柴胡皂苷D對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制

王珍, 胡浩強(qiáng), 劉國(guó)輝

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院 東莞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科,廣東東莞 523000

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎衰竭的共同病理基礎(chǔ)[1],西醫(yī)藥物治療不良反應(yīng)較大,中醫(yī)治療腎纖維化取得了明顯治療效果[2]。柴胡有疏散膽經(jīng)邪氣、退熱功效,柴胡皂苷D(saikosaponin,SSD)可調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路改善大鼠肝纖維化[3],還能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬改善Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞纖維化改變[4],SSD對(duì)RIF的作用效果尚不明確。腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是RIF發(fā)生、進(jìn)展的病理變化之一,EMT形成使上皮細(xì)胞的黏附功能喪失,肌動(dòng)蛋白骨架改變,腎小管基底膜被破壞。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在EMT形成中占據(jù)重要作用,抑制該信號(hào)通路活化可能是腎臟纖維化治療的重要靶點(diǎn)[5]。故本研究基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路從體外細(xì)胞水平探討SSD對(duì)人腎小管EMT的作用。

1 材料和方法

1.1 材料、主要試劑和儀器

人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2(WN-C45998,武漢華爾納生物科技有限公司)。SSD(上海源葉生物科技公司),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Dickkopf-1(DKK-1)(AF-100-21C、120-30,美國(guó)Peprotech公司),鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥公司),兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-鈣黏素(E-cadherin)、Snail、MMP-7、N-鈣黏素(N-cadherin)一抗(ab150301、ab40772、ab216347、ab207299、ab76011)(Abcam公司),兔抗β-catenin、鼠抗GAPDH一抗(51067-2-AP、60004-1-Ig,PROTEINTECH),Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X)(Thermo Fisher Scientific)。Step One QPCR儀(Applied Biosystems),Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀(Bio-Rad),Ni-U正置熒光顯微鏡(日本NIKON),CR22N冷凍離心機(jī)(CR22N)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HK-2于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育條件為37 ℃、5%CO2,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 SSD作用濃度篩選

使用CCK-8法對(duì)SSD作用濃度進(jìn)行篩選,HK-2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至96孔板,待細(xì)胞貼壁后加入SSD致其最終濃度為0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L,反應(yīng)48 h,每孔加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃反應(yīng)2 h,上樣酶標(biāo)儀,檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的光密度值,觀察細(xì)胞增殖情況,以SSD對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用來(lái)篩選作用濃度。

1.4 細(xì)胞分組和干預(yù)

將對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞分為對(duì)照組、空白溶劑對(duì)照組、RIF組、陽(yáng)性對(duì)照組、SSD組、SSD+DKK-1組,待細(xì)胞貼壁后,除對(duì)照組、空白溶劑對(duì)照組外,其余各組細(xì)胞均予以TGF-β1 5 μg/L處理,陽(yáng)性對(duì)照組增加貝那普利10 μmol/L[6]處理,SSD組增加SSD 10.00 μmol/L處理,SSD+DKK-1組增加SSD 10.00 μmol/L、DKK-1 100 μg/L[7]處理,空白溶劑對(duì)照組添加等體積DMSO處理,繼續(xù)作用48 h,光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 免疫熒光檢測(cè)EMT標(biāo)志物分布和表達(dá)

各組細(xì)胞在藥物作用48 h后,去除培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,4%多聚甲醛固定8 min,PBS沖洗,加入0.3%Triton-X100作用10 min,PBS沖洗,加入10%山羊血清室溫封閉30 min,加入兔抗E-cadherin、α-SMA抗體(1∶500)4 ℃過(guò)夜,加入兔抗IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育30 min,PBS沖洗,使用DAPI染色,封片,熒光顯微鏡觀察并采集圖片,在高倍鏡下每張片子隨機(jī)選取10個(gè)不重疊視野,統(tǒng)計(jì)熒光斑(呈明亮點(diǎn)狀)數(shù)量。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞在藥物作用48 h后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白定量。每孔蛋白上樣為70 μg,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳恒壓分離蛋白(80 V、30 min,120 V、1 h),PVDF膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(恒壓30 V轉(zhuǎn)膜過(guò)夜),5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入鼠抗GAPDH(1∶2 000)和兔抗α-SMA(1∶2 000)、E-cadherin(1∶1 000)、Snail(1∶500)、MMP-7(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)一抗4 ℃過(guò)夜,TBST洗膜,加入山羊抗兔/鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,加入ECL反應(yīng)液8 min,曝光5 min,采集圖片,Image J分析并計(jì)算得到目的條帶與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞膠原蛋白ⅠmRNA表達(dá)

各組細(xì)胞在藥物作用48 h后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用SYBR Green/ROX qPCR Master Mix進(jìn)行熒光定量PCR,PCR擴(kuò)增條件: 94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 15 s、退火60 ℃ 1 min、40個(gè)循環(huán);94 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s,90 ℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工設(shè)計(jì)、合成。引物序列細(xì)胞膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ):正向5′-CAATGTGGTTCGTGACCGTG-3′,反向5′-CAGCCTTGGTTGGGGTCAAT-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度183 bp;GAPDH:正向5′-ACTCCTCCACCTTTGACGCT-3′,反向5′-GGTCTCTCTCTTCCTCTTGTGC-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為187 bp。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SSD作用濃度篩選

當(dāng)SSD作用濃度達(dá)到20.00 μmol/L時(shí),HK-2細(xì)胞增殖受到抑制,故選取10.00 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)SSD處理濃度(圖1)。

圖1 不同濃度SSD對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05,與SSD 0 μmol/L比較。

2.2 SSD對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)變化的影響

對(duì)照組、空白溶劑對(duì)照組細(xì)胞有序、緊密排列,RIF組細(xì)胞呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形且細(xì)胞排列分散;陽(yáng)性對(duì)照組、SSD組和SSD+DKK-1組中長(zhǎng)梭形細(xì)胞較RIF組減少且細(xì)胞分散程度降低(圖2)。

圖2 各組HK-2細(xì)胞形態(tài)比較

2.3 SSD對(duì)HK-2細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響

RIF組EMT標(biāo)志物E-cadherin的熒光斑低于對(duì)照組,α-SMA熒光斑高于對(duì)照組(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、SSD組和SSD+DDK-1組E-cadherin的熒光斑高于RIF組,α-SMA熒光斑低于RIF組(P<0.05);SSD+DKK-1組E-cadherin的熒光斑高于SSD組,α-SMA熒光斑低于SSD組(P<0.05;表1、圖3、圖4)。

表1 各組細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadherin、α-SAM表達(dá)的比較

圖3 免疫熒光檢測(cè)HK-2細(xì)胞及E-cadherin表達(dá)(200×)

圖4 免疫熒光檢測(cè)HK-2細(xì)胞及α-SMA表達(dá)(200×)

2.4 SSD對(duì)HK-2細(xì)胞EMT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

RIF組MMP-7、Snail、E-cadherin、α-SMA、β-catenin蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、SSD組和SSD+DDK-1組MMP-7、Snail、α-SMA、β-catenin蛋白表達(dá)低于RIF組,E-cadherin蛋白表達(dá)高于RIF組(P<0.05);SSD+DKK-1組MMP-7、Snail、α-SMA、β-catenin蛋白表達(dá)低于SSD組,E-cadherin蛋白表達(dá)高于SSD組(P<0.05;表2和圖5)。

表2 各組細(xì)胞MMP-7、Snail、E-cadherin、α-SMA、β-catenin蛋白水平的比較

圖5 各組細(xì)胞MMP-7、Snail、E-cadherin、α-SMA、β-catenin蛋白水平的比較1為對(duì)照組;2為空白溶劑對(duì)照組;3為RIF組;4為陽(yáng)性對(duì)照組;5為SSD組;6為SSD+DKK-1組。

2.5 SSD對(duì)HK-2細(xì)胞Collagen Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量的影響

RIF組Collagen Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組、SSD組和SSD+DKK-1組Collagen Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量低于RIF組(P<0.05);SSD+DKK-1組Collagen Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量低于SSD組(P<0.05;圖6)。

圖6 各組細(xì)胞Collagen Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量a為P<0.05,與對(duì)照組比較;b為P<0.05,與RIF組比較;c為P<0.05,與SSD組比較。

3 討 論

細(xì)胞外基質(zhì)降解或合成異常所致細(xì)胞外基質(zhì)堆積與基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制酶系統(tǒng)失衡、腎小管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等有關(guān),成纖維細(xì)胞活化會(huì)升高α-SMA表達(dá),分泌多種類型膠原,引起細(xì)胞外基質(zhì)在間質(zhì)累積,促進(jìn)間質(zhì)纖維化[8]。TGF-β1可誘發(fā)成纖維細(xì)胞合成、分泌膠原,抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解酶活力來(lái)減少細(xì)胞外基質(zhì)降解[9]。本研究結(jié)果顯示,正常生長(zhǎng)條件下的細(xì)胞有序、緊密排列,TGF-β1誘導(dǎo)下的HK-2細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、細(xì)胞排列分散,貝那普利、SSD干預(yù)可明顯改變細(xì)胞形態(tài)、排列松散情況與文獻(xiàn)[10]趨勢(shì)相似,說(shuō)明SSD可以改善TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞緊湊程度。

E-cadherin可維持腎小管上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,正常腎小管上皮細(xì)胞α-SMA表達(dá)很低,E-cadherin表達(dá)降低或丟失、α-SMA表達(dá)異常升高時(shí)表明上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[11]。本研究免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,TGF-β1誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞E-cadherin熒光斑數(shù)量降低,而α-SMA熒光斑數(shù)量增加,貝那普利、SSD干預(yù)均可改善E-cadherin、α-SMA熒光斑數(shù)量降低、增加趨勢(shì),說(shuō)明SSD可以通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin、α-SMA表達(dá)抑制HK-2細(xì)胞EMT形成。

SSD能夠緩解高糖所致人腎小管上皮細(xì)胞纖維化,其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示,貝那普利、SSD干預(yù)可以明顯緩解MMP-7、Snail、α-SMA、β-catenin蛋白表達(dá)升高趨勢(shì),同時(shí)促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá),與文獻(xiàn)[13]研究結(jié)果趨勢(shì)相似。Collagen Ⅰ細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,Snail可抑制E-cadherin表達(dá)和其他表皮因子表達(dá)(如閉合蛋白、緊密連接蛋白等)[14],MMP-7可裂解E-cadherin[15],TGF-β1可促進(jìn)Snail、N-cadherin轉(zhuǎn)錄、激活,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)變[16],參與EMT進(jìn)程。本次研究結(jié)果說(shuō)明SSD可以通過(guò)降低促EMT相關(guān)蛋白表達(dá)和Collagen Ⅰ基因水平來(lái)抑制HK-2細(xì)胞EMT。

細(xì)胞外Wnt與細(xì)胞膜Fz受體結(jié)合,通過(guò)信號(hào)傳遞抑制細(xì)胞內(nèi)的糖原合成激酶-3β表達(dá),引起細(xì)胞內(nèi)β-catenin集聚,隨后進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子T淋巴細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合,激活編碼波形蛋白、纖維連接蛋白、金屬蛋白酶Snail家族蛋白等,誘導(dǎo)EMT[17]。DKK-1能夠與LRP5/6受體結(jié)合抑制Wnt/β-catenin途徑活性[18],本研究在TGF-β1、SSD作用基礎(chǔ)上增加DKK-1干預(yù),發(fā)現(xiàn)HK-2細(xì)胞長(zhǎng)梭形改變、E-cadherin的熒光斑數(shù)量增加、α-SMA熒光斑數(shù)量降低和MMP-7、Snail、α-SMA、β-catenin蛋白表達(dá)和Collagen Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量升高趨勢(shì)較SSD干預(yù)效果更加顯著,與文獻(xiàn)[19]研究結(jié)果趨勢(shì)相似。Wnt/β-catenin信號(hào)通路可直接靶向作用MMP-7,可對(duì)細(xì)胞黏附、EMT以及組織器官的穩(wěn)定性產(chǎn)生作用[20],促進(jìn)細(xì)胞遷移,該通路活化可促進(jìn)臟器成纖維細(xì)胞活性,促進(jìn)臟器纖維化,影響臟器功能。本次研究結(jié)果說(shuō)明SSD抑制HK-2細(xì)胞EMT可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述,SSD對(duì)人腎小管EMT有抑制作用,可能與抑制Wnt/β-catenin途徑活化有關(guān),本研究主要是從細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)層面探究SSD對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制作用機(jī)制,但疾病發(fā)生、進(jìn)展屬于極其復(fù)雜的過(guò)程,受到多種機(jī)制調(diào)節(jié),后續(xù)將開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討。