靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌代謝功能低聚糖及對食源致病菌的拮抗作用

鄒開翔，劉 樂，李新瑞，朱 可，魏 華,，張志鴻,,3,

（1.南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學重慶研究院，重慶 402660）

抗生素等藥物一直被認為是治療細菌感染的最佳藥物，而細菌耐藥性是目前全球衛(wèi)生和食品安全發(fā)展的最大威脅之一[1-2]，這主要是抗生素的長期使用導致微生物群的生態(tài)位空缺[3]，從而促使強耐藥性病原體在這種紊亂的腸道環(huán)境中定植，損傷宿主屏障，引起一系列風險[4]。每年耐藥細菌感染導致全球約70萬 人死亡，估計在2050年將導致1 000多萬人死亡[5]。益生菌因能抑制致病菌和調節(jié)腸道菌群結構，被認為是潛在“綠色抗生素”[6]。因此，選育具備特定抑菌活性的新型乳酸菌，對于預防和治療細菌感染具有重大意義[7]。

羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）是一類棲息在雞、豬、鳥和人類等脊椎動物腸道中的益生乳酸菌[8]，以生物膜的形式定植在宿主[9]，可通過釋放短鏈脂肪酸[10]和細菌素[11]等方式抑制病原體增殖，維持微生物動態(tài)平衡，從而保護腸上皮屏障[12]。靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌是指菌株進入靜止期，不再生長，但仍具有較強的代謝活性和生物轉化能力[13]，作為反應系統(tǒng)中的細胞工廠，相比生長期更容易且更穩(wěn)定地生產特定單一發(fā)酵產物，并實現最大產量[14]，如產廣譜抗菌物質Reuterin[15]。

甘油可作為羅伊氏乳桿菌靜息狀態(tài)下的外部氫受體，在輔酶VB12和甘油脫水酶的作用下胞內脫水成為3-羥丙醛[14]。厭氧條件下，3-羥丙醛可進一步通過輔酶NAD＋和氧化還原酶還原為1,3-丙二醇[16]。以3-羥基丙醛單體為轉化中心的復雜動態(tài)混合產物稱為Reuterin[17]。Reuterin可被應用于生物抑菌劑、抗感染治療劑等。Angiolillo等[18]的研究表明羅伊氏乳桿菌能夠在奶酪中產生Reuterin，抑制食源性病原體和腐敗細菌的污染，從而顯著延長奶酪的貨架期。前期研究表明，Reuterin的產量與羅伊氏乳桿菌的生長時期和生長碳源有密切關系[19-20]。

功能性低聚糖是一類不被胃腸道消化吸收但易被腸道乳酸菌利用的碳水化合物[21]。研究表明，一些功能低聚糖具有促進羅伊氏乳桿菌的生長代謝及抑制大腸桿菌的功能[20]。為此，本研究在評價雞源羅伊氏乳桿菌的生物學活性后，進一步探究功能低聚糖對靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌的代謝、黏附和拮抗食源致病菌的影響。將為開發(fā)具備優(yōu)良抑菌性能的羅伊氏乳桿菌及其在特定條件下的功能開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅伊氏乳桿菌HLRE01和HLRE13分離于當地農貿市場中健康母雞糞便，其與阪崎腸桿菌ATCC29544、大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞性李斯特菌CMCC54007和金黃色葡萄球菌CMCC26003等均保藏在食品科學與與資源挖掘全國重點實驗室。

MRS培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基、甘油 北京索萊寶生物科技有限公司；葡萄糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、棉子糖 上海源葉生物科技有限公司；抗生素藥敏紙片 溫州市康泰生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；H1650-W型臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Anaerobic IV型多功能厭氧培養(yǎng)箱美國GeneScience公司；PHS-3E pH計 上海偉業(yè)儀器廠；DYY-6C凝膠水平電泳儀 北京市六一儀器廠；電子天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 16S rDNA序列同源性分析

根據前期發(fā)表文獻[8]，采用選擇培養(yǎng)基LRIM從健康母雞糞便中篩選羅伊氏乳桿菌，并對篩選到的菌株進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），反應體系為DNA 1 μL、2×TaqPCR MasterMix 10 μL、ddH2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL，最終體積為20 μL。反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)，接著72 ℃終延伸10 min。其中DNA采用熱裂解法獲取，16S rRNA引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.2 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌的制備

取新鮮羅伊氏菌液以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基，反應器中注入充足的氮氣以維持厭氧環(huán)境，在37 ℃不控制pH值的情況下靜置培養(yǎng)24 h，在10 mL離心管中將靜息態(tài)細菌顆粒在4 ℃、6 000 r/min洗滌并重新懸浮在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中獲得靜息態(tài)菌體[22]。對制備獲得的靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌進行功能評價。

1.3.3 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌功能評價

1.3.3.1 耐酸耐膽鹽能力

將靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌菌體重懸于PBS中，然后以1%接種量接種于pH值為2.0和3.0的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)，計算0 h和3 h活菌數，測定其存活率；將靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌重懸菌體接種于含0.15%和0.30%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)，計算0 h和6 h的活菌數，測定其存活率。菌株存活率計算如式（1）所示：

式中：N1和N0分別為處理后和處理前的活菌數。

1.3.3.2 抗生素敏感性

采用紙片擴散法測定菌株的抗生素敏感性[23]。將靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌菌液均勻涂布在MRS固體平板上，接著將藥敏紙片輕輕貼附平板上，于37 ℃條件下厭氧孵育24 h，測量其直徑?？股孛舾行苑譃槟退帯⒅卸让舾泻兔舾?。

1.3.3.3 利用功能低聚糖代謝能力評價

參考前期文獻[24]，配制MRS基底培養(yǎng)基（每800 mL體積中含10.0 g胰蛋白胨、5.0 g牛肉膏、5.0 g酵母提取物、3.0 g氯化銨、4.0 g磷酸氫二鉀、2.6 g磷酸二氫鉀、0.102 g七水硫酸鎂、0.05 g四水硫酸錳、0.5 g半胱氨酸和1.0 g吐溫-80，調pH 6.2±0.1），分別添加低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、棉子糖和葡萄糖溶液至終質量分數為2%，獲得改良MRS培養(yǎng)基，其中葡萄糖作為對照。接種靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌菌液至改良培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h，監(jiān)測其生長和pH值變化。

1.3.3.4 表面疏水性

參考Hernandez等[25]方法并稍加改進，測定靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌在不同改良培養(yǎng)基中的疏水性。取分別添加低聚半乳糖、棉子糖和葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌體，重懸在PBS中并調整到108CFU/mL測吸光度（A0），然后在3 mL菌懸液中加入1 mL二甲苯，渦旋1 min，于37 ℃孵育30 min。在600 nm波長處測定水相的吸光度（A1）。疏水性計算如式（2）所示：

式中：A0和A1分別為處理前后水相的吸光度。

1.3.3.5 細胞上黏附性能

取2 mL Caco-2細胞懸液于6 孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)18 h至形成單細胞層，棄細胞培養(yǎng)液，再用2 mL Hanks緩沖液洗滌細胞2 次，接著每孔加入2 mL含108CFU/mL靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌的不含雙抗DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h。清洗掉未黏附的細菌，接著在細胞培養(yǎng)孔中添加400 μL消化液，5 min后再添加600 μL不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，充分吹打至細胞完全脫落。按式（3）計算細胞懸液中活菌數：

1.3.3.6 產廣譜抗菌Reuterin的能力與定量

取分別添加棉子糖和葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的108CFU/mL靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌，重懸于250 mmol/L甘油中，在37 ℃條件下厭氧孵育2 h，12 000 r/min離心5 min，收集上清液，經0.22 μm濾膜過濾得到Reuterin溶液[20]。取100 μL上述濾液，加入75 μL 0.01 mol/L的色氨酸溶液（溶于0.05 mol/L鹽酸中）和300 μL濃鹽酸，在37 ℃孵育30 min后，于560 nm波長處測定紫色絡合物的OD值，蒸餾水相對濾液為陰性對照。利用不同質量濃度（0、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL）的丙烯醛溶液進行上述反應，以質量濃度為橫坐標、OD560nm為縱坐標繪制標準曲線，用于對Reuterin的定量分析。

1.3.3.7 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵棉子糖后的抑菌能力

采用Gharbi等[26]的牛津杯法測定具優(yōu)良益生菌潛力菌株的抑菌能力。將指示菌株（阪崎腸桿菌ATCC29544、大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞性李斯特菌CMCC54007和金黃色葡萄球菌CMCC26003）接種至LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，接著蘸取菌液均勻劃線于LB固體平板上。在含有50 mmol/L甘油和2%棉子糖的改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌，取200 μL培養(yǎng)至靜息態(tài)的羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液于牛津杯中，無甘油組為對照。37 ℃培養(yǎng)12 h后，測量抑菌圈直徑。

1.3.3.8 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌抑制金黃色葡萄球菌的黏附

依照Singh等[27]報道，采用競爭、排斥和置換實驗在Caco-2細胞上評估羅伊氏乳桿菌抑制金黃色葡萄球菌黏附的能力。首先，采用含棉子糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)并獲得108CFU/mL的靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌，采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并獲得108CFU/mL金黃色葡萄球菌并清洗2 遍。在競爭實驗中，用含250 mmol/L甘油的DMEM重懸羅伊氏乳桿菌和金黃色葡萄球菌，取2 mL加至6 孔板中共孵育2 h；在排斥實驗中，加入2 mL含250 mmol/L甘油的羅伊氏乳桿菌懸液，與單層細胞孵育1 h，再用Hanks緩沖液洗滌3 次；然后加入2 mL金黃色葡萄球菌懸液，再孵育1 h。在置換實驗中，細菌孵育順序和排斥模式相反。無甘油組作為對照，待細胞培養(yǎng)結束并消化后，將混合液轉移至離心管中，進行平板計數，測定黏附抑制率。

1.3.3.9 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌在發(fā)酵牛奶中抑制金黃色葡萄球菌的能力

以脫脂奶粉為原料，配制10%的脫脂乳并進行滅菌。采用含棉子糖的改良培養(yǎng)基培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌，接種靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌至無菌脫脂乳中，終濃度為107～108CFU/mL；再接種金黃色葡萄球于無菌脫脂乳中，終濃度為102～103CFU/mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。其中，脫脂乳中甘油濃度為250 mmol/L，單一接種菌株作為對照。在不同孵育時間動態(tài)監(jiān)測pH值和菌株生長情況。

1.4 統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 16S rDNA序列同源性分析

將測序所得序列與NCBI數據庫中已知羅伊氏乳桿菌進行比對，根據相似性初步鑒定出兩株羅伊氏乳桿菌。進一步對該菌株進行序列同源性分析，并構建其16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖1所示，兩株編號為HLRE01和HLRE13的菌株分別與羅伊氏乳桿菌序列同源性達99%和100%，判定該菌株為羅伊氏乳桿菌。

圖1 基于16S rDNA基因序列構建羅伊氏乳桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of L.reuteri based on 16S rDNA gene sequences

2.2 耐酸耐膽鹽能力

菌株具有耐酸耐膽鹽能力是其通過胃腸道環(huán)境并發(fā)揮益生功能的重要前提。如圖2A所示，2 株靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌在pH 3.0條件下培養(yǎng)3 h后，存活率可超過95%；當pH值降為2.0時，存活率均顯著下降（P＜0.001），但仍可達80%以上，說明其耐酸能力較好，且該結果與朱振軍等[28]篩選的大部分羅伊氏乳桿菌耐受性結果一致。另外，膽鹽質量分數由0.15%變?yōu)?.30%時，HLRE01和HLRE13孵育6 h的存活率分別由98.67%和84.78%變?yōu)?0.54%和65.10%（P＜0.001），耐受性較好，且HLRE01優(yōu)于HLRE13與崔鵬月等[29]報道的羅伊氏乳桿菌WX-94耐受能力。綜上說明HLRE01和HLRE13均具有良好的耐受胃腸道環(huán)境的潛力。

圖2 羅伊氏乳桿菌對酸（A）和膽鹽（B）環(huán)境的耐受性Fig.2 Resistance of L.reuteri to acids (A) and bile salts (B)

2.3 抗生素敏感性

抗生素敏感性是菌株安全性評價的一項重要指標。本研究發(fā)現兩株羅伊氏乳桿菌對不同抗生素的敏感性均存在差異（表1），其中HLRE01對大部分抗生素敏感，對紅霉素、萬古霉素、克林霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星表現為抗性，HLRE13同樣對大部分抗生素敏感，只對萬古霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星具有抗性。說明該菌株具有良好的安全性，這些結果與李一娟等[8]關于羅伊氏乳桿菌的抗生素敏感性研究具有類似效果。

2.4 功能低聚糖對羅伊氏乳桿菌生長代謝的影響

乳酸菌在腸道中能利用不同功能性低聚糖，其代謝水平可能影響著菌株在宿主體內的益生性能[30-31]。由圖3A可知，HLRE01利用幾種低聚糖代謝的特征明顯不同，棉子糖、低聚半乳糖及低聚異麥芽糖能促進其生長，且棉子糖作用最強，但依然弱于單糖葡萄糖，而低聚木糖幾乎無促進生長作用。HLRE13具有類似的代謝特征，但其利用低聚異麥芽糖的能力優(yōu)于HLRE01（圖3B）。由圖3C可知，發(fā)酵時間達24 h，棉子糖是最有效促進羅伊氏乳桿菌生長代謝的低聚糖，其次是低聚半乳糖，而低聚木糖幾乎無促進作用，這可能是因為菌株不含分解低聚木糖的相關酶，圖3D也證實了該結論，棉子糖組發(fā)酵液最終的pH值最低，而低聚木糖組發(fā)酵液最終的pH值最高，這可能是因為菌株代謝越強，發(fā)酵液中積累有機酸越多而導致。

圖3 不同功能低聚糖對羅伊氏乳桿菌代謝的影響Fig.3 Effect of different functional oligosaccharides on the metabolism of L.reuteri

2.5 功能低聚糖代謝改善羅伊氏乳桿菌的黏附能力

乳酸菌利用不同碳水化合物代謝，菌株表面疏水性會存在差異，進而影響菌株在細胞上的黏附能力[25]。如圖4A所示，HLRE01和HLRE13利用低聚糖代謝后，表面疏水性均顯著高于對照葡萄糖組（P＜0.01，P＜0.000 1），且HLRE13利用低聚半乳糖和棉子糖代謝后疏水性提高更加明顯，相比葡萄糖組分別提高了15.15%和18.62%。從圖4B可知，菌株利用功能低聚糖發(fā)酵后在Caco-2細胞上黏附能力也提高，其中HLRE01利用低聚半乳糖和棉子糖發(fā)酵后的黏附率分別為4.65%和8.36%，后者顯著高于葡萄糖組（P＜0.05），而HLRE13利用低聚糖發(fā)酵后的黏附率升高更明顯，其中利用棉子糖發(fā)酵后的黏附率可達26.86%，顯著高于葡萄糖組的7.53%（P＜0.000 1）。綜上結果，表明棉子糖是提高羅伊氏乳桿菌表面疏水性和黏附能力的最佳功能低聚糖，尤其是針對HLRE13菌株；另外，菌株的黏附性能與表面疏水性存在正相關，證實了前期報道的疏水性是反映益生菌高黏附特性重要指標的結論[32]。下一步，選擇棉子糖和HLRE13為后續(xù)實驗的發(fā)酵碳源和菌株。

圖4 功能低聚糖對羅伊氏乳桿菌疏水性（A）和黏附率（B）的影響Fig.4 Effect of functional oligosaccharides on the hydrophobicity (A) and adhesion rate (B) of L.reuteri

2.6 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌產Reuterin的能力及抑菌活性

利用甘油發(fā)酵產廣譜抗菌的Reuterin是含pdu基因簇羅伊氏乳桿菌特有的特征[8]，具有良好黏附腸上皮細胞能力的HLRE13是否產Reuterin并抑致致病菌值得進一步探究。依據丙烯醛標準曲線（Y=0.831 8X＋0.044 98，R2=0.998；Y為OD560nm，X為丙烯醛質量濃度（g/L）），可知HLRE13能利用甘油發(fā)酵產Reuterin，且利用棉子糖發(fā)酵獲得的靜息態(tài)細胞所產Reuterin（（1.34±0.03）g/L）高于葡萄糖組（（0.23±0.01）g/L）（圖5A），說明其攜帶相關基因簇。另外，比較發(fā)酵液中含甘油和不含甘油組發(fā)酵上清對致病菌的抑制，發(fā)現添加甘油的抑菌活力高于不含甘油的組，如單核細胞性李斯特菌抑菌圈由（18.18±0.57）mm提高到（19.35±0.13）mm，而阪崎腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈顯著提高（P＜0.001；圖5B），這一結果同樣說明了Reuterin的產生，也證實了前期的實驗結果[8]。

2.7 靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌抑制金黃色葡萄球菌的黏附

上述研究發(fā)現，金黃色葡萄球菌對HLRE13所產Reuterin最敏感，其在細胞上的黏附是否也被抑制有待進一步研究。由圖6可知，靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌HLRE13能通過競爭、排斥和替換方式抑制金黃色葡萄球菌在Caco-2細胞上的黏附，且排斥方式的黏附抑制率最低，只有9.87%。然而，當培養(yǎng)液中添加甘油后，3 種方式的抑制率均得到提高，且排斥方式的抑制率提高最多，達41.67%。不同的競爭模型可以模擬乳酸菌和病原體在上皮細胞上競爭的機制，其中競爭抑制主要是競爭營養(yǎng)和定植生態(tài)位點的抑制方式，排斥抑制主要是不允許后續(xù)菌株黏附定植的方式，而替代抑制主要是通過產抗菌、抗黏附物質而抑制的方式，本研究發(fā)現不同抑制方式的抑制率不同，可能和它們的作用機制存在差異有關[33]。

2.8 發(fā)酵乳中羅伊氏乳桿菌和金黃色葡萄球菌的相互作用

選取金黃色葡萄球菌容易污染的乳制品作為載體，進一步評價HLRE13在共發(fā)酵過程中對金黃色葡萄球菌的抑制。如圖7A所示，金黃色葡萄球菌在牛奶中單獨發(fā)酵時，生長良好，且在12 h達到穩(wěn)定期并維持在107～108CFU/mL；當金黃色葡萄球菌與HLRE13在牛奶中共發(fā)酵時，金黃色葡萄球菌的活菌數只能在18 h到達最大，約106CFU/mL，且在24 h降為103CFU/mL，說明其生長受到抑制；當共發(fā)酵模式中添加甘油后，金黃色葡萄球菌的生長受到明顯抑制，活菌數僅在6 h有微弱上升后便一直下降，這主要是Reuterin發(fā)揮了抑制作用，與前面結果一致。另外，HLRE13在單獨發(fā)酵和共發(fā)酵過程中，生長幾乎不受影響，均保持良好生長態(tài)勢，且添加甘油的共發(fā)酵組中活菌數顯著高于其他組（P＜0.000 1；圖7B），說明羅伊氏乳桿菌HLRE13能有效預防金黃色葡萄球菌在牛奶發(fā)酵過程中的污染，且不受金黃色葡萄球菌和Reuterin的影響，該結果與Ortiz-Rivera等[34]發(fā)現的羅伊氏乳桿菌產Reuterin可抑制病原菌的污染并延長發(fā)酵乳制品貨架期結果類似。

圖7 牛奶共發(fā)酵過程中活菌數變化Fig.7 Changes in viable counts of S.aureus and L.reuteri during co-culture in milk

3 結論

羅伊氏乳桿菌是一類廣泛存在于脊椎動物體內的乳酸菌，其能夠特異性的代謝產廣譜抗菌的Reuterin[20]。靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌因其特殊的代謝活性和生物轉化能力，可作為研究特定代謝產物合成的有效工具[35]。本研究從健康母雞新鮮糞便中定向篩選到2 株羅伊氏乳桿菌HLRE01和HLRE13，進一步制備靜息態(tài)菌體，并發(fā)現其能耐受酸和膽鹽等胃腸道環(huán)境；體外發(fā)酵實驗證實其能夠代謝不同功能低聚糖，且利用棉子糖發(fā)酵能顯著提高羅伊氏乳桿菌代謝能力、表面疏水性、黏附率、產Reuterin水平及抑制致病菌的能力；另外，甘油能促進靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌HLRE13以多種方式抑制金黃色葡萄球菌在細胞上的黏附，且在牛奶共發(fā)酵體系中促進菌株產Reuterin并拮抗金黃色葡萄球菌，而不影響自身的生長代謝。本研究解析的靜息態(tài)羅伊氏乳桿菌是能耐受胃腸道環(huán)境、黏附腸上皮細胞、產廣譜抗菌Reuterin并拮抗食源致病菌的菌株，將為豐富我國特色乳酸菌資源及羅伊氏乳桿菌在特定狀態(tài)下的功能研究奠定基礎。