancpcn.org.cn),2022年中國的NPC新發(fā)病例估計為64 165人,新增死亡人數(shù)為36 315人[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織腫瘤治療指導將NPC分為三種病理亞型:角化性鱗癌、非角化性鱗癌和基底樣鱗癌。非角化性NPC可分為分化型和未分化型[4]。NPC發(fā)病位置隱蔽, 早期癥狀不明顯, 極容易造成誤診或被患者忽視, 許多癌癥患者首診時已進入中晚期NPC[5]。眾所周知,NPC發(fā)生主要與EB病毒(EBV)感染、遺傳易感性和環(huán)境因素有關,然而具體的發(fā)病機制仍需繼續(xù)研究。表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下,基因表達的可遺傳的變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多,已知的有DNA甲基化(DNA methylation),非編碼RNA調(diào)控(non-coding RNA regulation),組蛋白修飾(histone modification),基因沉默(gene silencing)和RNA編輯(RNA editing)等[6]。研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都有重要影響。近年來,表觀遺傳學在NPC的早篩早診、機制研究和臨床治療等方面也提供了重要的見解。在此,我們綜述了近年來主要的NPC表觀遺傳學的研究進展。

1 DNA甲基化

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase)的作用下,在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′端位共價鍵結(jié)合一個甲基基團,是表觀遺傳學最早發(fā)現(xiàn),最常見,也是研究最深入的類型之一[7]。 研究證實腫瘤DNA甲基化的關鍵特征是:(1)全基因組DNA低甲基化可促進原癌基因如Ras、Myc、HOX11等表達增強,促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展;(2)抑癌基因啟動子DNA高甲基化可抑制抑癌基因如RASSF1、CDKN2A等的表達,從而促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[8]。近年諸多研究表明DNA甲基化在NPC的發(fā)病、發(fā)展與預后中起重要作用。

1.1 RAS RAS聯(lián)合結(jié)構(gòu)域家族1A(Rasassociation domain family gene1A,RASSF1A)基因由Dammann等[9]首次發(fā)現(xiàn),定位于染色體3p21.3上,為RASSF家族成員之一,參與細胞周期調(diào)節(jié)、微管穩(wěn)定和細胞凋亡等多種生物學功能。RASSF1A是當前研究最為廣泛的抑癌基因之一,在多種腫瘤包括NPC在內(nèi),甲基化失活參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。越來越多的證據(jù)表明,RASSF1A基因甲基化可作為NPC診斷治療的分子標志物[11]。

最新研究報道顯示,Ye等[12]通過對NPC和非NPC樣本中RASSF1A啟動子甲基化的匯集敏感性、特異性和曲線下面積(AUC)檢測發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動子甲基化與NPC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關,但與年齡和性別無關。Lao等[13]對過往報道的17項研究中包括NPC和非NPC樣本共1 688份進行Meta分析也證實RASSF1A甲基化是NPC潛在的診斷、預后和早期篩查的生物標志物。特別是RASSF1A高甲基化與NPC患者更差的生存期密切相關。一項對NPC高甲基化的6種基因的綜合分析發(fā)現(xiàn),RASSF1A甲基化是影響NPC無病生存期(disease-free survival,DFS)和總生存期(overall survival,OS)的最顯著基因,RASSF1A高甲基化NPC患者的DFS為HR=2.08;95%CI=1.17～3.68;P=0.013;OS為HR=1.83;95%CI=1.01～3.31;P=0.046。進一步分析RASSF1A甲基化對NPC腫瘤轉(zhuǎn)移分期發(fā)現(xiàn),RASSF1A 高甲基化晚期NPC患者的DFS為HR=2.19;95%CI=1.52～3.16;P<0.001;OS為HR=2.35;95%CI=1.58～3.49;P<0.001[14]。此外, Ooft等[15]發(fā)現(xiàn)RASSF1A高甲基化與EBV陽性NPC患者的OS成負相關,提示RASSF1A甲基化可能參與EBV感染NPC的發(fā)生。因此,RASSF1A甲基化與NPC發(fā)生、發(fā)展、患者生存期和預后密切相關,是NPC臨床診療的潛在分子標志物。

此外,RAB37是Ras 家族成員之一,作為NPC中持續(xù)下調(diào)的特異性高甲基化基因與NPC轉(zhuǎn)移和多西紫杉醇耐藥顯著相關。研究顯示RAB37過表達能顯著抑制NPC細胞轉(zhuǎn)移,同時增強對多西紫杉醇的化療敏感性。此外,基于RAB37甲基化和NPC患者腫瘤N分期的預后模型能有效地預測NPC患者遠處轉(zhuǎn)移風險和多西紫杉醇的誘導化療(induction chemotherapy,IC)獲益評估[16]。這可能使DNA甲基化成為預測NPC進展走向的重要因素,同時也為臨床治療提供更有效的指導。

1.2 鋅指蛋白 鋅指蛋白(zinc finger protein,ZNF)作為最大的人類基因組轉(zhuǎn)錄因子家族,其異常表達在多種惡性腫瘤包括NPC在內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白582(zinc finger protein 582,ZNF582)作為NPC中低表達的高甲基化基因通過調(diào)控下游靶基因黏附分子Nectin-3和NRXN3的轉(zhuǎn)錄和表達抑制NPC轉(zhuǎn)移[17]。然而,鋅指蛋白750(zinc finger protein 750,ZNF750)作為NPC中低表達的低甲基化基因主要通過N6-甲基腺苷(m6A)修飾維持其低表達水平,其可直接調(diào)節(jié)成纖維細胞生長因子14(fibroblast growth factor 14,FGF14),通過ZNF750-FGF14信號軸促進細胞凋亡抑制NPC生長[18]。以上在NPC中轉(zhuǎn)錄因子ZNF作為異常甲基化差異表達基因的相關研究為NPC分子調(diào)控機制提供了新的見解。

1.3 其他甲基化基因 除以上兩類主要甲基化基因外,近年來還發(fā)現(xiàn)其他基因甲基化參與NPC進展,如SHISA3[19]、DACT2[20]、SEPT9[21]等。此外,泛素特異性蛋白酶 44(USP44)的啟動子在NPC中高甲基化與NPC患者預后不良和促進NPC的放療抵抗有關[22]。

值得注意的是,一項對NPC甲基化的生物分析共鑒定出181個低甲基化高表達基因,這些基因富集于內(nèi)胚層細胞分化、有絲分裂核分裂、有絲分裂細胞周期過程等生物學機制中。途徑富集表現(xiàn)為ECM受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、粘著斑等。此外,研究團隊還鑒定了210個高甲基化低表達基因,這些基因在軸突組裝、微管形成、軸突動力蛋白復合物組裝等生物過程中富集。途徑分析顯示B細胞受體信號通路、造血細胞譜系、補體等富集[23]。這可能為NPC的分子機制和靶向治療的研究提供較為全面的思路。該研究還篩選出6個中心基因(FANCI、POSTN、IFIH1、ZMYND10、PACRG和POU2AF1),它們可能作為新型生物標志物,為NPC患者的精準診斷和醫(yī)療提供依據(jù)[23]。

1.4 DNA甲基化臨床前應用研究 目前,在臨床針對DNA甲基化的藥物研發(fā)較為深入,如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑藥物代表有地西他濱(decitabine,DAC)和阿扎胞苷(5-azacytidine)。其中DAC能逆轉(zhuǎn)NPC中的某些基因的啟動子甲基化,這些基因是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的潛在底物,可能在NPC細胞中發(fā)揮抑癌作用[24]。然而,口服阿扎胞苷藥物(CC-486)在NPC的臨床前Ⅱ期實驗結(jié)果顯示其沒有顯著的臨床治療效果[25]。

2 非編碼RNA

全基因轉(zhuǎn)錄組研究表明,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)通常指不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA,包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA),微小RNA(microRNA,miRNA)等;并在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)發(fā)育和疾病相關等關鍵基因的表達,從而參與體內(nèi)各種生物學過程,因此,ncRNA可與多種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[26-28]。目前,大部分ncRNA和NPC的研究主要集中在lncRNAs,circRNAs和miRNAs,由lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA相互作用形成的不平衡ceRNA網(wǎng)絡被廣泛發(fā)現(xiàn)與NPC 的發(fā)生有關。多種異常的lncRNA/circRNA介導的ceRNAs可能形成網(wǎng)絡,調(diào)控NPC的多種生物學功能,包括腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和耐藥[29]。

2.1 長鏈非編碼RNA LncRNAs是一種長度超過200個堿基對的非編碼RNA。起初lncRNA被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,不具有生物學功能[30]。然而,最近的研究表明,lncRNA參與多個基因的表達調(diào)控,包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和miRNA調(diào)控。根據(jù)相關蛋白質(zhì)編碼基因在基因組中的位置,lncRNA可分為五類,即反義lncRNA、正義lncRNA、內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本、長基因間非編碼RNA(long intergenic noncoding RNA,lincRNA)和雙向lncRNA[31]。目前,大量研究證實,lncRNAs廣泛參與NPC的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性表型,并通過多種途徑介導放療和化療耐藥,是NPC診斷和預后的重要生物標志物[30]。

LncRNA Gas5在NPC中異常高表達,通過招募增強子EZH2表觀調(diào)控PTEN促進NPC腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移,并與NPC患者預后不良成正相關[32]。LncRNA FAM225A通過海綿吸附效應與miR-590-3p和miR-1275相互作用,增強ITGB3的表達,激活FAK/PI3K/Akt通路促進NPC細胞的增殖、遷移和侵襲[33]。 LncRNA TINCR在NPC中表達上調(diào),通過與ACL相互作用保護其免受泛素降解,維持細胞乙酰輔酶A水平,并通過PADI1-MAPK-MMP2/9通路促進NPC增殖、轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥[34]。此外,在NPC中表達顯著高表達的lncRNA SOX2-OT與 miR-146b-5p相互作用競爭性結(jié)合調(diào)控hnRNPA2B1的表達促進NPC的進展[35]。然而,lncRNA NKILA作為一種在NPC中顯著低表達的lncRNA,主要通過NF-κB途徑調(diào)控NPC的轉(zhuǎn)移,并與NPC腫瘤發(fā)生、患者預后不良顯著相關[36]。

雷公藤內(nèi)酯是從古老的中藥雷公藤中提取的小分子單體提取物,具有良好的抗癌活性。最近研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯在體內(nèi)外均可干擾lnc-THOR-IGF2BP1信號通路,抑制NPC細胞增殖[37]。

2.2 環(huán)狀RNA CircRNAs是一種獨特的具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA,沒有5′端或3′端Poly A尾巴,具有表達豐富、穩(wěn)定、保守等特性[38]。研究顯示circRNAs參與多種疾病尤其是癌癥的病理過程[39]。近年在NPC中發(fā)現(xiàn)大量異常表達的circRNAs,并證實其具有生物學功能和作用機制,已成為NPC領域研究的熱點。

研究者們利用NPC組織樣本,通過cricRNA高通量測序共發(fā)現(xiàn)了170個顯著差異表達的候選circRNAs與NPC發(fā)生、發(fā)展密切相關,其中包括93個顯著上調(diào)cricRNAs和77個顯著下調(diào)cricRNAs;進一步分析證實circ KITLG可能通過吸附miR-3198干擾下游靶基因的表達參與NPC的發(fā)生、發(fā)展[40]。此外,本研究團隊通過類似的高通量RNA測序方法并結(jié)合基因差異倍數(shù)變化≥2或P<0.5的分析方法共鑒定出132種候選cricRNAs,其中包含73個顯著下調(diào)circRNAs,59個顯著上調(diào)circRNAs,進一步研究證實hsa_circ_0007637可能是NPC的一個生物標志物,并在NPC的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用[41]。

此外,根據(jù)研究報道circRNAs在NPC中的主要生物學作用機制有:(1)miRNA海綿效應,即circRNA 與miRNA通過堿基配對方式直接結(jié)合來調(diào)控miRNA下游靶基因表達。越來越多的研究表明circRNA 作為miRNA的ceRNA 在NPC的增殖、轉(zhuǎn)移、和化療耐藥等方面都具有重要作用。如在NPC增殖方面,cirRNA CDR1as可促進 NPC的生長和糖代謝[42];在NPC轉(zhuǎn)移方面,高表達的circ SETD3通過調(diào)控微管的動態(tài)組裝而增強NPC的侵襲轉(zhuǎn)移[43]。在NPC化療耐藥方面,高表達的circCRIM1與促進NPC轉(zhuǎn)移和多西他賽耐藥有關[44]。(2)直接調(diào)控基因的表達。最新研究顯示circRNAs可與多種基因mRNAs 結(jié)合調(diào)控基因表達,即可以作為腫瘤致癌基因或腫瘤抑制基因在NPC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。如circARHGAP12在NPC中通過直接調(diào)控細胞骨架重塑蛋白EZR,TPM3和RhoA的表達,促進EZR/TPM3/RhoA復合物的形成促進NPC的侵襲和轉(zhuǎn)移[45]。然而,在NPC中低表達的circRNF13卻主要通過與SUMO2基因mRNA結(jié)合,延長mRNA 半衰期,上調(diào)SUMO2蛋白通過GLUT1泛素化促進GLUT1降解,通過抑制AMOK/mTOR通路調(diào)控NPC增殖和轉(zhuǎn)移[46]。(3)EBV編碼的circRNAs在NPC中也可作為miRNA的海綿調(diào)控NPC的發(fā)生、發(fā)展。如EBV編碼circBART2.2主要通過結(jié)合RIG-1解旋酶結(jié)構(gòu)域,激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB,促進PD-L1的轉(zhuǎn)錄和表達,抑制T細胞功能導致腫瘤免疫逃逸[47]。

3 組蛋白修飾

組蛋白是真核生物體細胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì),由一個H2A-H2B四聚體和兩個H3-H4二聚體組成[48]。組蛋白修飾(histone modification)主要指發(fā)生在組蛋白復合物氨基末端尾部,形式包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和ADP-核糖化等修飾,且這些修飾可直接影響相關基因的轉(zhuǎn)錄活性[49]。目前,組蛋白乙酰化和甲基化在NPC發(fā)生發(fā)展中的作用已有較多研究。

3.1 組蛋白乙?；?組蛋白乙?；揎検侵赴l(fā)生在組蛋白特異性氨基酸上,通過組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HAT)和組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)催化完成,進而激化/抑制基因轉(zhuǎn)錄。如高表達的Lnc PVT1介導組蛋白H3第9位賴氨酸乙酰化(H3K9),招募核受體蛋白TIF1β激活NF90轉(zhuǎn)錄,并增加HIF-1α的穩(wěn)定性和細胞增殖,從而促進NPC的發(fā)生、發(fā)展[50]。此外,NPC中DNTTIP1通過去HDAC保持組蛋白H3K27的去乙?；癄顟B(tài),抑制DUSP2基因表達,激活ERK通路和MMP2的表達水平,進而促進NPC轉(zhuǎn)移[51]。

3.2 組蛋甲基化 組蛋白甲基化修飾主要是由甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)和去甲基轉(zhuǎn)移酶(demethyltransferase)參與,在組蛋白賴氨酸上發(fā)生甲基化和去甲基化修飾,從而激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄表達。據(jù)報道顯示在NPC中組蛋白甲基化修飾主要發(fā)生在H3組蛋白。如高表達的KDM4A基因通過抑制HIF-1α啟動子區(qū)組蛋白H3 第9位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K9me3),抑制HIF1α的甲基化促進HIF1α的表達,上調(diào)DDIT4激活mTOR信號通路促進細胞增殖、遷移和侵襲[52]。同時,LncRNA HOTAIR通過招募甲基化酶EZH2介導組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27)抑制E-cadherin 表達,從而促進NPC進程[53]。

3.3 組蛋白臨床前應用研究 組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDACi)通過增加細胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭?提高 p21等基因的表達水平等途徑,抑制腫瘤細胞的增殖,誘導細胞分化和(或)凋亡。

目前,在臨床針對組蛋白修飾的藥物研發(fā)是NPC臨床前研究的另一新熱點,尤其是在HDACi方面取得很好的研究成果。奇達酰胺是一種新型的HDACi,2014年被中國食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準用于治療復發(fā)性外周T細胞淋巴瘤,2019年被國家藥品監(jiān)督管理總局(NMPA)批準用于治療乳腺癌。研究表明奇達酰胺通過調(diào)節(jié)DNTTIP1/HDAC1-DUSP2軸來抑制NPC轉(zhuǎn)移[51]。亞磺酰苯胺羥肟酸(SAHA)是一種泛HDACi,通過磷酸化激活腫瘤抑制因子p53和Rb1,促進NPC細胞凋亡,但滅活AMPK信號通路等高能信號通路[54]。此外,他喹莫德是一種口服的抗血管生成藥物,研究顯示其與HDAC4的Zn2+調(diào)控結(jié)合域發(fā)生變構(gòu)結(jié)合,通過抑制N-CoR和HDAC3的共定位來阻止HDAC4/N-CoR/HDAC3抑制復合物的形成,在前列腺癌的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗中其具有良好安全性[55-56];最近有研究證實其在NPC中也能很好地抑制NPC生長[57]。

4 染色體重塑

染色體是我們基因組的生理模板。核小體是染色體的基本單位,由146個DNA堿基對組成,圍繞一個八聚體,由兩分子高度保守的核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4組成。染色體結(jié)構(gòu)的動態(tài)調(diào)節(jié),即染色體重塑,是調(diào)控基因表達、細胞凋亡、DNA復制與修復以及染色體凝結(jié)與分離的關鍵組成部分。這些過程的中斷與癌癥密切相關[58]。

近年來,某些染色體重塑因子被發(fā)現(xiàn)與促進或抑制NPC進展有關。如淋巴特異性解旋酶(lymphoid-specific helicase, LSH)與表觀沉默因子G9a結(jié)合抑制富馬酸水合酶(fumarate hydratase, FH),導致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),從而促進遷移、侵襲和癌癥進展[59]。相反,染色體重塑復合物交配類型轉(zhuǎn)換(SWI)和蔗糖非發(fā)酵(SNF)表型基因(mating-type switching/sucrose non fermenting,SWI/SNF)家族成員AT豐富結(jié)合域1A基因(ARID1A)在NPC中低表達,ARID1A的缺失增加激活Akt通路,從而促進NPC細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT樣分子表型[60]。

然而,染色體重塑在NPC方面的研究尚少,未來此方面的深入研究可豐富NPC表觀遺傳學的內(nèi)容,為闡明NPC發(fā)病機制以及腫瘤治療方面提供新的見解。

5 總結(jié)與展望

NPC發(fā)病位置隱蔽,早期癥狀不明顯,許多NPC患者被診斷時多為中晚期。表觀遺傳學的各種現(xiàn)象包括DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控、組蛋白修飾、染色體重塑等的研究不僅為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等機制提供見解,而且在NPC的早篩早診、臨床治療和預后等臨床應用方面有著重要的研究價值。然而仍有許多問題需要解決:第一,目前NPC表觀遺傳學的大量研究還處于分子水平,需要大量的臨床前試驗予以驗證;第二,表觀遺傳學生物標志物的具體分子機制作用尚不清楚,是否為NPC的特異性生物標志物還需深入探索詳細闡明;第三,針對表觀遺傳學在NPC治療中的藥物研發(fā)處于起步階段,需要大量的臨床隊列實驗加以驗證。我們相信隨著生物信息學、高通量測序以及精準醫(yī)學等方面的發(fā)展,表觀遺傳學的研究將使NPC的發(fā)病機制越來越清晰,為NPC提供更好的治療手段,讓患者獲得更好的治療效果。

利益相關聲明:本文作者和單位未曾接受第三方資金或服務支持,無相關利益沖突。

作者貢獻說明:論文由吳燁進行文獻檢索及撰寫成文,范小琴進行修改審核,聶國輝提供項目經(jīng)費資助。