黃穎, 黃楠, 宋菊, 季沈杰, 王欽君
啟東市人民醫(yī)院 啟東肝癌防治研究所 南通大學(xué)附屬啟東醫(yī)院檢驗科,江蘇啟東 226200
原發(fā)性肝癌是來源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,以原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最為常見,死亡率位居第三位[1],5年生存率僅為10%[2],因此HCC的早期診斷尤為重要。目前臨床上常用篩查指標(biāo)是甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP),其靈敏度和特異度均不高,在某些良性肝臟疾病如肝硬化(liver cirrhosis,LC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)中亦可出現(xiàn)AFP不同程度升高[3-4]。因此,需要尋找靈敏度、特異度更高的新肝癌標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-7],可通過調(diào)控多個通路的關(guān)鍵基因表達影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,從而促進肝癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移[8]。有研究發(fā)現(xiàn),SOX9-AS1在肝癌組織中高表達,且與HCC患者預(yù)后不良密切相關(guān)[9],但目前尚未有研究探索血清SOX9-AS1在肝癌患者中的診斷價值,本研究對此進行了探討,評價其作為肝癌診斷標(biāo)志物的臨床價值。
收集本院2019年12月—2022年1月就診肝病患者180例,其中HCC組70例,男性49例,女性21例;LC組55例,男性24例,女性31例;CHB組55例,男性31例,女性24例。HCC、LC患者經(jīng)實驗室、影像學(xué)及病理學(xué)檢查明確診斷,CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg陽性>6個月且排除肝癌、肝硬化、其他器官腫瘤等重大疾病。健康對照組(healthy controls,HC)為同期體檢健康者50例,男性35例,女性15例。所有受試者均簽署知情同意書,本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(ER-XJS-LWTG-2020018)。收集各組一般資料和實驗室常規(guī)檢測項目,包括總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)和AFP。
利用血清總RNA提取試劑盒(北京BioTeke公司)提取血清總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Theromo)說明書配置反應(yīng)體系,選擇CFX96 Deep Well基因擴增儀做反轉(zhuǎn)錄(美國Bio-Rad),反應(yīng)條件:42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。cDNA產(chǎn)物于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物序列SOX9-AS1正向:5′-ACGTCAGCGAGCTTGAGAAA-3′,反向:5′-GACATACGTCGGGAGCTCAG-3′;內(nèi)參GAPDH正向:5′-GACATACGTCGGGAGCTCAG-3′,反向:5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′(上海生工)。PCR反應(yīng)體系:SYBR GreenⅠmix 10 μL、cDNA 3 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、RNase-free water 5 μL,共20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,1個循環(huán);95 ℃ 15 s、、56 ℃30 s、72 ℃30 s,共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算靶基因SOX9-AS1相對表達水平,計算公式ΔΔCt=實驗組(CtSOX9-AS1-CtGAPDH)-對照組(CtSOX9-AS1-CtGAPDH)。
由于目前市場上沒有SOX9-AS1標(biāo)準(zhǔn)品售賣,因此以50名健康體檢者混合血清為標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測。將混合血清以1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)E=10-1/slope-1計算擴增效率,評價檢測方法的線性。將混合血清同一批次進行10次平行孔檢測SOX9-AS1水平,計算批內(nèi)變異系數(shù);將混合血清分成10等份,每天提取1份檢測,計算批間變異系數(shù),以此評價檢測方法的精密度。將混合血清在室溫下放置0、6、12、18、24 h以及反復(fù)凍融0、2、4、6、8次后提取并檢測,以此評價血清SOX9-AS1穩(wěn)定性。采用建立的qRT-PCR法雙復(fù)孔檢測所有血清樣本。
采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例(%)表示,計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))表示,采用Kruskal-Wallis檢驗。采用ROC評價SOX9-AS1、AFP對HCC的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
HCC組、LC組、CHB組和HC組之間比較,年齡、TBIL、ALB、GPT、GOT的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;表1)。HCC組、LC組、CHB組及HC組血清AFP水平依次降低,HCC組AFP水平最高(P<0.05;表1)。
表1 各組一般資料和實驗室指標(biāo)的比較
SOX9-AS1標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.441X+26.27,R2=0.9978,擴增效率為0.952 5(圖1)。SOX9-AS1批內(nèi)變異系數(shù)為2.82%,SOX9-AS1批間變異系數(shù)為1.19%?;旌涎逶谑覝叵路胖?、6、12、18、24 h以及反復(fù)凍融0、2、4、6、8次后檢測SOX9-AS1表達水平均無明顯差異(P>0.05,圖1),提示SOX9-AS1穩(wěn)定性良好。
HCC組、LC組、CHB組及HC組血清SOX9-AS1依次降低,HCC組SOX9-AS1水平最高(P<0.05;圖2)。
圖2 各組血清SOX9-AS1的比較
SOX9-AS1聯(lián)合AFP對HCC的診斷效能最高(P<0.05;表2和圖3)。
圖3 血清SOX9-AS1、AFP單獨或聯(lián)合診斷的ROC曲線
表2 血清SOX9-AS1、AFP對HCC的診斷效能
研究證明,lncRNA可作為腫瘤輔助診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物[5-9]。Han等[10]發(fā)現(xiàn),SCARNA10在HCC患者血清中的表達水平明顯高于LC和CHB患者,其診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)的AFP。LncRNA CRNDE在HCC患者血清中高表達,其表達水平與腫瘤大小、分化程度和TNM分期有關(guān),lncRNA CRNDE高表達患者的總體生存率和無病生存率明顯低于低表達患者,Cox回歸分析提示lncRNA CRNDE可作為HCC的獨立預(yù)后因素[11]。除此之外,HULC、MALAT1、UCA1等循環(huán)腫瘤lncRNA也被證實對HCC的輔助診斷有一定的價值[12-14]。
SOX9-AS1是lncRNA SOX9的反義鏈,在HCC腫瘤組織和細(xì)胞中高表達,與miR-5590-3p和SOX9形成SOX9-AS1/miR-5590-3p/SOX9正反饋回路,調(diào)控Wnt/β-catenin通路,促進HCC生長和轉(zhuǎn)移[9]。為了探討SOX9-AS1對HCC的診斷價值,本研究采用qRT-PCR檢測血清SOX9-AS1,繪制SOX9-AS1標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸系數(shù)R2為0.997 8,說明方法線性良好;計算SOX9-AS1擴增效率為0.952 5,符合qPCR進行定量分析的擴增效率范圍要求;批內(nèi)變異系數(shù)為2.82%,批間變異系數(shù)為1.19%,符合臨床檢驗定量檢測項目精密度要求;混合血清在室溫放置一定時間或反復(fù)凍融后檢測結(jié)果無明顯變化,說明血清穩(wěn)定性良好。
本研究發(fā)現(xiàn),HCC組、LC組、CHB組及HC組血清SOX9-AS1依次降低,提示SOX9-AS1不僅能區(qū)分HCC患者與健康對照者,還能有效區(qū)分LC患者與CHB患者。目前臨床上用來診斷HCC的血清學(xué)標(biāo)志物AFP特異性不高,在本研究中納入的55例LC患者和55例CHB患者血清中也能觀察到AFP不同程度升高。ROC曲線分析顯示,SOX9-AS1對HCC具有一定的診斷價值,將SOX9-AS1與AFP聯(lián)合檢測,診斷效能優(yōu)于兩者單項檢測。
綜上所述,SOX9-AS1升高可用于區(qū)分肝癌患者與健康對照者,可用于監(jiān)測肝臟疾病的進展。SOX9-AS1與AFP聯(lián)合檢測能有效提高診斷效能,血清SOX9-AS1有望成為新的肝癌診斷標(biāo)志物。但本研究缺乏隨訪數(shù)據(jù),無法進行生存分析,SOX9-AS1與肝癌預(yù)后的關(guān)系仍需進一步探索。