薩能奶山羊初乳和常乳的代謝組學分析

康佳欣，李 萌，廖敏和,3，商佳琦,3，任皓威,3，盧璽丞，劉 寧,3,

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.哈爾濱騰凝科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150028）

薩能奶山羊是中國重要的奶山羊品種之一，具有產(chǎn)奶量高、奶質(zhì)好、繁殖快和抗病能力強等特點[1]。薩能奶山羊乳是薩能奶山羊從乳腺分泌的一種白色或微黃色液體，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)素及其他代謝物。相比牛乳，山羊乳以低致敏性[2]和易消化吸收[3]的特點，深受人們的重視。

山羊乳成分易受到泌乳期、地理區(qū)域和飼料等因素的影響。目前對于泌乳期的分析較為普遍，已有研究表明隨著泌乳時間的延長，山羊乳中總干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂肪含量均呈下降趨勢[4-5]，這些研究集中于分析不同泌乳期間常規(guī)乳成分的差異，但對于山羊乳中小分子代謝物的研究鮮有報道，小分子代謝物的變化通常采用代謝組學方法進行分析。

代謝組學是“組學”科學的一個新分支，研究特定有機體中代謝物組成和相關(guān)代謝通路分析的一門學科，主要技術(shù)手段包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[6-7]。代謝組學技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分析不同泌乳期乳中的代謝物差異，Li Mohan等[8]采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)比較不同泌乳期母乳的代謝物變化，共篩選出72 個差異性代謝物，與成熟乳相比，初乳中高豐度代謝物有17 個，豐度下調(diào)有55 個。Wu Junfang等[9]采用NMR技術(shù)對比不同泌乳期人乳的差異性代謝物，與泌乳9～24 d相比，泌乳31～87 d的乳糖和膽堿等物質(zhì)相對含量升高，檸檬酸和磷酸膽堿等物質(zhì)相對含量降低；Klein等[10]采用NMR和GC-MS技術(shù)對比泌乳早期和晚期牛乳中代謝物差異，共檢測出44 個差異性代謝物，丙酮和β-羥基丁酸可作為泌乳早期潛在的標志性代謝物；Li Mohan等[11]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法分析驢初乳和驢常乳的代謝物差異，共識別出52 個差異性代謝物，與驢常乳相比，驢初乳中有44 個代謝物豐度上調(diào)，8 個代謝物豐度下調(diào)，這些研究證實了代謝組學可以用于區(qū)分不同泌乳期乳中的差異性代謝物。

因此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole electrostatic field orbitrap mass spectrometry，UPLC-QE-orbitrap-MS）非靶向代謝組學方法，對薩能奶山羊初乳和常乳中的代謝物進行綜合表征，進一步分析相關(guān)的代謝通路，篩選出它們的標志性代謝物。本研究全面了解薩能奶山羊初乳和常乳的小分子代謝物成分變化，結(jié)果將有助于羊乳營養(yǎng)的進一步研究，并為分析不同泌乳期的其他物種原料乳提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薩能奶山羊初乳（產(chǎn)后3 d）和常乳（產(chǎn)后120 d）由黑龍江綠能生態(tài)牧業(yè)有限公司提供。

甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水（均為色譜級）德國CNW公司；超純水 香港屈臣氏集團有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW分析天平 德國Sartorius公司；Vanquish UPLC儀、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)、Heraeus Fresco17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

隨機選取16 只薩能奶山羊，初乳和常乳各采集8 個樣品，每個樣本人工采集40～45 mL初乳或常乳存放于50 mL無菌離心管中并作好標記。薩能奶山羊要求健康且體質(zhì)量相近，胎次為1 胎，平均泌乳期250～270 d，喂養(yǎng)的飼料以苜蓿和青貯為主。在擠奶前用45～50 ℃的溫水清洗乳房部位，消毒乳頭，避免乳頭表面的菌污染乳汁。所有采集的樣品在6 h內(nèi)經(jīng)過冷鏈運輸至實驗室，放入超低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品預處理

將樣品在4 ℃解凍，取50 μL樣品至離心管中，加入400 μL提取液（甲醇和乙腈以體積比為1∶1混合，含同位素標記內(nèi)標混合物），渦旋混勻30 s。隨后在冰水浴中超聲10 min，-40 ℃冰箱中孵育1 h，沉淀蛋白。然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液過膜后轉(zhuǎn)移至進樣瓶中上機檢測。所有樣品另取等量上清液混合成質(zhì)控樣品上機檢測。

1.3.3 檢測條件[12]

UPLC 條件：色譜柱為UPLCBEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速為500 μL/min；柱溫為30 ℃；樣品盤溫度為4 ℃；流動相A為水相（含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水），流動相B為乙腈；進樣體積為3 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

MS條件：Q Exactive HFX質(zhì)譜儀在采集軟件（Xcalibur，Thermo）的控制下，進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，以信息依賴采集模式獲取全掃描MS譜。電噴霧電離源條件為鞘氣體流量50 arb；輔助氣體流量10 arb；毛細管溫度320 ℃；全MS分辨率60 000，MS/MS分辨率7 500；碰撞能量10/30/60 eV；在正和負模式下離子噴霧電壓分別為3 500 V和-3 200 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內(nèi)核為XCMS）進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB（V2.1）二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-QE-orbitrap-MS圖譜分析

采用UPLC-QE-orbitrap-MS法分別在正、負離子模式下對初乳和常乳進行信息采集，由圖1可知，在正、負離子模式下初乳和常乳的總離子流圖基線平穩(wěn)，說明儀器的穩(wěn)定性良好。出峰時間、響應強度以及出峰數(shù)量存在差異，但是不能直觀獲取到樣品的小分子代謝物信息，所以需要對原始數(shù)據(jù)進一步處理。

圖1 初乳和常乳隨機單個樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of random individual samples of colostrum and mature milk

2.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）

為判別初乳和常乳樣品組間差異，采用PCA方法進行多元統(tǒng)計分析。圖2A、B分別為正負離子模式下初乳和常乳的PCA得分圖，正離子模型參數(shù)為＝0.581＞0.5（為模型對X變量的解釋性），負離子模型參數(shù)為＝0.633＞0.5，說明擬合性較好，模型較穩(wěn)定。由圖2可知，所有樣品均在95%置信區(qū)間內(nèi)，初乳大多數(shù)集中在置信區(qū)間上側(cè)；常乳大部分集中在置信區(qū)間下側(cè)，這說明初乳和常乳能夠區(qū)分開，存在組間差異，但是兩組組內(nèi)差異較大，這可能是因為PCA是一種無監(jiān)督的分析方法，不能忽略組內(nèi)差異[13]，因此需要采用一種有監(jiān)督的方法進一步分析。

圖2 初乳和常乳的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of colostrum and mature milk

2.3 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的分析方法，這種模型可以減少組內(nèi)差異、放大組間差異，排除無關(guān)因素對實驗數(shù)據(jù)造成的影響[14-15]，因此本實驗又采用OPLS-DA模型對初乳和常乳樣品進行分析。圖3A、B分別為正負離子模式下初乳和常乳的OPLS-DA得分圖，在正離子模式下＝0.398，＝0.94，Q2＝0.648（為模型對Y變量的解釋性，Q2為模型的可預測性）；在負離子模式下＝0.38，＝0.959，Q2＝0.739。這兩個模型的和Q2都大于0.5，說明模型的穩(wěn)定性較好，所有樣品都處于95%置信區(qū)間內(nèi)，初乳全部分布在置信區(qū)間左側(cè)，常乳全部分布在置信區(qū)間右側(cè)，初乳和常乳組間區(qū)分顯著，OPLS-DA結(jié)果優(yōu)于PCA。從分布形態(tài)上看，初乳樣品較分散，常乳樣品較集中，這可能是由于初乳中薩能奶山羊個體差異較大，導致組內(nèi)差異較大。雖然薩能奶山羊個體差異會對初乳內(nèi)代謝物產(chǎn)生一定影響，但是兩組樣品組間區(qū)分顯著，這說明不同泌乳期的影響大于個體差異影響。圖3C、D分別為正負離子模式下初乳和常乳的OPLS-DA置換檢驗圖，通過置換檢驗判斷OPLS-DA是否出現(xiàn)過度擬合。和Q2的回歸線與橫坐標相交小于0，說明模型可靠。置換檢驗隨機模型的Q2值均小于原模型的Q2值，說明原模型有較好的穩(wěn)定性，不存在過度擬合現(xiàn)象。

圖3 初乳和常乳的OPLS-DA得分圖和OPLS-DA置換檢驗圖Fig.3 OPLS-DA score plot and OPLS-DA permutation test of colostrum and mature milk

2.4 差異性代謝物的篩選

篩選OPLS-DA模型中t檢驗的P＜0.05，同時滿足VIP＞1的數(shù)據(jù)，與BiotreeDB（V2.1）二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行匹配得到118 個差異性代謝物（表2、3），其中初乳中有62 個代謝物相對含量高于常乳，有56 個代謝物相對含量低于常乳。在這些差異性代謝物中脂質(zhì)代謝物的種類較為豐富，包括磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，P C）、甘油二酯（diacylglycerol，D G）、鞘磷脂（sphing omyelin，S M）、磷脂酰乙酰胺（phosphatidylethanolamine，P E）、神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）。已有研究表明初乳和常乳中脂質(zhì)的含量和種類不同[16-17]，本研究證實了這一點。初乳中有9 個脂質(zhì)代謝物分別為3 個PC、2 個DG、2 個SM、1 個PE和1 個Cer；常乳中有10 個脂質(zhì)代謝物分別為5 個Cer、3 個PC、1 個DG、1 個PE和1 個PI，可以看出SM在初乳中相對含量高于常乳，PI在初乳中相對含量低于常乳，Liu Hongyan等[18]通過對比山羊初乳和常乳的脂質(zhì)組成發(fā)現(xiàn)與常乳相比，初乳中SM的相對含量升高，PI的相對含量降低，與本研究結(jié)果一致。在初乳的脂質(zhì)差異性代謝物中，PC(22:0/P-16:0)的差異倍數(shù)最大，在初乳中相對含量是常乳中的6.14 倍，它又稱卵磷脂，研究表明在大腦中PC在乙?；傅淖饔孟屡c乙酰輔酶A反應生成乙酰膽堿，乙酰膽堿具有強化大腦神經(jīng)突觸發(fā)育的功效[19]，因此PC在初乳中相對含量升高可能與新生羊羔的大腦神經(jīng)發(fā)育有關(guān)。

表2 正離子模式下初乳和常乳對比的差異性代謝物Table 2 Differential metabolites between colostrum and mature milk in positive ion mode

表3 負離子模式下初乳和常乳對比的差異性代謝物Table 3 Differential metabolites between colostrum and mature milk in negative ion mode

常乳中2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）的相對含量高于初乳，是常乳中差異倍數(shù)最大的代謝物，它在常乳中相對含量是初乳的12.97 倍。2′-FL是人乳中最重要的低聚糖之一[20]，具有增強嬰兒免疫[21]、促進腸道菌群生長[22]等作用，一些商家已經(jīng)把2′-FL應用于嬰兒配方食品中使得成分和營養(yǎng)價值更接近人乳，這可能是羊乳更適合嬰幼兒食用的原因之一。

初乳中存在一些相對含量高于常乳的二肽，如γ-谷氨酰胺基亮氨酸、蘇氨酸精氨酸、天冬氨酸-脯氨酸和N-鳥氨酸-L-?；撬?，它們在初乳中的相對含量是常乳的3.52、2.85、2.00、1.37 倍，在體內(nèi)二肽可以參與蛋白質(zhì)的合成，進一步被組織利用合成蛋白質(zhì)[23]。初乳中的?；撬岢硕男问酵膺€有多種存在形式，如?；撬帷⑴；敲撗跄懰?、?；悄懰?、亞?；撬?、?；切苋パ跄懰?，它們在初乳中相對含量是常乳的5.46、5.24、4.35、4.19、1.86 倍，其中?；撬崾浅跞橹胁町惐稊?shù)排名第2的代謝物，它是一種含硫的半必需氨基酸，可以提高神經(jīng)元的存活率、促進海馬神經(jīng)元的生長、具有調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸以及腦組織中miRNA表達的作用[24-26]。?；撬徇€可以與脫氧膽酸或膽酸結(jié)合生成牛磺脫氧膽酸或?；悄懰?，后兩者在羊羔體內(nèi)起到促進脂質(zhì)類物質(zhì)吸收的作用[27-28]。由此可見，初乳可以為新生羊羔的生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng)。

初乳中一些核苷類代謝物的相對含量高于常乳，如鳥苷、肌苷、N6-甲基腺苷，它們在初乳中相對含量是常乳的2.50、2.40、1.71 倍，前兩者在與磷酸結(jié)合后合成鳥苷酸和肌苷酸，它們是核苷酸類化合物參與了生物體內(nèi)幾乎所有的生物化學反應，如多種單體核苷酸經(jīng)過脫水縮合后合成DNA和RNA。此外，核苷酸也可以提高嬰兒的免疫調(diào)節(jié)功能和記憶力[29]。

2.5 差異性代謝物的代謝通路分析

薩能奶山羊的泌乳過程是多個代謝通路共同調(diào)控的復雜過程，不能通過某一代謝物相對含量的高低進行整體判斷，因此為更全面、更系統(tǒng)地了解薩能奶山羊初乳到常乳泌乳期間的生物學變化，需要進一步對差異性代謝物的代謝通路進行分析。通過與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）中的代謝通路數(shù)據(jù)庫進行匹配后進行富集分析和拓撲分析，篩選出與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。初乳和常乳對比的關(guān)鍵代謝通路分析結(jié)果（表4）表明，共篩選出9 條代謝通路，1號為正負離子模式下共同檢測出的通路，2～7號為正離子模式，8～9號為負離子模式，分別為?；撬岷蛠喤；撬岽x、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成、檸檬酸循環(huán)、煙酸和煙酰胺代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、酪氨酸代謝、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝、一次性膽汁酸生物合成。為了更直觀地看出這些代謝通路在富集分析中的富集顯著情況以及拓撲分析中的影響程度，將上述9 條代謝通路以氣泡圖展示（圖4A）。氣泡圖中每一個氣泡代表一條代謝通路，氣泡顏色表示該通路在富集分析中的P值，顏色越深P值越小，富集程度越顯著；氣泡大小表示拓撲分析的影響因子大小，氣泡越大影響因子越大[30]。從圖4A可以看出，?；撬岷蛠喤；撬岽x的顏色最深且氣泡最大，說明這條代謝通路富集程度最顯著且影響因子最大，且命中代謝物數(shù)量最多，分別為?；撬?、亞?；撬岷团；悄懰?，它們在初乳中的差異倍數(shù)較大，顯著高于常乳中的相對含量（P＜0.05），這可能是該通路富集程度最顯著且影響因子最大的原因之一。已有研究表明牛磺酸的含量會隨著泌乳時間的延長而逐漸降低[8,25]，這與本研究的結(jié)果一致。實驗還觀察到半乳糖代謝氣泡大小僅次于?；撬岷蛠喤；撬岽x，說明這條代謝通路的影響因子較大，這可能是與該通路的命中代謝物差異倍數(shù)有關(guān)，初乳中α-乳糖的相對含量是常乳的4.16 倍，顯著高于常乳中的相對含量（P＜0.05），可能導致該通路影響因子較大[11,31-32]。

圖4 初乳和常乳的代謝通路氣泡圖（A）和路徑圖（B）Fig.4 Bubble chart (A) and roadmap (B) of metabolic pathways in colostrum and mature milk

表4 初乳和常乳對比的關(guān)鍵代謝通路分析Table 4 Analysis of key metabolic pathways in colostrum and mature milk

為了更系統(tǒng)地了解泌乳期間的代謝通路之間的相關(guān)性，參考KEGG代謝物數(shù)據(jù)庫中代謝通路圖譜將這9 條關(guān)鍵代謝通路連接在一起（圖4B）。圖4B中紅色表示該代謝物在初乳中相對含量高于常乳，藍色表示該代謝物在初乳中相對含量低于常乳，黑色表示未匹配到的代謝物，由此可知初乳中相對含量高的代謝物為?；撬?、亞?；撬?、?；悄懰?、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、琥珀酸、異檸檬酸、D-麥芽糖、α-乳糖、4-羥基苯基丙酮酸、甘氨酸，常乳中相對含量高的代謝物為N1-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺，它們可作為這種薩能奶山羊初乳和常乳中潛在的標志性代謝物。從圖4B可以看出，除N1-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺外，其他代謝物都經(jīng)過一系列的代謝通路后最終進入檸檬酸循環(huán)，如亞?；撬?、?；悄懰?、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D-麥芽糖、α-乳糖轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A進入檸檬酸循環(huán)，4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)換為琥珀酸進入檸檬酸循環(huán)，因此可以推測在泌乳初期檸檬酸循環(huán)起到橋梁作用，為新生羊羔健康生長提供充足的能量。在12 個命中代謝物中，僅有N1-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺在初乳中的相對含量低于常乳，這可能是因為初乳中大部分煙酸生成琥珀酸，使得生成N1-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺的相對含量降低。

3 結(jié)論

以薩能奶山羊初乳和常乳為研究對象，采用UPLCQE-orbitrap-MS的非靶向代謝組學方法，研究泌乳期對薩能奶山羊乳中代謝物的影響。結(jié)果表明：初乳中脂質(zhì)代謝物、二肽類代謝物、核苷類代謝物、?；撬峒捌溲苌锏?2 個差異性代謝物的相對含量顯著高于常乳（P＜0.05），2′-FL等56 個差異性代謝物的相對含量顯著低于常乳（P＜0.05）。篩選出與差異性代謝物匹配最高的9 條關(guān)鍵通路，它們共同表征薩能奶山羊的泌乳過程的代謝物差異，這些代謝通路的命中差異性代謝物數(shù)量為12 個，初乳中相對含量高的代謝物為牛磺酸、亞?；撬帷⑴；悄懰?、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、琥珀酸、異檸檬酸、D-麥芽糖、α-乳糖、4-羥基苯基丙酮酸、甘氨酸，常乳中相對含量高的代謝物為N1-甲基-4-吡啶酮-3-羧酰胺，它們可作為薩能奶山羊初乳和常乳中潛在的標志性代謝物，在更多樣本測定中加以驗證。本研究結(jié)果有利于了解在不同泌乳期間薩能奶山羊乳中小分子營養(yǎng)成分的變化，為鑒別不同泌乳期的其他物種乳提供相應的參考。