乳酸菌發(fā)酵改善脫脂富硒米糠的抗氧化活性

張嘉妮，張曉軒，王大毛，趙國華，喻俊磊，雷 琳,3,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西 南昌 330046；3.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 玉林 537000）

米糠是稻米碾磨加工后，形成精米的主要副產(chǎn)物之一，含有較豐富的油脂、蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)、B族維生素、VE、谷維素及少量糖等。米糠占稻谷質(zhì)量的6%，但占稻谷營養(yǎng)的比例約60%[1]。每年，米糠產(chǎn)量在全球約52～70萬 t，在中國約11～15萬 t，其中90%用作動(dòng)物飼料，9%用于生產(chǎn)米糠油，人類食物消費(fèi)量僅占1%，米糠資源尚未得到充分利用。目前，通過外源添加開發(fā)膳食纖維強(qiáng)化食品，以解決中國居民膳食纖維攝入不足的問題，如高纖維面制品、奶制品、肉制品、飲料、糕點(diǎn)等，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[2]。然而，富硒米糠水不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）含量較高，直接添加會(huì)造成食品口感粗糙、質(zhì)地劣化等問題。富硒米糠硒含量在80～400 μg/kg，兼具硒強(qiáng)化和補(bǔ)充膳食纖維的雙重作用。我國富硒稻谷產(chǎn)區(qū)涉及恩施、開陽、宜春等10余個(gè)地區(qū)，為富硒米糠精深加工提供了原料保障。如果能夠采用合理改性方法同時(shí)提高米糠水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和有機(jī)硒含量，可為富硒米糠在食品中的添加提供新策略和技術(shù)支持。

乳酸菌發(fā)酵可提高原料營養(yǎng)價(jià)值、功能特性及感官品質(zhì)，因條件溫和，經(jīng)濟(jì)環(huán)保安全，目前是谷物加工的一種重要方法，在改善食品和成分的營養(yǎng)效果方面具有很大潛力[3]。近年來，利用乳酸菌發(fā)酵對(duì)農(nóng)副產(chǎn)品的開發(fā)利用日益廣泛，集中于米糠、麩皮、豆渣等膳食纖維特性的研究，但對(duì)富硒米糠有機(jī)硒和SDF轉(zhuǎn)化、抗氧化性的研究較少。研究表明，利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌對(duì)麩皮進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵后，SDF的產(chǎn)量從4.2%提高到7.6%，溶解度、持水和持油力、膨脹能力、亞硝酸鹽、膽酸鈉和膽固醇的吸附力等均得到提高[4]。

目前，國內(nèi)米糠精深加工位居米糠油加工下游，通行辦法是擠壓膨化處理新鮮米糠，浸提稻米油，再分級(jí)提取米糠蛋白、膳食纖維等其他功能性成分[5]。因此，本研究以擠壓膨化富硒米糠為原料，經(jīng)脫脂處理后，利用4 種乳酸菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，比較發(fā)酵后理化指標(biāo)、營養(yǎng)特性、微觀結(jié)構(gòu)、物化特性差異，并探討其抗氧化活性變化。擬采用主成分分析法對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合考察，篩選出提升抗氧化能力最強(qiáng)的乳酸菌株，以期為富硒米糠的精深加工與開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮富硒米糠 湖北恩施博方商貿(mào)公司。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus336636，La）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus134430，St）、植物乳桿菌（L.plantarum336421，Lp）、保加利亞乳桿菌（L.delbrueckiisubsp.187941，Lb）北納生物科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；甲基硒代半胱氨酸（S emethylselenocysteine，SeMeCys）、硒代胱氨酸（selenocysteine，SeCys2）、硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）（分析純）、4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯（3,5-dinitro-4-chlorobenzotrifluoride，CNBF）上海麥克林生化科技有限公司；Megazyme膳食纖維總量檢測(cè)試劑盒愛爾蘭Megazyme公司；水溶性VE（Trolox）標(biāo)準(zhǔn)品（試劑級(jí)）、福林-酚、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）（分析純）北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）東京化成工業(yè)株式會(huì)社；氯化亞鐵（分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘆丁（分析純）合肥博美生物科技有限公司；蛋白酶K上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純）北京百靈威科技有限公司；膽固醇標(biāo)品（分析純）成都市科隆化學(xué)品有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AHT36雙螺桿擠壓機(jī) 山東真諾智能設(shè)備有限公司；BSC-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；L6分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀（SPD-20A可變波長紫外檢測(cè)器）島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Pro 掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom World公司；Spectrum100紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer儀器公司；MS2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；PHS-3E pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；KDN812定氮儀上海纖檢有限公司；Scientz-10ND真空冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；PF52原子熒光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WX-7000HP微波消解儀上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

參考方芳等[6]的方法略作修改。將富硒米糠原料含水量調(diào)至20%，采用AHT36雙螺桿擠壓機(jī)對(duì)其進(jìn)行擠壓膨化滅酶處理（螺桿轉(zhuǎn)速150 r/min，擠壓膨化溫度130 ℃）。冷卻后，將其粉碎過100 目篩，稱取100 g加入300 mL正己烷，在室溫條件下磁力攪拌脫脂2 h，重復(fù)上述步驟2 次后，過濾，在45 ℃烘箱中干燥24 h至水分含量為6%，-20 ℃貯藏備用。

1.3.2 乳酸菌活化及發(fā)酵工藝

參考劉磊等[7]的方法略作修改。富硒米糠121 ℃滅菌15 min，冷卻后，將4 種保存菌株用MRS活化為乳酸菌懸液8（lg（CFU/mL））后分別接種，接種量6%，置于37 ℃恒溫發(fā)酵48 h，-80 ℃冷凍12 h后真空冷凍干燥48 h，分別得到嗜酸乳桿菌發(fā)酵樣品（La-ERB）、嗜熱鏈球菌發(fā)酵樣品（St-ERB）、植物乳桿菌發(fā)酵樣品（Lp-ERB）和保加利亞乳桿菌發(fā)酵樣品（Lb-ERB），未接種乳酸菌樣品即為對(duì)照（CERB），-20 ℃貯藏備用。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定依據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行；還原糖測(cè)定依據(jù)3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行，檢測(cè)波長為540 nm（D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.354 2x-0.044 3，R2＝0.993 0）[7]；總膳食纖維（total dietary fiber，TDF）、SDF、IDF采用Megazyme膳食纖維總量檢測(cè)試劑盒測(cè)定：將1 g樣品依次經(jīng)過α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶消化后，過濾，乙醇和丙酮洗滌殘?jiān)蟾稍?，稱質(zhì)量得到TDF殘?jiān)幻附庖和ㄟ^直接過濾、熱水洗滌殘?jiān)?，干燥后稱質(zhì)量，得到IDF殘?jiān)?；TDF、IDF殘?jiān)鄢鞍踪|(zhì)、灰分和空白即得TDF、IDF含量；TDF和IDF含量差值即為SDF含量；pH值及總酸度的測(cè)定依據(jù)AACC(2000)02—52方法[8]進(jìn)行；活菌數(shù)測(cè)定依據(jù)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢測(cè) 乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行。

1.3.4 硒含量的測(cè)定

總硒含量參照GB 5009.93—2017《食品中硒的測(cè)定》，無機(jī)硒含量參照DBS 42/010—2018《富硒食品中無機(jī)硒的測(cè)定方法》。取0.5 g樣品加入8 mL濃硝酸，混勻，敞口在通風(fēng)櫥放置10 min后放入微波消解儀進(jìn)行消解，程序如表1所示。消解結(jié)束后室溫冷卻，將消解液倒入玻璃消解管中加入5 mL鹽酸溶液（6 mol/L），在恒溫消解儀中繼續(xù)加熱至溶液清亮，待溶液冷卻后，定容至10 mL，采用原子熒光光譜法測(cè)定?？偽蜔o機(jī)硒含量差值即為有機(jī)硒含量。

表1 微波消解程序設(shè)定Table 1 Microwave digestion program settings

1.3.5 硒代氨基酸的測(cè)定

參考張路夢(mèng)[9]的方法略作修改，采用柱前衍生-反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

樣品前處理：稱取0.1 g樣品，加入1 mL Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，30 mmol/L），室溫超聲30 min后，加入1 mL蛋白酶K溶液（2.5 mg/mL溶于pH 7.5 Tris-HCl緩沖溶液），混勻后充氮?dú)猓?8 ℃恒溫振蕩反應(yīng)4 h，離心取上清液。

樣品衍生化：取0.4 mL上清液，加入0.8 mL硼酸緩沖液（pH 9.0）和0.6 mL CNBF衍生劑（70 mmol/L溶于乙腈），封口，60 ℃水浴30 min后冷卻至室溫，用硼酸緩沖液定容至3 mL，振蕩30 s，再靜置10 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。分別取質(zhì)量濃度為8、16、32、48、64、80 μg/μL的SeMeCys、SeMet、SeCys2標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法衍生化。

色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為30 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.9，含0.02%三乙胺）；流動(dòng)相B為乙腈-水（1∶1，V/V）；柱溫：30 ℃；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長：240 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

梯度洗脫條件：0～5 min，84% A、16% B；5～10 min，84%～64% A、16%～36% B；10～20 min，64%～55% A、36%～45% B；20～30 min，55%～40% A、45%～60% B；30～35 min，40%～35% A、60%～65% B；35～50 min，35%～30% A、65%～70% B；50～55 min，30%～16% A、70%～84% B；55～60 min，84% A、16% B。

硒代氨基酸相對(duì)轉(zhuǎn)化效力通過式（1）計(jì)算：

1.3.6 總酚和總黃酮測(cè)定

參照張媛等[10]的方法并略作修改。稱取1 g樣品，加入80%的甲醇溶液30 mL，室溫下避光磁力攪拌2 h后，6 000 r/min離心15 min，收集上清液定容至50 mL，4 ℃避光貯藏待測(cè)?？偡雍坎捎酶Ａ?酚比色法測(cè)定，總黃酮含量采用硝酸鋁比色法測(cè)定[11]。

1.3.7 粒徑的測(cè)定

參照龔衛(wèi)華等[12]的方法，采用激光粒度儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，粒徑分布由D10、D50、D90和跨度值Span表述。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）測(cè)定

參照龔衛(wèi)華等[13]的方法，將富硒米糠與溴化鉀混合研磨后壓片，檢測(cè)波數(shù)范圍為600～4 500 cm-1，掃描次數(shù)32 次，分辨率4 cm-1。

1.3.9 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

參照薛艾蓮等[14]的方法并作修改，取適量樣品固定在導(dǎo)電膠上，噴金處理樣品，在加速電壓10 kV下放大500 倍和5 000 倍進(jìn)行圖像采集。

1.3.10 水合特性和持油力測(cè)定

參考Huang Xin等[15]的方法并作修改，進(jìn)行持水力、膨脹力、溶解性及持油力測(cè)定。

1.3.10.1 持水力測(cè)定

取0.2 g（m1）樣品于10 mL離心管（質(zhì)量為m2），加入5 mL蒸餾水，渦旋，37 ℃振蕩1 h，4 000 r/min離心20 min后，棄掉上清液，稱離心管和吸水后米糠總質(zhì)量（m3），持水力通過式（2）計(jì)算：

1.3.10.2 膨脹力測(cè)定

取0.2 g（m1）樣品置于10 mL量筒，記錄體積V1，加入8 mL蒸餾水，渦旋混勻，室溫下靜置24 h，記錄體積V2，膨脹力通過式（3）計(jì)算：

1.3.10.3 溶解性測(cè)定

取約0.5 g（m1）樣品置于離心管，加入8 mL蒸餾水，80 ℃水浴振蕩30 min，4 000 r/min離心20 min后，取上清液于質(zhì)量恒定燒杯（質(zhì)量為m2），于105 ℃烘干至質(zhì)量恒定，記錄燒杯與米糠總質(zhì)量（m3），根據(jù)式（4）計(jì)算：

1.3.10.4 持油力測(cè)定

取約0.2 g（m1）樣品于10 mL離心管（質(zhì)量為m2）中，加入5 mL葵花籽油，渦旋，37 ℃振蕩1 h，4 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，稱離心管和米糠總質(zhì)量（m3），持油力通過式（5）計(jì)算：

1.3.11 膽固醇吸附力測(cè)定

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以膽固醇為標(biāo)準(zhǔn)品，采用鄰苯二甲醛法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.003 1x＋0.027，R2=0.996 0。

膽固醇吸附力測(cè)定根據(jù)Nsor-Atindana等[16]的方法并稍加修改。將約0.2 g富硒米糠（m1）與10 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）充分混勻（質(zhì)量為m2），37 ℃下恒溫振蕩2 h后，8 000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清液于試管中，加入1.5 mL鄰苯二甲醛溶液（0.1 mg/mL），和1 mL濃硫酸，渦旋30 s，室溫下放置10 min，于550 nm波長處測(cè)定吸光度，結(jié)合膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液膽固醇含量m3。膽固醇吸附力通過式（6）計(jì)算：

1.3.12 抗氧化活性測(cè)定

分別吸取1.3.6節(jié)提取的上清液，進(jìn)行DPPH自由基清除活性[17]、ABTS陽離子自由基清除活性[18]和鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)ARP）測(cè)定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵對(duì)富硒米糠理化特性和基本組分的影響

表2表明，不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)富硒米糠理化特性和基本組分的影響存在一定差異。4 種乳酸菌均能在富硒米糠體系中生長。乳酸菌能利用米糠還原糖作為碳源產(chǎn)酸[7]。經(jīng)48 h發(fā)酵后，與CERB相比，St、Lp具有更強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵后總酸質(zhì)量濃度分別增加190%、208%，而La、Lb發(fā)酵后總酸質(zhì)量濃度分別增加124%、161%；La、St、Lp、Lb還原糖含量分別降低42%、50%、47%、48%。4 種乳酸菌發(fā)酵的富硒米糠總蛋白含量無顯著差異。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)脫脂富硒米糠理化指標(biāo)、基本組分和功效成分的影響Table 2 Effects of different strains on the physicochemical properties,proximate and biological components of defatted selenium-rich rice bran

2.2 乳酸菌發(fā)酵對(duì)功效成分的影響

如表2所示，不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)脫脂富硒米糠功效成分的影響存在一定差異。發(fā)酵對(duì)富硒米糠TDF質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著影響，但St、Lp、La能顯著促進(jìn)IDF轉(zhuǎn)化為SDF，IDF/SDF分別增加45%（St-ERB）、29%（Lp-ERB）、20%（La-ERB）。嗜熱鏈球菌[20]、植物乳桿菌[21]、嗜酸乳桿菌[22]在發(fā)酵時(shí)可能產(chǎn)生半纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等物質(zhì)，有利于將IDF轉(zhuǎn)化為SDF等。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，富硒米糠總酚、總黃酮含量分別增加5%～6%、16%～31%。本研究中Lp提升總酚的能力強(qiáng)于其他乳酸菌，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生更多的酶分解糖苷鍵和酯鍵等，釋放出更多的結(jié)合酚[23]；而La發(fā)酵后總酚和總黃酮含量無顯著差異（P＞0.05），說明不同菌株發(fā)酵導(dǎo)致富硒米糠總酚和總黃酮含量的變化具有差異性[24]。

如表2所示，脫脂富硒米糠主要含有機(jī)硒，占總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)73%以上。與對(duì)照組CERB相比，乳酸菌發(fā)酵能顯著降低無機(jī)硒含量，有機(jī)硒/總硒增加7%～13%。乳酸菌通過代謝，能將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為生物利用率更高、毒性更小的有機(jī)硒[25]。脫脂富硒米糠有機(jī)硒主要含SeMet、SeCys2和SeMeCys。與對(duì)照組CREB相比，經(jīng)La、Lp、Lb發(fā)酵48 h后無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為SeCys2的能力分別提高了49%、42%、49%（圖1）。SeCys2能夠進(jìn)一步被合成為硒蛋白，發(fā)揮抗氧化防御、調(diào)節(jié)甲狀腺激素代謝等作用[26]。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)SeMet、SeCys2和SeMeCys相對(duì)轉(zhuǎn)化效力的影響Fig.1 Effects of different strains on the relative conversion rates of SeMet,SeCys2 and SeMeCys

2.3 乳酸菌發(fā)酵對(duì)脫脂富硒米糠粒徑和結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 粒徑分析

不同乳酸菌發(fā)酵顯著降低了富硒米糠粒徑（圖2，P＜0.05）。Lp-ERB組的D10、D50、D90、Span最小。Span描述了粉體分布的寬度，粒徑分布范圍越窄，粉末均勻性越好。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸有助于降解大分子纖維素，減小粒徑[27]。富硒米糠粒徑越小，比表面積越大，持水能力越強(qiáng)，口感越細(xì)膩，總酚、總黃酮含量的提取率越高（表2）。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)粒徑的影響Fig.2 Effects of different strains on particle size

2.3.2 FTIR分析

不同乳酸菌發(fā)酵后富硒米糠吸收峰無顯著變化（圖3）。3 312 cm-1附近出現(xiàn)寬且圓滑的吸收峰，是纖維素和半纖維素O—H的伸縮振動(dòng)形成。3 017 cm-1和2 851 cm-1附近的吸收峰是糖類—CH2的伸縮振動(dòng)形成。1 710 cm-1附近的吸收峰為脂類曲振動(dòng)和蛋白質(zhì)酰胺I帶形成；1 531～1 152 cm-1附近的吸收峰為蛋白質(zhì)和多糖的混合振動(dòng)形成；1 021 cm-1附近的吸收峰主要是木質(zhì)素、纖維素和半纖維素C—O—C和C—O的伸縮振動(dòng)形成[28]。乳酸菌發(fā)酵后，3 312 cm-1附近的吸收峰稍小于CERB組，表明乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸或酶減弱了纖維素和半纖維素的分子間氫鍵相互作用力，但能力有限。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)FTIR的影響Fig.3 Effects of different strains on FTIR spectrum

2.3.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察

不同乳酸菌發(fā)酵后富硒米糠在500和5 000 倍數(shù)下的顯微對(duì)比如圖4所示。與CERB組相比，乳酸菌發(fā)酵48 h后，富硒米糠空間結(jié)構(gòu)更疏松，顆粒更小，比表面積增加。松散的結(jié)構(gòu)有助于提升脫脂富硒米糠的水化和吸附性能[28]。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of different strains on microstructure

2.4 乳酸菌發(fā)酵對(duì)物化特性的影響

如表3所示，乳酸菌發(fā)酵48 h后，富硒米糠持水力、膽固醇吸附力、溶解性得到顯著提升（P＜0.05），膨脹力顯著降低，持油力無顯著變化（P＞0.05）。與CERB相比，La-ERB、St-ERB、Lp-ERB、Lb-ERB持水力和溶解性分別提升7%～20%和6%～18%，這是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵產(chǎn)生酸或酶減弱了纖維素和半纖維素分子間氫鍵相互作用力（圖3），而且富硒米糠結(jié)構(gòu)更疏松（圖4），暴露出更多的極性基團(tuán)，與水形成更多的氫鍵或偶極子[28]。對(duì)于糖脂代謝紊亂人群，高膽固醇攝入會(huì)增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。與CERB相比，La-ERB、St-ERB、Lp-ERB、Lb-ERB膽固醇吸附力提升了3.2～7.6 倍，這是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵使富硒米糠結(jié)構(gòu)變得疏松多孔（圖4），且SDF質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加（表2）。相反，與CREB相比，乳酸菌發(fā)酵后富硒米糠膨脹力降低了3%～19%，這可能是因?yàn)榉胖?4 h后富硒米糠自身重量的擠壓和顆粒物的沉降作用，導(dǎo)致膨脹力減小。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)物化特性的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria fermentation on hydration properties

2.5 乳酸菌發(fā)酵對(duì)抗氧化能力的影響

如圖5所示，與CERB相比，La-ERB、St-ERB、Lp-ERB、Lb-ERB對(duì)DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力及總抗氧化能力分別提升113%～215%、4%～13%和8%～13%。這可能與乳酸菌發(fā)酵使富硒米糠變得疏松多孔，被束縛的酚類和黃酮類物質(zhì)更容易釋放，總酚和總黃酮含量升高有關(guān)[10]。

圖5 乳酸菌發(fā)酵對(duì)體外抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of different strains on antioxidant activity in vitro

2.6 乳酸菌發(fā)酵各指標(biāo)與抗氧化活性的相關(guān)性及主成分分析

2.6.1 各指標(biāo)變化與抗氧化活性的相關(guān)性分析

如表4所示，DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP值與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），但與總酚呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力與總酸呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；DPPH自由基清除能力和FRAP與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；DPPH自由基清除能力和總黃酮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵富硒米糠產(chǎn)生的有機(jī)酸、總酚和總黃酮含量對(duì)抗氧化活性有顯著影響[29]。此外，F(xiàn)RAP值與SeCys2呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），但與無機(jī)硒呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。由圖1可知，乳酸菌發(fā)酵能顯著促進(jìn)脫脂富硒米糠無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為SeCys2。SeCys2是谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的中心活性成分，GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種自由基捕獲酶，具有清除自由基及其衍生物、減少脂質(zhì)過氧化物形成、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷的能力。這可能是因?yàn)槿樗峋鷮⒏晃卓分械臒o機(jī)硒為自身代謝所用從而促進(jìn)GSH-Px的產(chǎn)生[30]，進(jìn)而提高了總抗氧化能力。

表4 乳酸菌發(fā)酵富硒米糠理化指標(biāo)與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation between physicochemical indexes and antioxidant activity in selenium-rich rice bran fermented by lactic acid bacteria

2.6.2 主成分分析

應(yīng)用主成分分析法對(duì)上述指標(biāo)分析，以進(jìn)一步探究乳酸菌發(fā)酵富硒米糠理化指標(biāo)與抗氧化活性的相關(guān)性，得到主成分相關(guān)矩陣的特征值、貢獻(xiàn)率（表5）及載荷矩陣（表6）。3 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為98.224%（＞80%），綜合了大多數(shù)樣本信息（表5）。

表5 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表6 主成分分析載荷圖Table 6 Principal component analysis loading matrix

主成分1的特征值為9.474，方差貢獻(xiàn)率為67.673%（表5），是最主要的成分，主要綜合了總酸、SeCys2、總酚、總黃酮含量和DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP值（表6）；主成分2的特征值為2.404，方差貢獻(xiàn)率為17.174%（表5），主要綜合了SeMeCys和SeMet含量（表6）；主成分3的特征值為1.873，方差貢獻(xiàn)率為13.377%（表5），主要綜合了IDF質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表6）。

由上述結(jié)果可知，用3 個(gè)主成分代替上述14 個(gè)指標(biāo)，基于抗氧化活性和相關(guān)理化指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)和優(yōu)選。3 個(gè)主成分分別定義為Y1、Y2、Y3，根據(jù)特征值及各成分的主成分載荷，得到各主成分的線性表達(dá)式，分別如式（7）～（9）所示：

式中：Z1～Z11分別表示pH值、總酸、還原糖、SDF、IDF、SeMeCys、SeMet、SeCys2、無機(jī)硒、總酚、總黃酮、DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP值。將各主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，得到綜合評(píng)分計(jì)算式（10）：

主成分樣品綜合得分如表7所示。結(jié)合乳酸菌發(fā)酵富硒米糠營養(yǎng)成分含量和抗氧化活性的Y1，排名前三的依次為Lp-ERB＞St-ERB＞Lb-ERB，表明Lp發(fā)酵脫脂富硒米糠提升總酸、SeCys2、總酚、總黃酮含量和DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和FRAP值最高。La-ERB在Y2上得分最高，表明La發(fā)酵脫脂富硒米糠促進(jìn)無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為SeMeCys和SeMet的能力最強(qiáng)。Lb-ERB在Y3上得分最高，表明Lb發(fā)酵脫脂富硒米糠促進(jìn)IDF轉(zhuǎn)化為SDF的能力最弱。綜上，乳酸菌發(fā)酵提升富硒米糠抗氧化活性能力的綜合排序?yàn)長p-ERB＞Lb-ERB＞St-ERB＞La-ERB。

表7 主成分樣品綜合得分及排名Table 7 Comprehensive scores and ranking of principal components

3 結(jié)論

本研究分析了4 種乳酸菌發(fā)酵后米糠理化指標(biāo)、營養(yǎng)特性、微觀結(jié)構(gòu)、物化特性及抗氧化活性的變化。結(jié)果表明，4 種乳酸菌均可利用米糠進(jìn)行生長，還原糖含量顯著降低，總酸質(zhì)量濃度增加，其中Lp產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；St發(fā)酵促進(jìn)IDF轉(zhuǎn)化為SDF能力最強(qiáng)；La、Lp和Lb發(fā)酵顯著促進(jìn)無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為SeCys2。乳酸菌發(fā)酵能使米糠變得疏松多孔，有利于總酚、總黃酮的提取，增加體外抗氧化活性。對(duì)乳酸菌發(fā)酵后米糠pH值、總酸、還原糖、SDF、IDF、SeMeCys、SeMet、SeCys2、無機(jī)硒、總酚、總黃酮、DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力、FRAP值等14 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，綜合評(píng)價(jià)顯示，4 種乳酸菌的排序?yàn)長p＞Lb＞St＞La。Lp體外抗氧化活性相對(duì)最強(qiáng)，總酸、SeCys2、總酚和總黃酮含量相對(duì)最高。本研究結(jié)果為富硒米糠的精深加工與開發(fā)提供了理論參考。