基于迭代進(jìn)化的腸出血性大腸桿菌噬菌體雞尾酒的抗菌效果評價

摘要：分離到一株抗菌能力較差的新型噬菌體vB_EcoM_CRP22，通過模擬噬菌體與細(xì)菌在自然環(huán)境中的相互作用，開發(fā)了迭代適應(yīng)性進(jìn)化的方法使噬菌體感染噬菌體抗性突變菌株，顯著提高了噬菌體對腸出血性大腸桿菌（EHEC）的抗菌效果，由噬菌體進(jìn)化株組合成的雞尾酒制劑感染細(xì)菌后36 h 內(nèi)能有效控制OD600 低于0.4。該實(shí)驗(yàn)為噬菌體療法的發(fā)展提供了新思路。

關(guān)鍵詞：腸出血性大腸桿菌；噬菌體療法；適應(yīng)性進(jìn)化；噬菌體雞尾酒；抗菌效果

中圖分類號：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

腸出血性大腸桿菌（EHEC）是一種人類食源性病原菌，可引發(fā)多種嚴(yán)重的腸道疾病，包括腹瀉、出血性結(jié)腸炎（HC）和溶血性尿毒綜合征（HUC）等，對公共衛(wèi)生安全造成極大挑戰(zhàn)[1-2]?？股爻３１挥脕碇委煵≡腥?，然而隨著抗生素的廣泛使用，病原菌的抗生素耐藥性（AMR）問題日趨嚴(yán)重[3-4]。同時，喹諾酮類抗生素等藥物的使用可能會誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)志賀毒素[5]。此外，長期使用抗生素容易造成腸道菌群紊亂，對使用者的健康產(chǎn)生持續(xù)影響[6]。因此，開發(fā)抗生素替代療法從而對EHEC感染進(jìn)行預(yù)防和治療是目前需要解決的問題。

噬菌體是自然環(huán)境中存在的一種細(xì)菌病毒，能夠感染細(xì)菌并具有宿主特異性。噬菌體療法是利用噬菌體裂解細(xì)菌的特性從而治療感染性疾病的一種方法，在高效殺滅病原菌的同時降低對人體內(nèi)有益菌群的影響[7-8]。然而，噬菌體療法也存在一系列挑戰(zhàn)，如雖然一些噬菌體能特異性感染病原菌，但是其抗菌能力還有待提高[9]。這些噬菌體無法長期抑制病原菌的生長，同時噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生會影響治療效果[10]。使用噬菌體雞尾酒（Phage cocktail）進(jìn)行治療是有效的應(yīng)對策略，該方法將不同噬菌體株進(jìn)行組合配伍從而可以延長抗菌時間，目前已被廣泛應(yīng)用于對抗AMR 細(xì)菌[11-12]。噬菌體雞尾酒依賴于高度多樣性噬菌體株組成的噬菌體庫，然而從自然環(huán)境中分離噬菌體株需要投入大量的時間和人力，不利于臨床新型病原菌的快速治療[13]。因此，在使用噬菌體雞尾酒進(jìn)行治療的過程中，需要尋找新的策略以快速獲得多樣性的噬菌體株。

在生態(tài)環(huán)境中，噬菌體與細(xì)菌的相互作用是一場“軍備競賽”，在持續(xù)的生存壓力下，細(xì)菌會不斷進(jìn)化以抵抗噬菌體，而噬菌體也會不斷發(fā)生進(jìn)化來對抗細(xì)菌[14-15]。已有研究表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下能夠?qū)崿F(xiàn)噬菌體的適應(yīng)性進(jìn)化，并提高噬菌體抗菌能力和生長特性[16]。此外，還有研究表明與細(xì)菌共培養(yǎng)后的噬菌體發(fā)生了宿主范圍的改變，并延緩了噬菌體抗性菌的產(chǎn)生[17-18]。在體內(nèi)的治療模型中，經(jīng)過進(jìn)化的噬菌體在治療銅綠假單胞菌感染的過程中表現(xiàn)出了更廣的宿主范圍和更好的治療效果[19]。由此可見，適應(yīng)性進(jìn)化是獲得不同噬菌體株的一個潛在策略。

本研究通過模擬噬菌體與細(xì)菌在自然環(huán)境中的相互作用，開發(fā)了迭代適應(yīng)性進(jìn)化的方法以獲得不同的噬菌體株，隨后將其組成噬菌體雞尾酒用于抑制EHEC 的生長。首先，從環(huán)境中分離到一株能感染EHEC 的大腸桿菌噬菌體， 然而其抗菌效果較弱。隨后，使用適應(yīng)性進(jìn)化的方法獲得5 株噬菌體抗性突變菌株和5 株對其有感染能力的噬菌體進(jìn)化株。最后，將野生型噬菌體和5 株噬菌體進(jìn)化株組合成雞尾酒并對其抑制EHEC 的體外抗菌效果進(jìn)行評價。本研究開發(fā)的迭代適應(yīng)性進(jìn)化的方法能快速獲得多種噬菌體株，并增強(qiáng)噬菌體的抗菌能力，有望促進(jìn)噬菌體療法的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器和細(xì)菌培養(yǎng)

本研究使用的LB（Luria-Bertani）肉湯培養(yǎng)基購自海博生物技術(shù)有限公司，瓊脂、PEG8000 和甘油購自上海麥克林生化科技股份有限公司， 基因組DNA 抽提試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。PBS（磷酸鹽） 緩沖液的所有成分（化學(xué)純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制方式為稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.58 g Na2HPO4·7H2O、0.27 gKH2PO4 溶于1 L 去離子水，滅菌并常溫保存。

用于細(xì)菌和噬菌體培養(yǎng)的多功能恒溫振蕩培養(yǎng)箱（Stab Mini 型）購自上海潤度生物科技有限公司，高速臺式冷凍離心機(jī)（H1750R 型）購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。用于抗菌效果評價的生長測定儀（Bioscreen C plate reader 型） 購自芬蘭OyGrowth Curves Ab Ltd，由華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。用于噬菌體形態(tài)觀察的透射電鏡（TEM， JEM-1400Plus 型）購自日本JEOL 公司，由華東理工大學(xué)分析測試中心提供。

本研究使用的腸出血性大腸桿菌O157：H7 菌株EDL933 由上海交通大學(xué)姚玉峰教授贈予，本文中以EHEC 代指該大腸桿菌菌株。EHEC 和噬菌體抗性菌株均使用LB 肉湯和LB 瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取細(xì)菌劃線于瓊脂質(zhì)量濃度為15 g/L 的LB 瓊脂培養(yǎng)基， 37 ℃ 培養(yǎng)12 h，然后挑單菌落至LB 肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 噬菌體的分離純化與透射電鏡觀察

噬菌體的分離純化主要通過雙層平板實(shí)驗(yàn)完成[20]。首先，從華東理工大學(xué)河水中取樣并以8 000 g條件離心5 min 以去除污水樣品中的雜質(zhì)，隨后使用0.22 μm 濾膜過濾除菌。然后，向水樣中加入等體積LB 培養(yǎng)基，并按1% 接種量加入大腸桿菌菌液，37 ℃共培養(yǎng)12～24 h。使用0.22 μm 濾膜對共培養(yǎng)液過濾除菌，獲得噬菌體液。將100 μL 菌液與100 μL 噬菌體液混合， 37 ℃孵育10 min 后加入55～65 ℃ 的LB 軟瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂質(zhì)量濃度為7 g/L），混合均勻并迅速傾倒于提前配制好的LB 瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂質(zhì)量濃度為15 g/L）平皿上，靜置至完全凝固，37 ℃ 共培養(yǎng)12～24 h，觀察噬菌斑形成情況。若存在噬菌斑，使用移液器槍頭挑取噬菌體并轉(zhuǎn)移至PBS 溶液，4 ℃ 靜置2 h 以上，并對噬菌體溶解液進(jìn)行3 輪雙層平板實(shí)驗(yàn)，即可獲得純化的噬菌體株，于4 ℃ 保存在終質(zhì)量濃度0.2 g/mL 甘油溶液中。

通過TEM 觀察單個噬菌體的形態(tài)。首先，向過濾除菌的噬菌體液中加入NaCl 至終質(zhì)量濃度為1.0 mol/L， 加入PEG8000 至終質(zhì)量濃度為100 g/L，4 ℃ 靜置過夜。于4 ℃、12 000 g 條件離心10 min，去除上清液并用PBS 溶解沉淀，最后使用0.22 μm 濾膜過濾除菌，即可獲得濃縮的噬菌體液。然后，將濃縮的噬菌體液滴至碳涂層銅柵，靜置5 min 后使用濾紙去除多余液體，滴加20 g/mL 磷鎢酸溶液染色30 s，隨后使用濾紙去除多余液體，靜置5 min 后即可進(jìn)行TEM 觀察。

1.3 噬菌體基因組測序與生物信息學(xué)分析

使用基因組DNA 抽提試劑盒對噬菌體基因組進(jìn)行抽提。噬菌體基因組測序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。蛋白質(zhì)編碼序列（CDS）的預(yù)測通過軟件GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/GeneMark/）進(jìn)行，并通過數(shù)據(jù)庫NCBI Nonredundant、VFDB（Virulence Factor Database） 和CARD（ComprehensiveAntibiotic Research Database） 進(jìn)行比對和注釋?；蚪M圈圖的繪制通過軟件CGView Server（https：//stothardresearch.ca/cgview/）完成?；贜CBItBLASTx 比對結(jié)果，通過軟件Viptree server 4.0（https：//www.genome.jp/viptree/）繪制了噬菌體的矩形蛋白質(zhì)組系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，并對相似噬菌體進(jìn)行了基因組的可視化線性比對。

1.4 噬菌體抗性菌株的分離

按1% 的接種量將大腸桿菌與其噬菌體接種至LB 培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)12～36 h 直至共培養(yǎng)液渾濁。將共培養(yǎng)液以4 ℃ 、8 000 g 條件離心5 min， 并用PBS 緩沖液洗滌細(xì)菌沉淀3 次。將重懸的菌液在瓊脂質(zhì)量濃度為15 g/L 的LB 瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。取不同單菌落的培養(yǎng)液均勻涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基，然后在平板上滴加1 μL 噬菌體液，觀察抑菌圈的形成情況。若無抑菌圈產(chǎn)生，則說明該菌株為噬菌體抗性菌，于?80 ℃ 保存。

1.5 噬菌體的適應(yīng)性進(jìn)化

按1% 的接種量將目標(biāo)噬菌體抗性菌株和待進(jìn)化噬菌體的宿主接種至LB 培養(yǎng)基，并按10% 的接種量將待進(jìn)化的噬菌體液接種至培養(yǎng)液，37 ℃ 共培養(yǎng)12～24 h，直至共培養(yǎng)液渾濁。使用0.22 μm 濾膜對共培養(yǎng)液過濾除菌，將其作為下一輪共培養(yǎng)的噬菌體液，按10% 的接種量接種至LB 培養(yǎng)基，并按1% 接種量接種目標(biāo)噬菌體抗性菌株和待進(jìn)化噬菌體的宿主， 進(jìn)行下一輪共培養(yǎng)。重復(fù)上述操作， 并依照1.4 節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，測定每一輪的噬菌體液對目標(biāo)噬菌體抗性菌株的感染能力，若產(chǎn)生明顯抑菌圈，說明噬菌體發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，隨后通過雙層平板實(shí)驗(yàn)分離出進(jìn)化的噬菌體株。

1.6 噬菌體的成斑效率測定和宿主譜分析

依照Kutter 的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行噬菌體成斑效率（EOP）的測定[21]。使用LB 培養(yǎng)基將噬菌體以10 倍濃度進(jìn)行梯度稀釋，以EHEC 或EHEC 噬菌體抗性菌株作為宿主進(jìn)行噬菌體效價的測定。每個效價測定設(shè)置3 個平行。以每株噬菌體的宿主菌作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，噬菌體EOP 為以目標(biāo)菌株為宿主菌測得的效價與以標(biāo)準(zhǔn)菌株為宿主菌測得的效價的比值。

根據(jù)EOP 數(shù)值水平對噬菌體的抗菌效果進(jìn)行區(qū)分。以10?6 作為EOP 數(shù)值的檢測下限， EOP gt; 10?6則認(rèn)為目標(biāo)噬菌體對目標(biāo)宿主具有感染能力，而EOP gt;10?3 則認(rèn)為目標(biāo)噬菌體對目標(biāo)宿主具有較強(qiáng)感染能力。以噬菌體株為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌菌株為縱坐標(biāo)，繪制出描述噬菌體抗菌效果的宿主譜。

1.7 噬菌體的抗菌效果評價

通過生長測定儀進(jìn)行噬菌體抗菌數(shù)據(jù)的采集。首先，測定噬菌體效價和細(xì)菌活菌濃度并將它們的濃度分別稀釋至108 PFU/mL 和109 CFU/mL。然后，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1 接種2 μL 噬菌體和2 μL細(xì)菌至檢測孔板，并補(bǔ)加LB 液體培養(yǎng)基至200 μL/孔，將孔板置于生長測定儀中以37 ℃ 振蕩培養(yǎng)36～48 h，生長測定儀每30 min 檢測OD600，每組設(shè)置3 個平行。使用軟件GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行曲線圖和散點(diǎn)圖的繪制。采用獨(dú)立的雙尾t 檢驗(yàn)法（Unpairedtwo-tailed Student’s t-test） 確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性， *為Plt;0.05，**為Plt;0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌噬菌體的分離與特性表征

本研究從環(huán)境水樣中分離到一株大腸桿菌噬菌體，通過雙層平板法進(jìn)行培養(yǎng)，可觀察到噬菌體具有邊緣較清晰、透明的圓形噬菌斑，結(jié)果如圖1（a） 所示。TEM 觀察結(jié)果顯示該噬菌體具有直徑約80 nm 的頭部和長度約120 nm 的非柔性尾部（圖1（b） 所示）。該噬菌體被命名為vB_EcoM_CRP22（簡稱CRP22），基因組序列已上傳至NCBI（Accession： OQ708377），根據(jù)NCBI 生物分類數(shù)據(jù)庫（NCBI Taxonomy）[22]，噬菌體CRP22 屬于Caudoviricetes 綱Ounavirinae 亞科Felixounavirus 屬。

為了考察CRP22 抑制EHEC 的潛力，本研究進(jìn)行了體外抗菌效果評價，結(jié)果如圖1（c） 所示。在感染0～8 h，CRP22 能抑制EHEC 的生長，顯示了較好的抑菌效果。然而在感染后8 h，噬菌體抗性突變株快速產(chǎn)生導(dǎo)致OD600 大幅度提升，其抗菌效果明顯降低。上述結(jié)果表明在噬菌體CRP22 感染后8 h 抗菌效果較差，無法對EHEC 實(shí)現(xiàn)長時間抑制。

2.2 噬菌體基因組的生物信息學(xué)分析

為了解噬菌體的基因組學(xué)特征，我們對CRP22噬菌體進(jìn)行了全基因組測序和生物信息學(xué)分析，結(jié)果如圖2 所示。CRP22 的基因組為dsDNA，全長為87 193 bp，GC 含量約為38.85%。在其基因組中預(yù)測得到129 個蛋白質(zhì)編碼序列（CDS），其中包含9 個噬菌體結(jié)構(gòu)相關(guān)CDS 和31 個代謝相關(guān)CDS，結(jié)果如圖2（a） 所示。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫VFDB（Virulence FactorDatabase）和CARD（Comprehensive Antibiotic ResearchDatabase）比對，CRP22 基因組上未發(fā)現(xiàn)毒力基因或抗生素抗性基因。同時，CRP22 基因組未發(fā)現(xiàn)整合酶基因和CRISPR 相關(guān)基因元件。上述結(jié)果表明CRP22 具有一定的安全性，是適合用于噬菌體療法的候選噬菌體株。

為了進(jìn)一步了解CRP22 噬菌體的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本文基于NCBI tBLASTx 比對結(jié)果構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2（b） 所示。CRP22 的基因組與Escherichiaphage HY02、Salmonella phage BPS17L1、Escherichiatyping phage 1 和Escherichia coli O157 typing phage12 等多株噬菌體具有較高相似性，但它們的基因排列順序具有一定的差異，結(jié)果如圖2（c） 所示。

2.3 迭代共培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)噬菌體的適應(yīng)性進(jìn)化

為了進(jìn)一步發(fā)揮CRP22 噬菌體的治療潛力，本研究模擬了自然界中細(xì)菌與噬菌體相互作用的過程，設(shè)計(jì)了噬菌體迭代適應(yīng)性進(jìn)化的方法，結(jié)果如圖3所示。本研究旨在通過該方法使噬菌體對EHEC 噬菌體抗性菌（EHEC-RB）產(chǎn)生感染能力，并將進(jìn)化的噬菌體組合成為噬菌體雞尾酒，來提前抑制噬菌體抗性菌（RB）的產(chǎn)生從而提高抑菌效果。本研究進(jìn)行的CRP22 噬菌體的適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)流程示意圖如圖3（a） 所示。首先，將CRP22和EHEC 共培養(yǎng)一段時間，分離出一系列EHEC-RB。接下來，將CRP22、EHEC 和EHEC-RB共培養(yǎng)一段時間，其中，EHEC 作為CRP22 擴(kuò)增的宿主菌，EHEC-RB 作為噬菌體適應(yīng)性進(jìn)化的壓力。在共培養(yǎng)的過程中使CRP22 進(jìn)化為能夠感染EHEC-RB，并將噬菌體進(jìn)化株（CRP22-EP）進(jìn)行分離。由于噬菌體進(jìn)化是一個隨機(jī)過程，無法通過一輪共培養(yǎng)完成，因此，在每一輪共培養(yǎng)結(jié)束后，將共培養(yǎng)液進(jìn)行過濾除菌以獲得噬菌體液，重復(fù)上述流程進(jìn)行迭代共培養(yǎng)。每天測定噬菌體液對EHEC-RB 株的感染能力直至適應(yīng)性進(jìn)化的發(fā)生，隨后通過雙層平板實(shí)驗(yàn)分離出進(jìn)化株（EP）。為了進(jìn)一步獲得不同的進(jìn)化株，將CRP22-EP和對應(yīng)宿主菌進(jìn)行共培養(yǎng)以獲得新的EHEC-RB 株，并將新的EHEC-RB株、CRP22-EP 株及其宿主菌重復(fù)上述共培養(yǎng)過程，從而獲得更多不同的噬菌體進(jìn)化株。

通過上述迭代適應(yīng)性進(jìn)化方法，本研究共獲得了5 株EHEC-RB 株（EHEC-RB1～EHEC-RB5）和5 株CRP22-EP 株（CRP22-EP1～CRP22-EP5），并進(jìn)行了宿主譜分析，結(jié)果見圖3（b）。不同的噬菌體進(jìn)化株除了能感染自身的宿主菌外，還能夠感染不同的噬菌體抗性突變株。每株噬菌體進(jìn)化株都顯示出了不同的宿主范圍，表明它們是不同的噬菌體株并具有宿主特異性。CRP22 和5 株CRP22-EP 的宿主范圍組合在一起覆蓋了所有EHEC 和5 株EHEC-RB。這表明， 相較于單獨(dú)使用CRP22 對EHEC 進(jìn)行抗菌，CRP22 和5 株CRP22-EP 的聯(lián)合使用可能對EHEC 具有更強(qiáng)的抗菌效果。

2.4 噬菌體進(jìn)化株雞尾酒對腸出血性大腸桿菌的抗菌效果

為了評估噬菌體進(jìn)化株雞尾酒的抗菌潛力，本研究將CRP22 和CRP22-EP1～CRP22-EP5 配制成噬菌體雞尾酒，通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)對其抗菌效果進(jìn)行評價，噬菌體CRP22 進(jìn)化株和噬菌體雞尾酒的抗菌生長曲線圖見圖4。從6 株噬菌體中任意選取2 株噬菌體株進(jìn)行等比例混合配制成Cocktail， 稱為Cocktail 2， Cocktail 2～Cocktail 6 的配制方法以此類推。結(jié)果顯示，不同Cocktail 的抗菌效果之間存在顯著差異，所選擇的噬菌體株數(shù)量越多，Cocktail 的總體抗菌效果越好。Cocktail 2 無法有效抑制EHEC，18 h 后OD600 均增長至0.8 以上。Cocktail 3 在抑菌的過程中仍然發(fā)現(xiàn)有大量的噬菌體抗性突變株快速生長。Cocktail 4 與Cocktail 5 表現(xiàn)出更好的抗菌效果，部分Cocktail 4 與Cocktail 5 能較好地抑制EHEC，在18 h 后控制OD600lt;0.4，但仍然有一些噬菌體抗性突變株生長。Cocktail 6 能夠有效抑制EHEC 的生長且無明顯的噬菌體抗性菌生長。36 h 時間點(diǎn)的抗菌效果如圖5 所示，由圖可見，不同Cocktail 抗菌效果存在差異性， Cocktail 噬菌體種類越多抗菌效果越好。綜上所述，噬菌體進(jìn)化株的加入能夠有效提高噬菌體雞尾酒的抗菌能力和延緩噬菌體抗性突變株的生長，其中Cocktail 6 能有效控制EHEC，具有很強(qiáng)的抗菌效果。

3 結(jié) 論

本研究分離到一株大腸桿菌噬菌體CRP22，基因組與多株已知噬菌體存在相似性， 但是其對EHEC 的抗菌效果較弱；為了發(fā)揮CRP22 噬菌體對EHEC 的抗菌潛力，本研究開發(fā)了一種迭代適應(yīng)性進(jìn)化的方式，獲得了一系列能感染EHEC 抗性菌株的噬菌體進(jìn)化株；將CRP22 與5 株噬菌體進(jìn)化株組合成雞尾酒（Cocktail 6），其在感染后36 h 能夠有效抑制EHEC 的生長，顯著提高了CRP22 的抗菌能力。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ]JIANG L， YANG W， JIANG X， et al. Virulence-related Oislands in enterohemorrhagic Escherichia coli O157： H7[J].Gut Microbes， 2021， 13（1）： 1992237.

[ 2 ]REILLY A. Prevention and control of enterohaemorrhagicEscherichia coli （EHEC） infections： Memorandum from aWHO meeting. WHO consultation on prevention and controlof Enterohaemorrhagic Escherichia coli （EHEC） infections[J]. Bulletin of the World Health Organization， 1998，76（3）： 245-55.

[ 3 ]HAMILTON-MILLER J M. The emergence of antibioticresistance： Myths and facts in clinical practice[J]. IntensiveCare Medicine， 1990， 16（Suppl 3）： S206-S216.

[ 4 ]石竹， 劉琴， 張智慧， 等. 基于斑馬魚模型的鰻弧菌減毒活疫苗的生物安全性評價[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2011， 37（6）： 722-726.

[ 5 ]KIMMITT P T， HARWOOD C R， BARER M R. Toxingene expression by shiga toxin-producing Escherichia coli：The role of antibiotics and the bacterial SOS response[J].Emerging Infectious Diseases， 2000， 6（5）： 458-465.

[ 6 ]HAO W Z， LI X J， ZHANG P W， et al. A reviewof antibiotics， depression， and the gut microbiome[J].Psychiatry Research， 2020， 284： 112691.

[ 7 ]ANYAEGBUNAM N J， ANEKPO C C， ANYAEGBUNAMZ K G， et al. The resurgence of phage-basedtherapy in the era of increasing antibiotic resistance： Fromresearch progress to challenges and prospects[J]. MicrobiologicalResearch， 2022， 264： 127155.

[ 8 ]CHANG R Y K， NANG S C， CHAN H K， et al. Novelantimicrobial agents for combating antibiotic-resistant bacteria[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2022， 187：114378.

[ 9 ]VAN NIEUWENHUYSE B， VAN DER LINDEN D，CHATZIS O， et al. Bacteriophage-antibiotic combinationtherapy against extensively drug-resistant Pseudomonasaeruginosa infection to allow liver transplantation in a toddler[J]. Nature Communication， 2022， 13（1）： 5725.

[10]BERRYHILL B A， HUSEBY D L， MCCALL I C， et al.Evaluating the potential efficacy and limitations of a phagefor joint antibiotic and phage therapy of Staphylococcusaureus infections[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America， 2021， 118（10）：e2008007118.

[11]MARTINS W， LI M， SANDS K， et al. Effectivephage cocktail to combat the rising incidence of extensivelydrug-resistant Klebsiella pneumoniae sequence type 16[J].Emerging Microbes amp; Infections， 2022， 11（1）： 1015-1023.

[12]LIU N， LEWIS C， ZHENG W， et al. Phage cocktailtherapy： Multiple ways to suppress pathogenicity[J]. Trendsin Plant Science， 2020， 25（4）： 315-317.

[13]HANAUER D I， GRAHAM M J， SEA P， et al. Aninclusive research education community （iREC）： Impactof the SEA-PHAGES program on research outcomes andstudent learning[J]. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America， 2017，114（51）： 13531-13536.

[14]PIEL D， BRUTO M， LABREUCHE Y， et al. Phage-hostcoevolution in natural populations[J]. Nature Microbiology，2022， 7（7）： 1075-1086.

[15]HAMPTON H G， WATSON B N J， FINERAN P C. Thearms race between bacteria and their phage foes[J]. Nature，2020， 577（7790）： 327-336.

[16]KOSKELLA B， HERNANDEZ C A， WHEATLEY R M.Understanding the impacts of bacteriophage viruses： Fromlaboratory evolution to natural ecosystems[J]. Annual Reviewof Virology， 2022， 9（1）： 57-78.

[17]BORIN J M， AVRANI S， BARRICK J E， et al. Coevolutionaryphage training leads to greater bacterial suppressionand delays the evolution of phage resistance[J]. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America， 2021， 118（23）： e2104592118.

[18] ZHANG Q G， CHU X L， BUCKLING A. Overcoming the growth-infectivity trade-off in a bacteriophage slows bacterialresistance evolution[J]. Evolutionary Applications，2021， 14（8）： 2055-2063.

[19]XU Z， DING Z， SHI L， et al. Design combinations ofevolved phage and antibiotic for antibacterial guided byanalyzing the phage resistance of poorly antimicrobialphage[J]. Microbiology Spectrum， 2023， 11（5）： e0095823.

[20] ECHEVERRIA-VEGA A， MORALES-VICENCIO P，SAEZ-SAAVEDRA C， et al. A rapid and simple protocolfor the isolation of bacteriophages from coastalorganisms[J]. MethodsX， 2019， 6： 2614-2619.

[21]KUTTER E. Phage host range and efficiency of plating[J].Methods in Molecular Biology， 2009， 501： 141-149.

[22]SCHOCH C L， CIUFO S， DOMRACHEV M， et al. NCBITaxonomy： A comprehensive update on curation， resourcesand tools[J]. Database （Oxford）， 2020， 2020： baaa062.

（責(zé)任編輯：王曉麗）

基金項(xiàng)目： 國家杰出青年科學(xué)基金（32025038）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（222201231540）