假單胞菌對新疆大南湖低階煤降解研究與分析

木欣凱 ，劉向榮，2 ，石 晨 ，吳 昊

(1. 西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西省西安市，710054；2. 自然資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省西安市，710021)

0 引言

新疆煤炭占全國煤炭預(yù)測儲(chǔ)量的39.3%，其中低階煤又占新疆煤炭資源總量的80%[1-3]，新疆大南湖礦區(qū)的低階煤主要以長焰煤為主[4-5]。低階煤具有煤化程度低、灰分含量高、揮發(fā)分高、熱值低等特點(diǎn)，煤炭傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方式主要有煤氣化、液化和煤熱解等方式，均需在高溫、高壓下進(jìn)行，不但設(shè)備復(fù)雜、條件苛刻，還會(huì)造成大氣污染[6]。近幾年興起的微生物降解煤炭技術(shù)，由于在常溫常壓下進(jìn)行，且設(shè)備簡單、條件溫和，被認(rèn)為是煤炭清潔轉(zhuǎn)化的新途徑之一。

煤的微生物降解研究起源于20世紀(jì)80年代，Cohen 和 Gabriele[7-8]發(fā)現(xiàn)一些真菌可以將低階煤降解為黑色液體，此后大量研究者開始微生物降解煤的研究，吳昊等[9]利用日本假單胞菌降解新疆烏冬煤，發(fā)現(xiàn)日本假單胞菌細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)對新疆烏冬煤有較好的降解效果；石晨等[10]研究日本假單胞菌對內(nèi)蒙古煤炭的降解機(jī)理，發(fā)現(xiàn)日本假單胞菌的生物降解性與其分泌的酯酶和鼠李糖脂有關(guān)；Muthukumar B等[11]研究銅綠假單胞菌降解原油的特性，認(rèn)為銅綠假單胞菌可以有效的降解烷烴、芳烴類物質(zhì)，且細(xì)菌產(chǎn)生的胞外酶和生物表面活性劑在原油生物降解過程中起著關(guān)鍵作用；張翠坤等[12]通過研究銅綠假單胞菌降解原油的過程，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌能夠利用多種碳源合成鼠李糖脂，對長鏈烷烴有極好的降解效果；楊智等[13]對1株從石油污染土壤中分離得到的銅綠假單胞菌進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，在菌株中檢測到烷烴單加氧酶、甲苯雙加氧酶、聯(lián)苯雙加氧酶、芳香烴雙加氧酶和氧化還原酶等與石油降解相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌具有廣泛的碳?xì)浠衔锝到夥秶缓未呵锏萚14]通過基因工程重組構(gòu)建銅綠假單胞菌，增加鼠李糖脂的產(chǎn)量，提高了銅綠假單胞菌對原油的生物降解性，進(jìn)一步證明銅綠假單胞菌分泌的鼠李糖脂對碳?xì)浠衔镉休^好的降解效果；李建濤等[15]利用惡臭假單胞菌降解山西臨汾褐煤，發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌對山西臨汾褐煤有較好的降解效果，并通過正交實(shí)驗(yàn)得到4種降解條件的影響權(quán)重為：煤樣粒度>煤漿濃度>培養(yǎng)時(shí)間>接種量；韓嬌嬌等[16]從采集的煤、腐木和土壤樣品中可分離、鑒定出能夠高效降解新疆低階煤的菌株，篩選結(jié)果表明，假單胞菌屬和芽孢桿菌屬對新疆低階煤有較高的降解能力。

綜合上述研究結(jié)果可以看出，假單胞菌屬對煤炭、石油等碳?xì)浯蠓肿踊衔锏慕到庑Ч^為顯著，因此研究假單胞菌屬對新疆大南湖煤的降解過程及降解產(chǎn)物，可為新疆大南湖地區(qū)煤炭生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

筆者及其研究團(tuán)隊(duì)以新疆大南湖低階煤為研究對象，利用能夠降解芳香結(jié)構(gòu)的日本假單胞菌和降解脂肪烴效果尚佳的銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤，探究菌液量、煤漿濃度、降解時(shí)間對細(xì)菌降解新疆大南湖低階煤的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)工藝條件，最后利用紅外光譜儀、X射線衍射儀對固相降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對液相降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，研究降解過程和分析產(chǎn)物的組成，以期篩選出對新疆大南湖低階煤降解效果優(yōu)異的優(yōu)勢菌種。

1 實(shí)驗(yàn)研究

1.1 材料與儀器

主要試劑為生物試劑，包括蛋白胨、牛肉膏和瓊脂粉，其他試劑為氯化鈉(分析純)、濃硝酸(分析純)；主要儀器有CTDG-200875密封對輥破碎機(jī)、XMB棒磨機(jī)、PS-200振篩機(jī)、SW-CJ-1FD超凈工作臺、BL-50A立式壓力蒸汽滅器、BC-360生化培養(yǎng)箱、HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱、Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜儀、Mini Flex 600 X射線衍射儀和Agilent7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 煤樣的預(yù)處理

煤樣選用新疆大南湖地區(qū)低階煤，經(jīng)過破碎、研磨和篩分，獲得粒徑為0.25～0.50 mm的煤樣，用8 mol/L的硝酸按照煤∶硝酸為1.0∶2.5 g/mL的比例對煤樣進(jìn)行浸泡氧化，使煤樣與硝酸充分接觸，氧化48 h后用去離子水沖洗，觀察濾液顏色；待濾液澄清，檢測濾液pH，當(dāng)濾液pH大于5.6時(shí)，氧化預(yù)處理過程結(jié)束；收集煤樣用于后續(xù)降解實(shí)驗(yàn)，煤樣氧化后，芳香環(huán)羧基化，側(cè)鏈烷基氧化和硝化，氧化作用使煤易被細(xì)菌降解[17-18]。

1.3 微生物的培養(yǎng)

日本假單胞菌、銅綠假單胞菌均購于中國微生物菌種保藏管理中心(CICC)，編號分別為CICC 23895和CICC 10204。

1.3.1 培養(yǎng)基

2種細(xì)菌的培養(yǎng)基相同，采用中國微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基(CM0002)，具體配方為蛋白胨取5 g、牛肉膏取3 g、瓊脂(固體)取15 g、氯化鈉5 g、蒸餾水取1 L，培養(yǎng)基pH為7。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

將已活化與純化培養(yǎng)后的菌種接種到裝有250 mL已滅菌液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于30 ℃、160 r/min的全溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液用于后續(xù)的降解實(shí)驗(yàn)。

1.4 微生物降解實(shí)驗(yàn)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

將0.3 g煤樣和50 mL液體培養(yǎng)基置于150 mL的錐形瓶中放入高壓滅菌鍋滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻到室溫時(shí)，加入10 mL菌液，然后將錐形瓶放入溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后離心(1萬r/min，20 min)分離得到未降解的固相產(chǎn)物(殘煤)和液相產(chǎn)物。用蒸餾水對殘煤進(jìn)行洗滌，直至殘煤中無菌體殘留后烘干、備用[19-20]。在相同培養(yǎng)條件下，分別改變菌液量、煤漿濃度和降解時(shí)間，研究各因素對微生物降解新疆大南湖低階煤的影響。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)表，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇單因素實(shí)驗(yàn)中降解效果良好的區(qū)間作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)不同水平，即菌液量最優(yōu)區(qū)間為20～40 mL、煤漿濃度的最優(yōu)區(qū)間為6～14 g/L、降解時(shí)間的最優(yōu)區(qū)間為12～16 d，利用正交實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.5 降解效果評價(jià)指標(biāo)

目前評價(jià)煤炭降解效果的方法主要有差減法和吸光度A450。

1.5.1 利用差減法計(jì)算降解率

微生物降解煤炭的效果可以用降解率η來評價(jià)，η的計(jì)算見式(1)[21]：

(1)

式中：η——降解率，%；

W0——加入煤樣的質(zhì)量，g；

W1——煤樣降解后殘煤的質(zhì)量，g。

1.5.2 利用吸光度A450評價(jià)降解效果

在微生物降解煤炭的過程中，隨著降解過程的進(jìn)行，降解液的顏色逐漸加深，吸光度也逐漸增加，并且在450 nm處有明顯的吸收峰，所以降解產(chǎn)物的黑色降解液在450 nm處對可見光的吸光度可間接反映降解率的高低[22-23]。

筆者選擇吸光度A450作為煤炭降解效果評價(jià)指標(biāo)，是由于選擇吸光度A450易于測量、結(jié)果精確、判斷煤樣降解率更為準(zhǔn)確。

1.6 降解產(chǎn)物的表征

1.6.1 固相產(chǎn)物的表征方法

準(zhǔn)確稱取1 mg干燥后的殘煤與200 mg的溴化鉀(KBr)混合，制成薄片，用Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，設(shè)置波長為4 000～400 cm-1，掃描分辨率為4 cm-1。采用Mini Flex600 X射線衍射儀，對殘煤進(jìn)行XRD分析，設(shè)置掃描速度為2°/min，掃描范圍為5°～70°。

1.6.2 液相產(chǎn)物的表征方法

將最佳工藝條件下得到的黑色降解產(chǎn)物，依次使用甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷萃取，液相產(chǎn)物與有機(jī)溶劑的萃取體積比為1∶2，萃取液利用Agilent7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 煤漿濃度對煤樣降解效果的影響

煤漿濃度對2種假單胞菌降解煤樣的影響如圖1所示。

圖1 煤漿濃度對2種假單胞菌降解煤樣的影響

由圖1可以看出，隨著煤漿濃度逐漸增大，2種降解產(chǎn)物的A450呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，2種假單胞菌的最佳煤漿濃度均為6 g/L，2種假單胞菌的A450值均為0.675。這是因?yàn)檩^低的煤漿濃度提供的碳源有限，細(xì)菌的降解效率受到限制；而當(dāng)煤漿濃度過大時(shí)，高濃度的碳源使細(xì)菌保持過高的活性，細(xì)菌之間互相競爭培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)菌與培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)交換的過程受到影響，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不足以支撐細(xì)菌生長，細(xì)菌生長受到抑制，微生物對煤炭的降解效果大幅度下降。日本假單胞菌對煤漿濃度的環(huán)境更加敏感，高濃度的煤漿環(huán)境對日本假單胞菌的生長影響巨大；銅綠假單胞菌對煤漿環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)，在高濃度煤漿環(huán)境下，仍舊有較好的降解效果。

2.1.2 菌液量對煤樣降解效果的影響

菌液量對2種假單胞菌降解煤樣的影響如圖2所示。

圖2 菌液量對2種假單胞菌降解煤樣的影響

由圖2可以看出，日本假單胞菌降解產(chǎn)物的A450隨著菌液量的增加而呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，當(dāng)菌液量為40 mL時(shí)，A450值達(dá)到最大，為0.773，降解效果最好。這是因?yàn)殡S著菌液量的增加，細(xì)菌數(shù)量和活性明顯增加，對煤樣的降解效果也越來越好；而隨著菌液量的進(jìn)一步增加，細(xì)菌對煤樣的降解效果并沒有顯著增加甚至開始減弱。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)有限，高濃度的菌液會(huì)加劇細(xì)菌之間的惡性競爭，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)快速減少，進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長[24]。但當(dāng)菌液量超過一定數(shù)值后，加入的細(xì)菌菌液本身就保持極高的活性，也具有較好的降解活性，因此日本假單胞菌在菌液量為40 mL時(shí)對煤炭的降解效果最好。同樣，銅綠假單胞菌降解產(chǎn)物的A450也隨菌液量的增加而呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，但并未出現(xiàn)減小之后再增加的情況，這說明此時(shí)的銅綠假單胞菌已經(jīng)達(dá)到生長極限，后續(xù)增加菌液量會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌衰亡。因此，銅綠假單胞菌在菌液量為30 mL時(shí)，A450達(dá)到最大，為0.907，降解效果最好。

2.1.3 降解時(shí)間對煤樣降解效果的影響

降解時(shí)間對2種假單胞菌降解煤樣的影響如圖3所示。

圖3 降解時(shí)間對2種假單胞菌降解煤樣的影響

由圖3可以看出，隨著降解時(shí)間的增加，2種假單胞菌降解產(chǎn)物的A450值也越來越高，最終趨于平穩(wěn)。這是由于剛開始細(xì)菌生長活性高，對氧化煤的降解效果提升比較明顯，而隨著時(shí)間的增加，細(xì)菌逐漸開始凋亡，活菌數(shù)量減少，因此最終A450值在14 d時(shí)趨于平穩(wěn)，此時(shí)日本假單胞菌和銅綠假單胞菌的A450值分別為0.779和0.660，后續(xù)再增加降解時(shí)間，降解率幾乎不再變化。同時(shí)，相同時(shí)間內(nèi)，日本假單胞菌降解氧化煤的降解率均高于銅綠假單胞菌，這是因?yàn)?種細(xì)菌對環(huán)境適應(yīng)能力不同，導(dǎo)致了繁殖能力產(chǎn)生差異。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 日本假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

日本假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 日本假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

日本假單胞菌降解煤樣的極差分析見表4。

表4 日本假單胞菌降解煤樣的極差分析

在選定的實(shí)驗(yàn)條件區(qū)間中，各因素對日本假單胞菌降解煤樣影響的主次順序依次為：煤漿濃度>菌液量>降解時(shí)間。煤漿濃度在細(xì)菌降解煤樣過程中產(chǎn)生了顯著性影響，這是因?yàn)槊簼{環(huán)境對日本假單胞菌生長有一定的影響造成的。研究結(jié)果表明，日本假單胞菌降解煤樣的最優(yōu)降解工藝參數(shù)組合為A1B3C3，即菌液量20 mL、煤漿濃度14 g/L、降解時(shí)間16 d，在此工藝條件下，日本假單胞菌對煤樣的降解率最大為45.27%。

日本假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析見表5。

表5 日本假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析

方差分析用于分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的波動(dòng)情況，表中數(shù)據(jù)均使用正交實(shí)驗(yàn)分析軟件計(jì)算得出，其中AdjSS為正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的離差平方和，AdjMS為均方，F(xiàn)值為統(tǒng)計(jì)量，P值為顯著性，可以反應(yīng)一組數(shù)據(jù)的偶然性，P值越低，數(shù)據(jù)偶然性越小，R2為判定系數(shù)，R2(adj)為調(diào)整后的判定系數(shù)，通過正交實(shí)驗(yàn)分析軟件計(jì)算得出R2=99.80%、R2(adj)=99.19%，共同說明不同單因素?cái)?shù)據(jù)之間的關(guān)系強(qiáng)度，反應(yīng)數(shù)據(jù)的可信度，從方差分析表中也可以看出，煤漿濃度在細(xì)菌降解新疆大南湖低階煤的過程中產(chǎn)生了顯著性影響。

2.2.2 銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

日本假單胞菌降解煤樣的極差分析見表7。

表7 日本假單胞菌降解煤樣的極差分析

正交實(shí)驗(yàn)極差R的計(jì)算結(jié)果表明，在選定的實(shí)驗(yàn)條件區(qū)間中，各因素對銅綠假單胞菌降解煤樣的影響的主次順序依次為：煤漿濃度>菌液量>降解時(shí)間。煤漿濃度在銅綠假單胞菌降解煤樣過程中產(chǎn)生了顯著性影響，這是因?yàn)槊簼{環(huán)境對銅綠假單胞菌生長有一定影響造成的。最終得出銅綠假單胞菌降解煤樣的最優(yōu)降解工藝參數(shù)組合為A2B2C3，即菌液量30 mL、煤漿濃度10 g/L、降解時(shí)間16 d。在此工藝條件下，銅綠假單胞菌對新疆大南湖低階煤的降解率最大為35.92%。

銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析見表8。

表8 銅綠假單胞菌降解煤樣的正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析

表8中數(shù)據(jù)均使用正交實(shí)驗(yàn)分析軟件計(jì)算，最終得出該組數(shù)據(jù)的判定系數(shù)為R2為99.06%、R2(adj)為96.26%。表8中數(shù)據(jù)與日本假單胞菌數(shù)據(jù)均不相同，但3個(gè)不同單因素下AdjSS、AdjMS和F的大小規(guī)律均為煤漿濃度>菌液量>降解時(shí)間，同樣說明煤漿濃度在細(xì)菌降解新疆大南湖低階煤的過程中產(chǎn)生了顯著影響。

2.3 煤樣的工業(yè)分析與元素分析

煤炭的工業(yè)分析和元素分析中的各項(xiàng)指標(biāo)是判斷煤質(zhì)的重要參考，采用《煤的工業(yè)分析方法》(GB/T 212-2008)規(guī)定的測試方法對煤樣進(jìn)行了工業(yè)分析。煤樣工業(yè)分析及元素分析見表9。

表9 煤樣工業(yè)分析及元素分析

由表9可以看出，原煤揮發(fā)分為48.95%，碳含量偏低，屬于變質(zhì)程度較低的低階煤。原煤經(jīng)硝酸氧化處理后灰分明顯降低，說明硝酸預(yù)處理具有脫灰作用[25]。原煤經(jīng)過硝酸氧化后，C、H元素含量顯著下降，N、O元素含量明顯上升，這是因?yàn)橄跛崞茐牧嗣旱姆肿咏Y(jié)構(gòu)，發(fā)生了氧化及硝化作用[26]；降解后的殘煤與氧化煤相比較，C、N元素含量下降，H、O元素含量上升，O元素含量的上升說明微生物的降解過程伴隨著氧化反應(yīng)的發(fā)生[27]，銅綠假單胞菌對煤炭的氧化作用更明顯。

2.4 紅外光譜分析

新疆大南湖原煤、氧化煤及日本假單胞菌降解后殘煤和銅綠假單胞菌降解后殘煤的紅外光譜如圖4所示。

a-氧化煤；b-原煤；c-日本假單胞菌降解后殘煤；d-銅綠假單胞菌降解后殘煤。圖4 煤樣的紅外光譜

由圖4可以看出，原煤、氧化煤和殘煤的峰型基本一致，都在3 410～3 425 cm-1范圍處有強(qiáng)而寬的吸收峰，此處吸收峰主要是因?yàn)榉雍汪人嵘系牧u基發(fā)生伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，氧化煤和降解后的殘煤都在1 000～1 300 cm-1的范圍內(nèi)有較多的吸收峰，這是因?yàn)镃-O鍵的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，主要是芳香酯和醚的C-O-C以及芳香族的C-OH，而氧化煤較原煤吸收峰更多，說明氧化反應(yīng)可以改變煤的結(jié)構(gòu)，氧化煤在1 706 cm-1和1 421 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是因?yàn)榉紵N中的C=O鍵和硝基中的N=O鍵的伸縮振動(dòng)，這與康紅麗[28]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而原煤中并沒有出現(xiàn)這2個(gè)峰，說明硝酸氧化使煤的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)了C=O和N=O這類基團(tuán)，而氧化煤經(jīng)過細(xì)菌降解后，2處透過率減弱證明細(xì)菌可以降解C=O和N=O結(jié)構(gòu)，日本假單胞菌降解后殘煤與銅綠假單胞菌降解后殘煤相比，2 921 cm-1和2 856 cm-1處出現(xiàn)明顯的吸收峰，這是由于-CH2不對稱伸縮振動(dòng)和-CH3對稱伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的；在1 710 cm-1處多出1個(gè)吸收峰，此處吸收峰主要是因?yàn)?COOH發(fā)生伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，說明日本假單胞菌降解后的氧化煤中存在更多的-COOH官能團(tuán)；銅綠假單胞菌降解后殘煤在2 921 cm-1和2 856 cm-1處吸收峰明顯減弱，867 cm-1處多出1個(gè)吸收峰，此處是苯環(huán)五取代吸收峰，表明銅綠假單胞菌降解后的氧化煤中存在苯環(huán)五取代結(jié)構(gòu)[29]。

2.5 XRD分析

利用Mini Flex600 X射線衍射儀對原煤、氧化煤及各殘煤進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 煤樣的XRD分峰擬合

由圖5可以看出，衍射角2θ在23°～25°和35°～40°區(qū)間內(nèi)各煤樣存在002峰和100峰，002峰和100峰分別代表芳香層片堆砌的高度和芳香環(huán)縮合的程度。002峰具有對稱性，而圖5中002峰并未出現(xiàn)明顯的對稱性，這是由于002峰和γ這2種微晶峰相互疊加導(dǎo)致的。因此對其進(jìn)行基線校正和平滑處理，然后對平滑后的曲線進(jìn)行峰值擬合，使用布拉格公式和謝樂公式計(jì)算各晶格參數(shù)[30]，各煤樣XRD擬合結(jié)構(gòu)參數(shù)見表10，氧化煤和原煤相比芳香層片的間距d002減小，說明煤樣氧化后的芳構(gòu)化程度變高，有序程度升高。氧化煤經(jīng)2種假單胞菌降解后，芳香層片堆砌高度Lc減小，芳香層數(shù)N減小，這說明煤中含氧官能團(tuán)、芳香環(huán)等結(jié)構(gòu)被降解[31-32]；而對比日本假單胞菌降解后殘煤和銅綠假單胞菌降解后殘煤的各結(jié)構(gòu)參數(shù)，日本假單胞菌降解后殘煤的002峰和100峰未出現(xiàn)明顯偏離，芳香層片的間距d002和d100變化并不顯著；但日本假單胞菌降解后殘煤的芳香層片間距d002增大，層片堆砌高度Lc減少，芳香層片寬度La減小，芳香層數(shù)N減少，表明日本假單胞菌降解后殘煤芳香層之間的作用力減少，芳香層更加松散[33]；此現(xiàn)象說明日本假單胞菌對煤中部分側(cè)鏈和官能團(tuán)的降解效果優(yōu)于銅綠假單胞菌，改變了煤中密集的芳香結(jié)構(gòu)[34]。

表10 各煤樣XRD擬合結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.6 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對2種假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后的液相產(chǎn)物進(jìn)行分析，2種假單胞菌降解煤樣液相產(chǎn)物總離子流色譜如圖6和圖7所示。

圖6 日本假單胞菌降解煤樣液相產(chǎn)物總離子流色譜

圖7 銅綠假單胞菌降解煤樣液相產(chǎn)物總離子流色譜

通過總離子流色譜可觀察到不同保留時(shí)間下檢測出的物質(zhì)，相對豐度反應(yīng)檢測出物質(zhì)的峰強(qiáng)度，將檢測出的物質(zhì)用軟件計(jì)算可以得到相應(yīng)物質(zhì)的分子量，液相產(chǎn)物的分子量主要集中在142.17～546.39。

日本假單胞菌降解煤樣的液相產(chǎn)物主要包含烷烴類、酯類、醇類等化合物，分子量在142.17～546.39；銅綠假單胞菌降解煤樣后的液相產(chǎn)物主要包含芳香類、苯酚類、烷烴類以及羧酸類、酯類化合物等，分子量集中在180.11～436.50，證明2種假單胞菌都可將煤樣的大分子結(jié)構(gòu)解聚為小分子物質(zhì)[35]。

2種假單胞菌降解煤樣的液相產(chǎn)物中化合物的組成見表11。

表11 2種假單胞菌降解煤樣的液相產(chǎn)物中化合物的組成 %

由表11可以看出，日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解煤樣后的液相產(chǎn)物甲苯萃取物中，含有豐富的烷烴類化合物，含量分別為73%、56%；乙酸乙酯萃取物中，銅綠假單胞菌降解煤樣的液相產(chǎn)物含氧官能團(tuán)化合物種類更加豐富，含有豐富的羧酸、醛、含羥基官能團(tuán)的化合物。二氯甲烷萃取物中，日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后，液相產(chǎn)物中含有豐富的酯類化合物，含量分別為61%、54%。銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后液相產(chǎn)物的3種萃取物中均含有7，9-二叔丁基-1-氧雜吡啶(4，5)癸-6，9-二烯-2，8-二酮的物質(zhì)，這說明銅綠假單胞菌降解煤炭的方式更加復(fù)雜，可能存在多種機(jī)理同時(shí)進(jìn)行降解。日本假單胞菌降解的液相產(chǎn)物中含有豐富的烷烴類和酯類化合物，表明日本假單胞菌對煤炭中側(cè)鏈有良好的降解效果，與銅綠假單胞菌相比對煤炭結(jié)構(gòu)影響較大，這可能是日本假單胞菌降解率高于銅綠假單胞菌的原因[36]。

3 結(jié)論

(1)日本假單胞菌降解新疆大南湖低階煤的最佳工藝條件為：菌液量20 mL、煤漿濃度14 g/L、降解時(shí)間16 d，最大降解率為45.27%；銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤的最佳工藝條件為：菌液量30 mL、煤漿濃度10 g/L、降解時(shí)間16 d，最大降解率為35.92%。在降解過程中，日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤降解條件的影響權(quán)重一致，均為煤漿濃度>菌液量>降解時(shí)間。

(2)新疆大南湖低階煤經(jīng)過日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解后，C、H元素含量下降，N元素含量上升。根據(jù)原煤、氧化煤以及殘煤的紅外光譜，結(jié)果表明2種假單胞菌可以降解氧化煤中的C=O和N=O等結(jié)構(gòu)；通過XRD峰值擬合分析可知，2種假單胞菌均對氧化煤中的含氧官能團(tuán)、芳香族化合物有較好的降解效果，而日本假單胞菌對芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的作用更加顯著。

(3)日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解液相產(chǎn)物的分子量均集中在142.17～546.39，液相產(chǎn)物中主要包含芳香類、烷烴類、醇類等小分子化合物。日本假單胞菌和銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后液相產(chǎn)物甲苯萃取物中，烷烴類化合物含量最多，分別為73%、56%；二氯甲烷萃取物中，酯類化合物含量最多，分別為61%、54%；而乙酸乙酯萃取物中，銅綠假單胞菌降解新疆大南湖低階煤后的液相產(chǎn)物中含氧官能團(tuán)化合物種類更加豐富；日本假單胞菌對煤炭中芳香環(huán)結(jié)構(gòu)有良好的降解效果，與銅綠假單胞菌相比對煤炭結(jié)構(gòu)影響較大，這可能是日本假單胞菌降解率高于銅綠假單胞菌的原因。

綜合上述結(jié)論，日本假單胞菌對新疆大南湖低階煤的降解效果優(yōu)于銅綠假單胞菌，日本假單胞菌可以有效降解煤中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而篩選出日本假單胞菌是降解新疆大南湖低階煤的優(yōu)勢菌種。而繼續(xù)進(jìn)行細(xì)菌與煤炭的匹配實(shí)驗(yàn)研究，對尋找降解煤炭的優(yōu)勢菌種和建立菌煤匹配數(shù)據(jù)庫具有重要意義。