雙氫青蒿素對小鼠肺纖維化的影響及作用機制

白君, 陳珠妮, 葉景煥, 熊廣, 李亞清, 謝緯

1.廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院,廣東深圳 518000;2.深圳市中醫(yī)院,廣東深圳 518000

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是局限于肺部的間質(zhì)性肺炎的一種特殊類型,其組織病理學和胸部影像學表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎特征的慢性間質(zhì)性肺疾病,具有慢性、進行性加重及纖維化的特點[1]。近年來青蒿素是中醫(yī)藥研究的熱點課題,青蒿素類藥物對自身免疫性疾病(抗炎)、感染性疾病(抗病毒、抗寄生蟲、抗真菌等)、腫瘤及肺間質(zhì)纖維化等方面均有一定療效[2]。有研究發(fā)現(xiàn),肺纖方能夠減輕小鼠肺纖維化及肺泡炎癥程度,抑制NIH3T3成纖維細胞增殖[3],本研究在此基礎(chǔ)上探討單藥雙氫青蒿素抗肺纖維化的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與細胞

35只SPF級雄性昆明小鼠購買于南方醫(yī)科大學實驗動物中心;NIH3T3成纖維細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

鹽酸博萊霉素針劑(上海生工);復(fù)方雙氫青蒿素片(重慶通和藥業(yè)有限公司);甲潑尼龍(比利時輝瑞制造公司);水合氯醛、羥脯氨酸測定試劑盒和ELISA檢測試劑盒(南京建成A030);MTS細胞增殖試劑盒(Promega公司);兔抗小鼠MMP-2(ab97779)、TIMP1(ab38978)、Cyclin D1(ab16663)多克隆抗體(Abcam公司)。

1.3 模型制作[4]及分組

將35只雄性昆明小鼠采用隨機數(shù)字法分成空白對照組、模型組、甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組,每組各7只小鼠。將模型組、甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠用4%水合氯醛(0.01 mL/g)150 μL腹腔注射麻醉后,固定小鼠,沿著聲門將霧化器(針頭灌胃器)插入氣管并噴入博來霉素溶液(8 mg/kg),隨后將小鼠起立旋轉(zhuǎn)3～5 min,盡量使噴入的博來霉素溶液在兩肺內(nèi)均勻分布,間隔10天后第2次給同等劑量博來霉素,第2次給藥后14天完成模型構(gòu)建[4]。空白對照組使用生理鹽水,以上各組24天后成模。成模后第2天開始給藥治療,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組,每日分別給與甲潑尼龍1 mg/kg,雙氫青蒿素20、50 mg/kg灌胃,空白對照組、模型組則給與等量生理鹽水;各組治療14天后處死,留取肺臟標本進行相關(guān)指標檢測。

1.4 小鼠肺組織病理學檢查和肺泡炎癥、肺纖維化評分

小鼠被處死后取左肺組織,固定后進行脫水,石蠟包埋和切片,HE染色及Masson染色,觀察小鼠肺組織病理學情況,應(yīng)盡量避開大氣管和大血管進行拍照。根據(jù)肺泡炎癥評價方法[5]分為0～3級,一級為輕度改變,病變范圍占全肺比例<20%計1分;二級為中度改變,病變范圍占全肺比例20%～50%計2分;三級為重度改變,病變范圍占全肺比例50%計3分;0級是無明顯病理改變,肺泡結(jié)構(gòu)正常,計0分。將肺組織纖維化程度分為8級[6],一級計1分,可見局部輕纖維及肺泡輕微腫脹;二級計2分,可見明顯纖維化出現(xiàn);三級計3分,出現(xiàn)連續(xù)纖維區(qū)域;四級計4分,纖維面積≤10%;五級計5分,纖維面積占10%～50%;六級計6分,纖維面積>50%;七級計7分,可見肺泡腔充滿纖維組織,肺大皰出現(xiàn);八級計8分,整個區(qū)域出現(xiàn)纖維化病灶;正常肺組織為0級。隨機選取每組所有小鼠各10個視野,將肺泡炎癥評分和纖維化評分分值的均數(shù)作為該小鼠樣本肺泡炎癥、纖維化分級評分。采用盲評方法。

1.5 羥脯氨酸測定

取小鼠右肺組織,沖洗、濾紙吸濕后稱取0.3 g肺組織,研磨后將其制成肺組織勻漿,離心后提取上清液,測定羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量測定的步驟按照ELISA試劑盒說明書規(guī)范操作。

1.6 小鼠NIH3T3成纖維細胞培養(yǎng)

培養(yǎng)NIH3T3成纖維細胞,待細胞長到90%匯合時胰酶消化,于6孔板中種植對數(shù)生長期的細胞,待細胞貼壁后行藥物干預(yù)。共分6組,分別為對照組(Ctrl組)、雙氫青蒿素低劑量組(LQ組)、雙氫青蒿素中劑量組(MQ組)、雙氫青蒿素高劑量組(HQ組)、甲潑尼龍低劑量組(LM組)、甲潑尼龍高劑量組(HM組);LQ、MQ、HQ組分別給與5、10、20 mg/L雙氫青蒿素干預(yù),LM、HM組分別給與10、20 mg/L甲潑尼龍干預(yù);Ctrl組則給與等體積磷酸鹽緩沖鹽溶液。

1.7 MTS法檢測細胞增殖

待細胞長到90%匯合時胰酶消化取對數(shù)生長期的細胞種于6孔板中,0.5×104個/孔。待細胞貼壁后,吸出部分等量培養(yǎng)基,分別換為含有等量各劑量的雙氫青蒿素和甲潑尼龍。分別在0、4、24、48、72 h加入MTS檢測溶液10 μL,37 ℃下孵育,最后于490 nm波長下,用酶標儀檢測光密度值(optical density,OD)。細胞存活率(%)=(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100%。

1.8 Western blotting法測定成纖維細胞相關(guān)蛋白的表達

于6孔板中培養(yǎng)對數(shù)生長期的NIH3T3細胞系,經(jīng)各劑量雙氫青蒿素及甲潑尼龍干預(yù)24 h后,提取細胞總蛋白,完成電泳,濾膜、封閉后,加入CyclinD1、MMP-2、TIMP1抗體,孵育后加入相對應(yīng)的HRP標記的二抗,化學發(fā)光底物顯色后,使用Bio-Rad取像,最后蛋白條帶光密度分析在Scion Image軟件進行。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0版統(tǒng)計軟件,符合正態(tài)分布、方差齊性的計量資料采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色及肺泡炎癥評分

HE染色結(jié)果顯示,空白對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡無明顯萎縮或擴張,肺泡壁無增厚,肺間質(zhì)無炎癥細胞浸潤;模型組肺泡間隔被大量破壞,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,實質(zhì)區(qū)明顯增多,有大量炎癥細胞浸潤;甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整,較少見肺泡塌陷或?qū)嵶?相比模型組肺間隔僅輕度增寬,肺泡內(nèi)炎癥細胞浸潤較少,肺泡破壞程度有所下降(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(400×)

與空白對照組比較,模型組小鼠肺泡炎癥評分升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠肺泡炎癥評分降低(P<0.05);與甲潑尼龍組比較,雙氫青蒿素低劑量組肺泡炎癥評分升高(P<0.05);雙氫青蒿素低劑量組較雙氫青蒿素高劑量組升高(P<0.05;圖1和表1)。

表1 各組小鼠肺組織肺泡炎癥評分及肺纖維化評分比較(n=7) 分

2.2 Masson染色及肺纖維化評分

空白對照組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)整齊、規(guī)則,除支氣管及血管壁有較少淡藍色絲狀纖維沉積,肺泡間隔無明顯膠原纖維增生;模型組可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡間隔廣泛增厚明顯(間隔厚度≥3倍對照組),大量藍色膠原沉積于肺泡間隔及肺間質(zhì);較模型組,甲潑尼龍組,雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠肺組織藍色膠原沉積均明顯減輕(圖2)。與空白對照組比較,模型組肺纖維化評分升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組小鼠肺組織纖維化評分降低(P<0.05;表1)。

圖2 各組小鼠肺組織形態(tài)masson染色結(jié)果(400×)

2.3 各組肺組織羥脯氨酸含量比較

與空白對照組比較,模型組羥脯氨酸含量升高(P<0.05);與模型組比較,甲潑尼龍組、雙氫青蒿素低劑量組、雙氫青蒿素高劑量組羥脯氨酸含量下降(P<0.05;表2)。

表2 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量比較 mg/g

2.4 各組細胞增殖的比較

藥物干預(yù)4 h時,與Ctrl組相比,HM、LQ、MQ、HQ組細胞增殖率下降(P<0.05);干預(yù)24 h及以上,與Ctrl組相比,LM、HM、LQ、MQ、HQ組均能明顯抑制細胞增殖,且隨著時間延長,青蒿素各劑量組組間增殖率下降(P<0.05;表3)。

表3 MTS檢測不同藥物對小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞增殖影響

2.5 成纖維細胞相關(guān)蛋白的表達水平

與Ctrl組相比,LQ、MQ、HQ、LM、HM組CyclinD1和MMP-2蛋白的表達均有下調(diào),且隨著雙氫青蒿素劑量的增加,CyclinD1和MMP-2蛋白水平也下降;HM組與HQ組CyclinD1和MMP-2蛋白下降效果大致相當。與Ctrl組相比,LQ、MQ、HQ、LM、HM組對TIMP1蛋白的表達均有上調(diào)作用,以HQ、HM組上調(diào)最明顯,兩者上調(diào)作用大致相同(圖3和表4)。

表4 蛋白質(zhì)印跡法測定細胞MMP-2、TIMP1、Cyclin D1蛋白條帶灰度值

圖3 Western blotting測定MMP-2、TIMP1、Cyclin D1蛋白表達

3 討 論

青蒿是中藥的一種,具有清虛熱、涼血除蒸、解暑截瘧的功效。青蒿素是從菊科植物黃花蒿(artemisia annua L)中提取的化合物,而雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是體內(nèi)青蒿素的活性代謝產(chǎn)物。雙氫青蒿素可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低細胞炎癥因子表達等方式,減輕肺組織炎癥、降低膠原合成水平、抑制血管內(nèi)皮細胞分化、調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)等,并以此來抑制肺纖維化進程[7-8]。

本研究應(yīng)用不同劑量的DHA、甲潑尼龍對體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3細胞)進行干預(yù),MTS檢測法提示DHA能抑制NIH3T3細胞的增殖能力,在一定范圍內(nèi)呈時間及劑量依賴。且小鼠胚胎成纖維細胞經(jīng)DHA干擾后,炎癥及肺纖維化評分、羥脯氨酸含量均下降,說明DHA能很好地減少肺損傷,抗炎、抑制成纖維細胞增殖,從而減輕肺纖維化程度。但目前肺纖維化的發(fā)病機制尚不明確,大部分學者認為IPF的發(fā)生[9]可能與肺泡上皮細胞受損、肌成纖維細胞異常增殖活化和細胞外基質(zhì)過度積聚有關(guān)。研究指出,肺纖維化的形成過程與MMPs/TIMPs系統(tǒng)平衡和Rho/Rock信號通路參與調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖有關(guān)[10-11]。如Rho激酶抑制劑法舒地爾[12]可逆轉(zhuǎn)MMPs/TIMPs比值,且抑制成纖維細胞CyclinD1蛋白表達,進而抑制成纖維細胞增殖,而前期課題的中藥復(fù)方肺纖方也具有同樣的作用[3]。

基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子是其特異性的組織抑制因子,可以特異性抑制幾乎所有基質(zhì)金屬蛋白酶,對維持ECM蛋白形成和平衡具有重要意義[13]。研究發(fā)現(xiàn),MMP-2在IPF病人肺組織中廣泛表達[14],MMP-2和MMP-9的過度表達被認為在基底膜破壞中起關(guān)鍵作用[15]。因為肺泡壁的結(jié)構(gòu)完整性依賴于基底膜,因此上皮下基底膜的破壞可能是肺泡纖維化過程中的早期事件,這于IPF的發(fā)生來說至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn),被激活的Rho/ROCK信號通路能影響細胞骨架重組調(diào)節(jié),介導(dǎo)細胞遷移,參與肺、肝、腎臟等臟器的纖維化過程,還能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、促使成纖維細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、分泌膠原蛋白等,參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展[16-19]。G1/S期以及有絲分裂過程中ROCK被活化,抑制ROCK活力會促進G1期中心粒的異常分離[20]。在細胞增殖周期中,G1/S期和G2/M期是兩個關(guān)鍵性限制點,G1期中兩個關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白分別是CyclinD1和CyclinE蛋白。CyclinD蛋白在細胞增殖中起正性調(diào)節(jié)作用,CyclniD1表達增加促使S期向G1期轉(zhuǎn)換,推動細胞的有絲分裂。本實驗發(fā)現(xiàn)DHA可以使CyclinD1蛋白表達下降,說明DHA可抑制成纖維細胞增殖。可見,DHA對于IPF中成纖維細胞病態(tài)增殖的治療有一定價值。

綜上,DHA對降低肺纖維化小鼠肺泡炎癥、肺纖維化程度及羥肺氨酸水平的治療有一定作用,表明雙氫青蒿素可能是治療肺纖維化的潛在良好候選藥。