原花青素對(duì)雄性小鼠生殖功能損傷作用及機(jī)制

趙瑩瑩, 陳莉莎, 閆 麗, 王愷悅, 于月新

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,遼寧 沈陽 110016

近年來,不孕不育癥的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì),全球8%～12%的育齡夫婦患有不孕不育癥[1],其中,與男性有關(guān)的不育癥約占所有不孕不育癥的50%[2]。導(dǎo)致男性不育的因素有很多,主要包括生殖系統(tǒng)損傷、內(nèi)分泌紊亂、環(huán)境污染、不良生活方式、藥物引發(fā)不良反應(yīng)等[3-4]?；钚匝跏且活惥哂懈叨然钚缘难踝杂苫目偡Q,包括超氧陰離子、過氧化氫、過氧自由基及羥基自由基等[5]。氧化應(yīng)激主要是由于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑清除活性氧的能力下降或細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生過多無法及時(shí)清除,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的抗氧化/氧化平衡失調(diào),細(xì)胞內(nèi)的自由基濃度增加,進(jìn)而干擾細(xì)胞正常代謝過程[6]。有研究報(bào)道,氧化應(yīng)激損傷是精子細(xì)胞功能障礙的主要原因,也是通過損傷精子結(jié)構(gòu)和功能完整性而導(dǎo)致男性不育的主要病因,目前,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)精子功能下降的確切機(jī)制尚不清楚,但主要?dú)w因于軸突的過氧化損傷和細(xì)胞內(nèi)ATP水平的消耗,其次是由于脂膜過氧化及細(xì)胞核、線粒體的DNA斷裂而產(chǎn)生過量的4-羥基壬烯醛和丙二醛[7-8]。雷公藤多苷片被長(zhǎng)期廣泛用于治療炎癥和免疫疾病,其主要藥理有效成分為雷公藤甲素,具有生殖毒性。過量攝入雷公藤甲素會(huì)干擾睪丸能量代謝和正常生殖功能,導(dǎo)致精子質(zhì)量下降,睪丸萎縮,從而導(dǎo)致男性生殖功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素作為化學(xué)制劑對(duì)男性生殖損傷具有較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,而相較于物理方法和手術(shù)手段對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行造模損傷,化學(xué)方法應(yīng)用于生殖障礙動(dòng)物模型具有簡(jiǎn)便和成本低的優(yōu)點(diǎn)[9]。因此,本研究選擇了雷公藤甲素作為雄性不育動(dòng)物模型的模型藥物。既往研究發(fā)現(xiàn),原花青素可激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)-Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(recombinant Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)信號(hào)通路,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。本研究旨在探討原花青素對(duì)雄性小鼠生殖功能損傷的作用及其相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康C57/BL6J小鼠24只,體質(zhì)量18～22 g,購自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司。小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室,溫度維持在(22℃±3℃),濕度維持在45%～65%,自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將小鼠隨機(jī)分入3組,每組各8只。對(duì)照組:小鼠灌胃或腹腔注射0.9%生理鹽水。模型組:小鼠經(jīng)0.9%生理鹽水灌胃1 h后腹腔注射雷公藤甲素120 μg/kg。干預(yù)組:原花青素250 mg/kg灌胃處理1 h后腹腔注射雷公藤甲素120 μg/kg。連續(xù)處理28 d,每3 d給小鼠稱體質(zhì)量以調(diào)整灌胃和腹腔注射劑量。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 樣品采集 小鼠處死前禁食不禁水12 h,以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,分別取血和睪丸,將左右兩邊睪丸分別稱質(zhì)量,測(cè)定睪丸臟器指數(shù);同時(shí),收集小鼠右側(cè)附睪進(jìn)行精子分析。收集小鼠血清和右側(cè)睪丸,放置于-80℃冰箱保存待用。

1.3 小鼠附睪精子參數(shù)測(cè)定 將整個(gè)右側(cè)附睪置于1 ml 37℃預(yù)熱生理鹽水中,迅速將附睪尾剪碎,放置于37℃水浴鍋中10 min,使精子從附睪小管中游出。(1)精子數(shù)量的測(cè)定:將精子懸液滴入血球計(jì)數(shù)板上,蓋上蓋玻片,將其置于顯微鏡下觀察,按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)鏡下的精子進(jìn)行計(jì)數(shù),測(cè)定小鼠的精子數(shù)量。(2)精子活力的測(cè)定:將滴有精子懸液的血球計(jì)數(shù)板于顯微鏡下觀察,每次隨機(jī)記錄100個(gè)精子中具有活動(dòng)力的精子數(shù)量。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) 對(duì)小鼠血清的生殖激素水平和氧化應(yīng)激水平進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的生殖激素主要包括睪酮、雌二醇、卵泡刺激素、黃體生成素,氧化應(yīng)激指標(biāo)包括丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶。檢測(cè)均通過小鼠酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒進(jìn)行,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行具體操作。

1.5 Western-blot檢測(cè) 分別進(jìn)行睪丸組織中Nrf2-Keap1蛋白的提取和總蛋白測(cè)定后,將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次,加入相對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,采用ECL Western印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠精子參數(shù)比較 模型組小鼠精子數(shù)量和活力低于對(duì)照組,干預(yù)組小鼠精子數(shù)量和活力高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組小鼠精子參數(shù)比較

2.2 3組小鼠體質(zhì)量及睪丸臟器指數(shù)比較 3組小鼠體質(zhì)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組小鼠睪丸臟器指數(shù)低于對(duì)照組,干預(yù)組小鼠睪丸臟器指數(shù)高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組小鼠體質(zhì)量和睪丸臟器指數(shù)比較

2.3 3組小鼠血清生殖激素水平比較 模型組小鼠血清睪酮和雌二醇水平高于對(duì)照組,卵泡刺激素和黃體生成素水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);干預(yù)組小鼠血清睪酮和雌二醇水平低于模型組,卵泡刺激素和黃體生成素水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組小鼠血清生殖激素水平比較

2.4 3組小鼠氧化應(yīng)激水平比較 模型組小鼠丙二醛水平高于對(duì)照組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);干預(yù)組小鼠丙二醛水平低于模型組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠氧化應(yīng)激水平比較

2.5 3組小鼠睪丸組織中Nrf2-Keap1蛋白表達(dá)水平比較 模型組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,干預(yù)組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達(dá)水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組小鼠睪丸組織中Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究通過對(duì)小鼠腹腔注射雷公藤甲素成功建立了雄性小鼠生殖功能損傷模型,在該損傷模型中觀察到小鼠精子質(zhì)量明顯惡化,睪丸臟器指數(shù)降低,血清生殖激素水平紊亂,睪丸組織內(nèi)觸發(fā)了氧化應(yīng)激改變,與既往研究[11-12]結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示:模型組小鼠精子數(shù)量和活力低于對(duì)照組,干預(yù)組小鼠精子數(shù)量和活力高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組小鼠睪丸臟器指數(shù)低于對(duì)照組,干預(yù)組小鼠睪丸臟器指數(shù)高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組小鼠血清睪酮和雌二醇水平高于對(duì)照組,卵泡刺激素和黃體生成素水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),干預(yù)組小鼠血清睪酮和雌二醇水平低于模型組,卵泡刺激素和黃體生成素水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組小鼠丙二醛水平高于對(duì)照組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),干預(yù)組小鼠丙二醛水平低于模型組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,干預(yù)組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達(dá)水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即原花青素可改善雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠精子參數(shù)、睪丸臟器指數(shù)、生殖激素及氧化應(yīng)激水平,其保護(hù)作用機(jī)制可能是通過Nrf2-Keap1通路抑制睪丸組織氧化應(yīng)激。

氧化應(yīng)激會(huì)通過誘導(dǎo)質(zhì)膜過氧化損傷而引發(fā)生精功能障礙[13]。因精子富含多不飽和脂肪酸,與其他細(xì)胞相比,對(duì)氧化損傷更為敏感[14]?；钚匝醯漠a(chǎn)生也會(huì)降低睪丸組織中精原細(xì)胞的數(shù)量,不利于精子產(chǎn)生[15]。原花青素干預(yù)處理有效降低了雷公藤甲素誘導(dǎo)的精子質(zhì)量惡化,這可能與睪丸微環(huán)境氧化應(yīng)激的改善有關(guān),表現(xiàn)為丙二醛水平降低、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性升高。Nrf2是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在肝、脾、腎等器官中高度表達(dá)并在抗氧化體系中發(fā)揮著重要作用的蛋白[16]。原花青素可誘導(dǎo)Keap1半胱氨酸殘基的共價(jià)修飾使其構(gòu)象改變,緊密結(jié)合的Nrf2-Keap1二聚體解偶聯(lián),從而抑制Nrf2泛素化,促進(jìn)其磷酸化,使游離的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核[17]。Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核后,與Maf蛋白或Jun蛋白、Fos蛋白結(jié)合形成異二聚體,隨后與ARE基因識(shí)別并結(jié)合,激活下游抗氧化酶,如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等[18]。本研究中,模型組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,干預(yù)組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達(dá)水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即雷公藤甲素會(huì)降低Nrf2和Keap1的表達(dá)水平,而原花青素預(yù)處理可通過激活Nrf2-Keap1進(jìn)一步增加抗氧化酶的表達(dá)。這提示,原花青素對(duì)睪丸損傷的保護(hù)作用可能與Nrf2表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

綜上所述,原花青素能夠改善雄性小鼠生殖功能損傷,其機(jī)制與調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1抗氧化系統(tǒng)有關(guān)。