基于SSR標(biāo)記的芡實遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

徐 君 尹渝來 薛博文 周榮華 孫芳芳

（蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇蘇州 215000）

芡實（EuryaleferoxSalish.）是一年生大型草本水生蔬菜，屬睡蓮科芡屬（趙有為，1999）。我國的芡實可分為兩大類：一類是刺芡，全身密生刺，不適合人工栽培，籽粒殼薄、粒小、粳性；另一類是蘇芡，除葉背外全身無刺，適于人工栽培，籽粒殼厚、粒大、糯性（鮑忠洲，2010）。為發(fā)揮不同類型芡實的優(yōu)勢，研究人員開展了芡實的雜交育種工作（鮑忠洲 等，2010），通過系統(tǒng)選育獲得了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)芡實新品種（尹渝來 等，2015）。為不斷優(yōu)化和創(chuàng)新芡實種質(zhì)資源，需對現(xiàn)有芡實材料的遺傳多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的明確。

與形態(tài)學(xué)鑒定相比，分子標(biāo)記是一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的遺傳多樣性分析方法。目前，國內(nèi)外對芡實資源的分子標(biāo)記研究報道不多。國內(nèi)學(xué)者通過擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）兩種分子標(biāo)記對芡實和王蓮的雜交后代進(jìn)行了分析研究（游永寧 等，2012），日本（Ayumi et al.，2011）和印度（Nitish et al.，2018）的學(xué)者分別采用簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記對本國的芡實資源做了遺傳多樣性分析。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的DNA 多態(tài)性檢測技術(shù)，具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和遺傳信息量大的特點，被國際植物新品種保護(hù)聯(lián)合會認(rèn)定為鑒定植物品種的重要工具（Bachmann et al.，1990；張海雯 等，2020），已經(jīng)成功應(yīng)用于馬鈴薯（安苗 等，2023）、蘿卜（王慶彪 等，2021）、青花菜（管俊嬌 等，2021）、甜瓜（李超 等，2022）、苦瓜（崔俊杰 等，2022）和荷花（杜鳳鳳 等，2016；劉藝平 等，2023）等作物。本研究對包括蘇芡和刺芡在內(nèi)的10 份芡實材料進(jìn)行SSR 擴(kuò)增，并對芡實籽粒品質(zhì)性狀進(jìn)行了檢測和分析，以期明確國內(nèi)芡實種質(zhì)資源間的遺傳距離，為芡實育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試10 份芡實材料取自蘇州市水生蔬菜資源保存圃，包括有刺芡實2 份和無刺芡實8 份，無刺芡實中包括4 份地方栽培種和4 份雜交中間材料，具體信息見表1。采用池栽方式，每份材料一池，每池3 株，于2020年4月清明前播種，6月定植，定植后10 d 每株選1 片健康葉片打孔取樣，樣本洗凈混合后用液氮處理并于-20 ℃保存。

表1 供試10 份芡實材料主要信息

1.2 DNA 提取和驗證

使用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒（B518261）提取全基因組DNA，使用Nano drop2000 檢測DNA 的純度和濃度，將提取DNA 濃度稀釋至20 ng·μL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR 分子標(biāo)記檢測

選用已報道的10 對微衛(wèi)星引物Efer004、Efer008、Efer013、Efer015、Efer023、Efer032、Efer037、Efer045、Efer047 和Efer136（表2）進(jìn)行擴(kuò)增（Ayumi et al.，2011）。根據(jù)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建芡實指紋圖譜并進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)的總體積為20.0 μL：2.5 μL DNA 模板，10 μL 2×PCR mix 和10 nmol·L-1正、反向引物各2 μL，不足體積用ddH2O 補足。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測使用Qsep100 核酸蛋白檢測儀（臺灣），并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。內(nèi)參大小依次為20、26、34、67、76、90、110、123、147、160、180、190、201、217、238、242、307、404、527、622、1 000 bp。

表2 10 對SSR 引物信息

1.4 品質(zhì)性狀測定

每品種取大旦期芡實去殼籽粒（雞頭米仁），測定水分含量及干燥籽粒的總淀粉、直鏈淀粉、粗脂肪、蛋白質(zhì)、磷、鉀、多酚及總黃酮含量。水分含量的測定采用直接干燥法（GB 5009.3-2016），總淀粉含量的測定采用酶水解法（GB 5009.9-2016），直鏈淀粉含量的測定采用單波長比色法（吳遠(yuǎn)琴 等，2014），粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法（GB 5009.6-2016），蛋白質(zhì)含量的測定采用分光光度法（GB 5009.5-2016），磷含量的測定采用分光光度法（GB 5009.87-2016），鉀含量的測定采用火焰原子吸收光譜法（GB 5009.91-2017），多酚含量的測定采用福林-酚法（GB/T 8313-2018），黃酮含量的測定采用NaNO2-Al（NO3）-NaOH 比色法（胡曉瀟，2022）。以上檢測委托蘇州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)Qsep100 核酸蛋白檢測儀檢測結(jié)果，統(tǒng)計終濃度大于0.3 ng·L-1的擴(kuò)增峰數(shù)量，位點有峰計為1，無峰計為0，每個峰相當(dāng)于1 個等位基因位點。建立供試芡實材料與等位基因位點之間的0/1矩陣圖，統(tǒng)計每對引物擴(kuò)增出的總位點數(shù)（T）、多態(tài)性位點數(shù)（N）及每個位點擴(kuò)增片段的長度，計算每對引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點百分率（PPL）：PPL=（N/T）×100%。利用Cervus 3.0.7 軟件計算10 對SSR 引物的多態(tài)性信息含量（PIC），利用DPS 7.05 軟件計算供試材料間的Nei & Li 相似系數(shù)，并構(gòu)建UPGMA 聚類圖。將10 份芡實材料按照擴(kuò)增片段長度從小到大的順序依次用阿拉伯?dāng)?shù)字編碼，構(gòu)建芡實指紋圖譜（薛建華 等，2016）。品質(zhì)性狀測定數(shù)據(jù)利用DPS 7.05 軟件計算供試材料間的歐式遺傳距離并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡實SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

Qsep100 核酸蛋白檢測儀擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。統(tǒng)計10 份芡實材料SSR 擴(kuò)增結(jié)果（表3），共獲得29 個擴(kuò)增位點，其中28 個為多態(tài)性位點，PPL 為96.6%。SSR 引物的PIC 值介于0.164～0.640，平均值為0.463，4 對SSR 引物的PIC 值大于0.500，表明供試芡實材料遺傳多樣性豐富，且所選10 對SSR 引物在10 份芡實材料中具有多態(tài)性，可用于芡實親緣關(guān)系鑒定和構(gòu)建指紋圖譜。SSR 引物的擴(kuò)增片段長度存在差異，擴(kuò)增最短片段為102 bp（引物Efer047 擴(kuò)增獲得），擴(kuò)增最長片段為238 bp（引物Efer045 擴(kuò)增獲得）。

圖1 10 對SSR 引物對紅花蘇芡的擴(kuò)增結(jié)果

表3 10 份芡實材料SSR 標(biāo)記的多態(tài)性

2.2 芡實指紋圖譜的構(gòu)建

對10 份芡實材料擴(kuò)增獲得的所有位點按片段大小從小到大編碼，建立編碼標(biāo)準(zhǔn)（表4）。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，對10份芡實材料的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行編碼（表5），編碼結(jié)果可以將10 份芡實材料完全區(qū)分。因此，構(gòu)建的DNA 指紋圖譜可作為芡實品系鑒定的重要依據(jù)。

表4 10 對SSR 核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物編碼標(biāo)準(zhǔn)

表5 10 份芡實材料的SSR 指紋圖譜

2.3 芡實籽粒品質(zhì)性狀多態(tài)性分析

對10 份芡實材料進(jìn)行籽粒品質(zhì)性狀檢測（表6），10 份芡實材料薄殼籽粒均含有豐富的蛋白質(zhì)、磷、鉀等礦質(zhì)元素，以及高含量的多酚和黃酮等功能物質(zhì)。這些結(jié)果表明，芡實有很高的營養(yǎng)價值。

表6 10 份芡實材料籽粒品質(zhì)性狀

水分含量是反應(yīng)芡實籽粒成熟度（老嫩）的一個重要的指標(biāo)，芡實淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成，其中直鏈淀粉含量高低是決定芡實口感好壞的主要因素，脂肪含量也是鑒別植物種子和果實品質(zhì)優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。試驗結(jié)果顯示，供試芡實去殼籽粒水分含量在40.7%～68.8%之間，兩個刺芡（余干刺芡、白花刺芡）材料水分含量較低，分別為40.7%和46.9%，余干刺芡、白花刺芡的直鏈淀粉含量低于大多數(shù)無刺芡實，直鏈淀粉含量最低的是余干刺芡，僅為5.76%，而直鏈淀粉含量最高的無刺芡實（合肥芡實）為11.84%。此外，刺芡的粗脂肪含量也明顯低于無刺芡實，說明無刺芡實材料的品質(zhì)要優(yōu)于有刺芡實材料。

2.4 芡實材料的聚類分析

依據(jù)10 份芡實材料的SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果分析及籽粒品質(zhì)性狀檢測結(jié)果，分別對10 份芡實材料進(jìn)行聚類分析。

根據(jù)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果，10 份芡實材料間Nei & Li 相似系數(shù)如表7所示，介于0.100 0～0.894 7之間，平均值為0.580 3。通過UPGMA 聚類分析，以相異系數(shù)0.57 為閾值可將10 份芡實材料分為4個組，組Ⅰ包括地方栽培種紅花蘇芡、紫花蘇芡和雜交品系6、雜交品系40，組Ⅱ包括白花蘇芡和雜交品系7，刺芡品種余干刺芡和白花刺芡屬于組Ⅲ，組Ⅳ包括雜交品系45 和合肥芡實。說明SSR 標(biāo)記可區(qū)分不同類型的芡實資源（圖2-A）。

圖2 基于SSR 標(biāo)記和芡實籽粒品質(zhì)性狀的聚類分析及分組情況

表7 10 份芡實材料間Nei & Li 相似系數(shù)

根據(jù)籽粒品質(zhì)性狀檢測結(jié)果，10 份芡實材料間歐式遺傳距離如表8所示，介于1.878 2～7.194 6之間，平均值為4.057 5。以歐式遺傳距離3.50 為閾值可將10 份芡實材料分為3 類，其中4 個雜交品系和紫花蘇芡屬于組Ⅰ，白花蘇芡、紅花蘇芡和合肥芡實屬于組Ⅱ，2 份刺芡材料余干刺芡和白花刺芡屬于組Ⅲ。即組Ⅰ主要為芡實雜交材料，組Ⅱ主要為蘇芡的地方栽培種，組Ⅲ主要為刺芡品種（圖2-B）。

表8 10 份芡實材料間歐式遺傳距離

3 結(jié)論與討論

本研究開展了基于籽粒品質(zhì)性狀的芡實遺傳分析，該方法雖然不能完全區(qū)分芡實材料，但聚類結(jié)果能夠?qū)④蛯嶋s交材料與蘇芡、刺芡等栽培種區(qū)分，表明芡實雜交后代在關(guān)鍵性狀，如籽粒品質(zhì)等方面存在變異，因此采用雜交育種手段改善芡實籽粒品質(zhì)是可行的。這些結(jié)果對于指導(dǎo)芡實的雜交育種工作具有重要意義。

芡實植株表型性狀的差異主要表現(xiàn)在花色、籽粒色和有刺無刺等方面（鮑忠洲 等，2010），單獨采用表型鑒定的方法區(qū)分大量芡實雜交材料相對較困難，這也導(dǎo)致了研究人員易混雜芡實材料，增加了育種難度。相較于籽粒品質(zhì)性狀的聚類結(jié)果，SSR 分析結(jié)果更為精確。本試驗所用的10 對SSR引物，共獲得29 個位點信息，其中28 個為多態(tài)性位點，具有較多的遺傳信息，有利于實現(xiàn)鑒定不同類型芡實的目標(biāo)。因此本試驗采用的芡實SSR 擴(kuò)增技術(shù)體系，可有效應(yīng)用于芡實種質(zhì)資源的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳距離分析。本試驗還通過SSR 標(biāo)記構(gòu)建一套用于鑒定芡實材料的DNA 指紋編碼系統(tǒng)，10 份芡實材料都有獨特的DNA 指紋編碼。該方法為芡實種質(zhì)資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)，同時也為其他作物的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建提供參考。