梨園土壤中梨火疫病菌存活時間研究

李曉妹 韓麗麗 陳衛(wèi)民

摘要為探究發(fā)病梨園土壤中是否存在梨火疫病菌 Erwinia amylovora 以及在土壤中的存活時間，2020—2021年，在新疆庫爾勒市梨園采集土壤，利用劃線分離法，采用 Zeller 選擇性培養(yǎng)基從中分離病原細(xì)菌，并結(jié)合形態(tài)鑒定、PCR 檢測和致病性測試結(jié)果確認(rèn)梨火疫病菌 E.amylovora，并對自然土壤中的E.amylovora持續(xù)分離。結(jié)果表明，發(fā)病梨園土壤中存在梨火疫病菌。梨火疫病菌在土壤中存活時間可長達 550 d，且分離菌株仍具有明顯的致病性。該試驗對庫爾勒市梨園土壤中E.amylovora的是否存在和存活時間進行研究，其結(jié)果對土壤作為E.amylovora傳播源的風(fēng)險性評估具有重要理論意義，為梨火疫病的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞土壤；Erwinia amylovora；存活時間；PCR；致病性；測試

中圖分類號S 436.6文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）24-0127-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.027

Study on Survival Time of Erwinia amylovora in Soil of Fragrant Pear Orchard

LI? Xiaomei1，HAN? Lili2，CHEN? Weimin2

（1.College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052;2.Xinjiang Yili Vocational and Technical College，Yining，Xinjiang 835000）

AbstractIn order to explore the existence of Erwinia amylovora in the soil of the diseased pear orchard and its survival time in the soil，from 2020 to 2021，soil was collected in the pear orchard of Korla City，Xinjiang，and the pathogenic bacteria were isolated by Zeller selective medium by streak separation method，and the pear fire blight bacterium E.amylovora was confirmed by combination of morphological identification，PCR detection and pathogenic test results，and E.amylovora in natural soil was continuously isolated.The results showed that there were pear fire blights in the soil of the diseased pear orchards.Pear fire blight bacteria could survive in soil for up to 550 days，and isolated strains remained significantly pathogenic.In this study，the existence and survival time of E.amylovora in the soil of pear orchards in Korla City were studied，and the results had important theoretical significance for the risk assessment of soil as the source of E.amylovora transmission，and provided a scientific basis for the effective prevention and control of pear fire blight.

Key wordsSoil;Erwinia amylovora;Survival time;PCR;Pathogenicity;Test

梨火疫病是一種重大的國際檢疫性病害，由解淀粉歐文氏菌 （Erwinia amylovora）引起，該病害不僅對梨樹造成毀滅性的危害，還可危害蘋果、山楂、海棠、榅桲等多種薔薇科果樹，具有傳播速度快、傳播途徑多樣化、危害嚴(yán)重和難以根治等特點，其在世界范圍內(nèi)對重要果樹造成了巨大的產(chǎn)量損失［1-5］。梨火疫病菌可通過梨樹的花、果實、葉片、枝條、砧木等侵染［6-8］。梨火疫病在梨園中的傳播主要是依靠果農(nóng)對病樹的修枝剪和風(fēng)雨等對果樹造成的傷口入侵，還可依靠昆蟲和飛鳥的傳播［9-10］。潰瘍斑處的菌膿可以隨雨水的沖擊飛濺至其他果樹，還可隨雨水流動匯集于土壤表層。梨火疫病的傳播速度較快，除人為因素干擾外，自然狀態(tài)下梨火疫病的傳播速度每年16 km，由果樹貿(mào)易及觀賞植物的引進等因素傳播速度每年可達100 km［10］。

2016年5月梨火疫病首次在我國新疆伊犁霍城縣發(fā)生，現(xiàn)已傳播至新疆14個地州，嚴(yán)重危害梨、蘋果、山楂、海棠、榅桲等果樹，尤其是在庫爾勒香梨上傳播極為迅速，對新疆乃至全國林果產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重威脅［11］。筆者以新疆庫爾勒市重度發(fā)病香梨園土壤為試材，通過對土壤中梨火疫病菌的分離、致病性測試以及接種致病菌樣品的PCR擴增，明確梨火疫病菌能否在土壤中存活及存活時間，為該病害的傳播及防控對策研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品。2020年4月5日在新疆庫爾勒市5個香梨園中采集土壤樣品（表1）。

1.1.2培養(yǎng)基。

Zeller改良高糖培養(yǎng)基：牛肉膏8 g，蔗糖50 g，放線菌酮50 mg，0.5%溴百里酚藍9 mL，0.5%中性紅2.5 mL，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 7.4。

液體培養(yǎng)采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）+5% 蔗糖培養(yǎng)基：牛肉浸膏 1 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 5 g，氯化鈉 5 g，蔗糖 50 g，水1 000 mL，pH 7.2。

1.1.3致病性測定供試材料。

采集庫爾勒市綠化4隊行道樹上未噴任何藥劑、健康的當(dāng)年生香梨樹嫩葉片、幼果，供離體接種使用。

1.1.4主要試劑及儀器。

細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（目錄號：DP302；生產(chǎn)商：天根公司），2×Taq PCR mix（TANGEN，PER008-1）、ddH2O、DL5000 Marker、1×TAE緩沖液瓊脂糖、GenGreen 核酸染料（TANGEN，GG1301-500UL）、VERITI 2.0 PCR 擴增儀，美國 Allen-Bradley 公司；AIIegra 25R 高速 冷凍離心機，美國貝克曼公司；HE99 電泳儀，美國 General Electric 公司；OD600 DiluPhotometerTM分 光光度計，德國 Implen 公司；G：BO× EF 凝膠成像系統(tǒng)，英國 Syngene 公司；Climacell 404 培養(yǎng)箱， 德國 MMM 公司。

1.2方法

1.2.1土壤采集及制備。

2020 年 4 月 5 日，在新疆庫爾勒市隨機選取5個發(fā)病程度為重度的香梨園，使用土壤采集器在田間采用對角線法采集土樣，采集深度為0～10 cm 。每個香梨園采集5個樣點，每個樣點采集300 g土樣，共25份土壤樣本。實驗室內(nèi)分別對各樣地采集的土壤樣本進行混合、過篩（10目），去除樣本中的雜質(zhì)后采用四分法取樣500 g，密封于土壤采集袋中，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2土壤中病原菌分離及純化。

病原菌分離時間為2021年4月10日、4月15日、4月22日、5月2日、6月2日、7月2日、8月2日、9月2日、9月25日、10月10日。

每份土壤樣本各取30 g分別倒入500 mL滅菌三角燒杯中加入200 mL無菌水進行浸泡，靜置12 h后，各取2 mL浸出液于離心管中，12 000 r/min離心5 min，去上清液后加入100 μL無菌水懸浮，接種環(huán)蘸取懸浮液于 Zeller 改良高糖培養(yǎng)基平板上劃線分離；28? ℃、光照12 h/黑暗12 h，培養(yǎng)24～48 h后觀察有無疑似菌落。挑取菌落呈橙紅色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋黃狀中心環(huán)，表面光滑，邊緣整齊疑似梨火疫病菌的單菌落在選擇性培養(yǎng)基Zeller上進行純培養(yǎng)，培養(yǎng)3次后，保存，用于后續(xù)測試。

1.2.3PCR檢測。

參考賈平喬等［12］建立的梨火疫病菌的巢式PCR檢測技術(shù)，對分離菌株提取DNA，第一輪引物為P29A/P29B，第二輪引物為PEANT1/PEANT2。PCR反應(yīng)體系參照試劑盒2×Taq PCR mix （天根生化科技（北京）有限公司）進行。體系為25 μL：2×Taq PCR mix 12.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、1.0 μL DNA、9.5 μL ddH2O；反應(yīng)程序：95? ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液電泳，SYBR Green核酸染料染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.4接種菌懸液制備。

分離物轉(zhuǎn)皿于Zeller 改良高糖培養(yǎng)基平板上，28? ℃、光照12 h/黑暗12 h，培養(yǎng) 48 h。挑取單菌落接種NB液體培養(yǎng)基，28 ℃，相對濕度75%，150 r/min振蕩培養(yǎng) 12 h后，利用紫外分光光度計測定將OD600為0.4的菌液作為接種菌懸液。

1.2.5致病性測試。

以土壤中分離所得的梨火疫病菌菌株，制備濃度為 1×108CFU/mL 的接種菌液，接種于健康香梨葉片和香梨幼果上，用滅菌水作空白對照。

離體葉片接種，在葉片基部的葉柄上用無菌注射器針頭針刺葉脈后，移液器取1 μL菌液滴在傷口處，接種香梨葉片置于滅菌培養(yǎng)皿中， 28 ℃保濕培養(yǎng)；梨幼果接種，先對待接種的梨幼果用 75%乙醇浸泡 10 min，無菌水沖洗 3 次后，輕輕擦拭干凈，用滅菌的解剖刀縱切為二，滅菌牙簽蘸取菌懸液，在香梨果縱切面上均勻接種 6 個點，置滅菌培養(yǎng)皿中 28 ℃保濕培養(yǎng)，定時觀察記錄接種葉片和幼果的發(fā)病情況。并對發(fā)病杏葉癥狀組織進行病菌的再分離培養(yǎng)和檢測。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌分離結(jié)果

2020年4月5日采集的土壤，在2021年4月10日進行第一次劃線分離，檢測為陽性的共3個土壤樣品，樣品編號為2020040501（壤土）、2020040503（砂土）、2020040504（砂土）。2021年10月10日（550 d）時再次進行病原菌分離，經(jīng)病原形態(tài)鑒定（圖1）、PCR檢測及致病性測定確定仍有病原菌存活且具有致病性，但在2021年11月9日（580 d）第11次病菌分離時，連續(xù)分離了3次都未分離出病原菌，證實該病菌可在土壤中存活550 d（表2）。

2.2致病性測試結(jié)果

將2020040501（壤土）、2020040503（砂土）、2020040504（砂土）3個土壤樣品最后一次分離菌株制備成接種菌懸液（1×108 CFU/mL），針刺接種于香梨葉片、幼果，離體葉片、幼果接種后24 h均開始發(fā)病，接種點處有菌膿產(chǎn)生。對照無明顯變化（圖2）。

2.3PCR檢測結(jié)果

2021年4月10日分離菌株編號為2020040501、2020040503、2020040504，其土壤樣品分離病原菌接種香梨樹葉片，取發(fā)病的葉片巢式PCR檢測結(jié)果為陽性（圖3）。2021年10月10日再次分離土壤樣品病原菌接種香梨樹葉片，經(jīng)巢式PCR檢測仍為陽性。2次土壤樣品PCR檢測均為陽性，說明土壤中分離的梨火疫病菌具有致病性（圖4）。

3結(jié)論與討論

3.1討論

2020年4月5日采集的土壤，經(jīng)過2021年4月10日劃線分離及PCR檢測為陽性的3個土壤樣品，2021年10月10日（550 d）對3個土壤樣品再次進行病原菌分離時，經(jīng)病原形態(tài)鑒定、PCR檢測及致病性測定確定仍有病原菌存活且具有致病性，但在2021年11月9日（580 d）第11次病菌分離時，連續(xù)分離了3次均未分離出病原菌，證實該病菌可在土壤中存活550 d。土壤樣本保存于常溫密閉土壤采集袋中，試驗在采集土壤過程中去除沙石、枯枝等雜物以保持土壤的均一性，但土壤中微小的病殘體、雜物、腐殖質(zhì)等有機成分依然存在，可能給病原菌提供了生存的條件。因此病原菌可在土壤中長時間存活，侵染條件合適情況下，病原菌通過梨園土壤傳播的風(fēng)險依然較大。

研究表明，煙草青枯病菌在病殘體中存活時間可達210 d 左右，有些甚至在土壤和堆肥中可存活8～25年，但當(dāng)處于干燥的環(huán)境條件下會很快死亡，附著于種子表面的病菌2 d后即可全部死亡［13-14］。土壤是土傳病原細(xì)菌生命周期中的一個重要生活環(huán)境，一旦寄主植物死亡或不存在時，病原細(xì)菌可以通過改變當(dāng)前細(xì)胞生活狀態(tài)從而延長其在土壤或水環(huán)境中存活時間，一旦感知到寄主植物存在時，它們將從土壤轉(zhuǎn)移到寄主根系，然后在根表定殖并吸附植物皮層，隨后分泌致病因子穿透木質(zhì)部，進入寄主體內(nèi)繁殖，最終隨著寄主植物的死亡再次返回到土壤環(huán)境當(dāng)中。土壤病原細(xì)菌對植物的侵染是一個時空動態(tài)過程，其涉及病原菌與土壤生物和非生物因素之間的相互協(xié)同互作。土壤環(huán)境本身的復(fù)雜性以及病原菌與環(huán)境之間的相互作用是制約土傳病原菌控制效率的關(guān)鍵因素［15］。

3.2結(jié)論

試驗通過對梨園土壤浸出液進行室內(nèi)劃線分離、致病性測試以及PCR檢測，證實新疆庫爾勒市發(fā)病梨園土壤中存在梨火疫病菌。采集的土壤樣品常溫保存于實驗室內(nèi)，土壤中的梨火疫病菌存活時間可達550 d且具有致病性。

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