DLBCL患者血Th22細(xì)胞、IL-22水平及IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞株增殖和侵襲的影響

張靈, 范凌, 郝杰, 張陽(yáng), 靳艷麗, 高炳華

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科,河北張家口 075000

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一種來(lái)源于成熟B細(xì)胞的侵襲性腫瘤,是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤,約占全部非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。DLBCL臨床異質(zhì)性大,發(fā)病機(jī)制和發(fā)展較復(fù)雜,具體機(jī)制尚不清楚,探究DLBCL的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。大量研究表明免疫細(xì)胞在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。輔助性T細(xì)胞22(helper T cell 22,Th22)是最新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞亞群,由幼稚的CD4+T細(xì)胞在白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞協(xié)同下分化而來(lái),其主要分泌IL-22和TNF-α等細(xì)胞因子[3]。其中,IL-22是Th22細(xì)胞亞群的主要效應(yīng)細(xì)胞因子。Th22細(xì)胞已被揭示在先天免疫性疾病、感染性疾病、慢性炎癥性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用[4],Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22與血液病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而關(guān)于Th22細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在DLBCL中作用的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此,本文分析DLBCL患者血Th22細(xì)胞、IL-22水平及IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞株增殖和侵襲的影響,為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2022年1月—2022年12月收治的40例DLBCL患者(DLBCL組),男性22例,女性18例,年齡33～75歲;按照臨床分期分為不同亞組,Ⅰ期7例,Ⅱ期12例,Ⅲ期13例,Ⅳ期8例。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥診斷與治療中國(guó)指南(2022年版)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn);②患者及家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①由其他淋巴瘤轉(zhuǎn)化而來(lái)的、原發(fā)縱隔的、原發(fā)中樞的、原發(fā)皮膚的DLBCL,有其他惡性腫瘤史;②心腦血管、肝、腎、自身免疫性疾病及造血系統(tǒng)其他嚴(yán)重原發(fā)性疾病;③幽門(mén)螺桿菌、巨細(xì)胞病毒、乙肝病毒感染。同期選取40例體檢健康成年人為對(duì)照組。兩組性別、年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;CD4-PerCP、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗體由eBioScience公司提供;酶聯(lián)免疫試劑盒由英國(guó)Abcam公司提供;人DLBCL細(xì)胞株SU-DHL-4和TOLEDO購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京細(xì)胞庫(kù);胎牛血清由美國(guó)Gibco公司提供;RPMI-1640培養(yǎng)基由瑞士Lonza公司提供。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱由上海力康公司提供;流式細(xì)胞儀由美國(guó)貝爾曼庫(kù)爾特公司提供;酶標(biāo)儀由美國(guó)Thermo公司提供。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞亞群

DLBCL組新診、化療前后,以及復(fù)發(fā)者于來(lái)院第2日清晨空腹取外周血;對(duì)照組于體檢當(dāng)日取外周血。每管加入等體積PBS稀釋,稀釋后的血液加入到人淋巴細(xì)胞分離液中,采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞,PBS沖洗并沖懸,加入CD4-PerCP、IFN-γ-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗體染色,4 ℃避光孵育30 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+(Th22)細(xì)胞占CD4+IFN-γ-T細(xì)胞的比例。

1.4 ELISA法檢測(cè)IL-22水平

對(duì)照組于體檢當(dāng)日取外周血,DLBCL組于入院第2日清晨空腹取外周血,離心10 min取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-22蛋白水平。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將人DLBCL細(xì)胞株SU-DHL-4和TOLEDO置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng),取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將SU-DHL-4、TOLEDO細(xì)胞分別以1×105個(gè)/孔接種于96孔板,干預(yù)組每孔加入150 μL不同質(zhì)量濃度的IL-22(0、50、100、150、200 μg/L),對(duì)照組加入相同體積培養(yǎng)基。孵育48 h后每孔加入50 μL 0.25 g/L MTT,37 ℃孵育4 h后,加入200 μL DMSO,用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處讀取每孔光密度(optical density,OD)值。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

用基質(zhì)膠包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃風(fēng)干,使用前進(jìn)行基底膜水化。SU-DHL-4和TOLEDO細(xì)胞中加入200 μg/L IL-22培養(yǎng)48 h,對(duì)照組未經(jīng)IL-22處理。隨后將1×105個(gè)細(xì)胞加入上室,含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL加入下室,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察過(guò)膜細(xì)胞并將其用乙酸漂白染色,結(jié)晶紫洗脫,觀察細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血Th22細(xì)胞比例、IL-22水平的比較

與對(duì)照組比較,DLBCL組外周血Th22細(xì)胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;圖1和表1)。與臨床分期Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22細(xì)胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;表1)。

表1 各組Th22細(xì)胞比例及IL-22水平的比較

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th22細(xì)胞比例

2.2 化療前后、復(fù)發(fā)和新診DLBCL患者Th22細(xì)胞比例的比較

檢測(cè)10例DLBCL患者化療1～2個(gè)周期后外周血Th22細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn),化療后Th22細(xì)胞比例低于化療前(P<0.05;圖2A)。檢測(cè)9例復(fù)發(fā)DLBCL患者的Th22細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn),復(fù)發(fā)患者的Th22細(xì)胞比例高于新診患者和對(duì)照組(P<0.05;圖2B)。

圖2 化療前后、復(fù)發(fā)和新診DLBCL患者Th22細(xì)胞比例的比較a為P<0.05,與治療前或?qū)φ战M比較。

2.3 IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖的影響

IL-22作用48 h后,SU-DHL-4和TOLEDO細(xì)胞增殖OD隨IL-22質(zhì)量濃度的增加而增加(P<0.05;圖3),這說(shuō)明IL-22能促進(jìn)DLBCL細(xì)胞增殖。對(duì)OD值進(jìn)行線性分析(圖3虛線)發(fā)現(xiàn),TOLEDO細(xì)胞增長(zhǎng)變化斜率大于SU-DHL-4細(xì)胞,提示IL-22對(duì)TOLEDO細(xì)胞的促增殖作用可能大于SU-DHL-4細(xì)胞。

圖3 IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05,與同細(xì)胞0、50 μg/L比較;b為P<0.05,與同細(xì)胞100 μg/L比較。

2.4 IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,IL-22組SU-DHL-4和TOLEDO細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.05;表2),提示IL-22能夠促進(jìn)DLBCL細(xì)胞侵襲。

表2 IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞侵襲(細(xì)胞數(shù)目)的影響

3 討 論

DLBCL是一組在基因?qū)W、形態(tài)學(xué)、臨床特征、治療及預(yù)后上都具有非常大異質(zhì)性的侵襲性腫瘤[6]。DLBCL在中位年齡為70歲的老年患者中更為普遍,但也發(fā)生在年輕人中,很少發(fā)生在兒童中[7]。臨床上,大多數(shù)患者表現(xiàn)為一個(gè)快速增長(zhǎng)的腫塊,涉及一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)和結(jié)外部位[8]。目前,DLBCL的常規(guī)治療方案是利妥昔單抗聯(lián)合CHOP化療,但仍有部分患者出現(xiàn)難治和復(fù)發(fā)的情況[9]。因此,對(duì)DLBCL發(fā)病機(jī)制的研究是必要的,這將為DLBCL的治療提供理論基礎(chǔ)和臨床指導(dǎo)。

了解免疫系統(tǒng)如何影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展仍然是腫瘤學(xué)中最具挑戰(zhàn)性的問(wèn)題之一。Th22細(xì)胞被定義為CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+細(xì)胞,與已知的Th1和Th17細(xì)胞亞群比較,Th22細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立的Th細(xì)胞亞群[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),Th22細(xì)胞在腫瘤中起著重要作用,Th22細(xì)胞能夠激活肺癌JAK-STAT3/MAPK/AKT信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[12]。此外,Th22細(xì)胞也與胰腺癌、結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),與健康個(gè)體比較,DLBCL患者外周血Th22細(xì)胞比例顯著升高,說(shuō)明Th22細(xì)胞可能參與DLBCL的發(fā)生、發(fā)展。

在胃癌和宮頸癌中,Th22細(xì)胞比例增加與疾病的進(jìn)展相關(guān),并預(yù)示著較差的生存率[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),Th22細(xì)胞比例增加與DLBCL患者較差的化療效果相關(guān)。除此之外,本研究發(fā)現(xiàn),與Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22細(xì)胞比例和IL-22水平升高。綜上,外周血Th22細(xì)胞比例可作為DLBCL患者臨床療效及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。

為了研究IL-22對(duì)DLBCL細(xì)胞的作用,本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)了體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IL-22能夠促進(jìn)DLBCL細(xì)胞增殖和侵襲,這與文獻(xiàn)[17]研究結(jié)果一致,文獻(xiàn)[17]發(fā)現(xiàn),胰腺癌中IL-22通過(guò)活化STAT3通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此,IL-22在DLBCL中具有促瘤效應(yīng),而不具有抗腫瘤的免疫功能。此外,本研究發(fā)現(xiàn),TOLEDO細(xì)胞比SU-DHL-4細(xì)胞對(duì)IL-22更敏感,這說(shuō)明IL-22對(duì)非生發(fā)中心來(lái)源DLBCL的促瘤作用更強(qiáng)。阻斷IL-22可作為DLBCL患者的潛在治療靶點(diǎn)。

總之,DLBCL患者外周血Th22細(xì)胞比例及IL-22水平升高,Th22細(xì)胞比例與DLBCL患者臨床分期及對(duì)化療的反應(yīng)有關(guān);IL-22能夠促進(jìn)DLBCL細(xì)胞增殖和侵襲,提示Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22可能促進(jìn)DLBCL的發(fā)生發(fā)展,Th22細(xì)胞可作為DLBCL患者臨床療效及預(yù)后的預(yù)測(cè)因子,本研究為臨床DLBCL藥物研發(fā)、治療及預(yù)后提供新策略。