SARS-CoV-2核衣殼蛋白的生物信息學分析、純化及多克隆抗體制備

王巧, 陳芝喜

南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 1.超聲影像科,2.輸血科,湖南衡陽 421001

冠狀病毒是一類有包膜,基因組較大的正鏈RNA病毒,能夠感染果子貍、蝙蝠、蛇和老鼠等多種動物以及人類,能夠通過動物傳染給人類,導致爆發(fā)性流行[1-2]。2019年底由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情席卷全球[3]。

SARS-CoV-2含有核衣殼(nucleocapsid,N)蛋白、包膜(envelop,E)蛋白、刺突(spike,S)蛋白和膜(membrane,M)蛋白4個結構蛋白[4]。N蛋白在SARS-CoV-2感染早期大量表達,誘導患者產生免疫應答,參與SARS-CoV-2的入侵、復制以及干預宿主免疫系統的攻擊[5-6]。雖然已有研究報道了N蛋白的二級結構、三級結構和磷酸化位點等性質,但是其他的生物學特性未見報道[7]。本文使用生物信息學軟件分析SARS-CoV-2 N蛋白的固有無序結構域及其結合序列位點等生物學特性,純化得到全長N蛋白并測定其免疫學活性,為新冠病毒的疫苗研發(fā)和快速診斷提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)由南華大學病原生物學研究所保存;編碼全長N蛋白的重組質粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N由上海捷瑞生物工程有限公司合成;鎳2+(Ni2+)親和層析試劑盒購自美國通用電氣公司;BCA蛋白質定量試劑盒、弗氏佐劑購自美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司;BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;所有生化試劑都為分析純,購自國藥集團。

1.2 N蛋白的生物信息學分析

從NCBI數據庫獲得7種能夠感染人冠狀病毒的N蛋白氨基酸序列即SARS-CoV-2(GenBank:MN908947.3)、HCoV-229E(GenBank:KU291448.1)、HCoV-OC43(GenBank:KU131570.1)、HCoV-NL63(GenBank:KY862074.1)、HCoV-HKU1(GenBank:MH940245.1)、SARS-CoV(GenBank:NC_004718.3)和MERS-CoV(GenBank:MH734115.1)。使用Clustal Omega進行序列比對。使用SOPMA軟件預測SARS-CoV-2 N蛋白的二級結構。使用Pondr和IUPred軟件預測SARS-CoV-2 N蛋白的固有無序結構域(intrinsically disordered protein,IDP)。使用MoRFchib軟件預測SARS-CoV-2 N蛋白的分子識別特征序列。使用IEDB網站分析SARS-CoV-2 N蛋白的B細胞表位。

1.3 N蛋白的表達與純化

將重組質粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N轉化到大腸桿菌BL21(DE3),挑取陽性單克隆至卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng),待細菌在600 nm波長處光密度(optical density,OD)值增加到0.6時,加入終濃度0.1 mmol/L IPTG于28 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h以誘導N蛋白表達。收集細菌置于冰上超聲破碎后,12 000 r/min離心20 min,將所獲得的上清用Ni2+親和層析法純化N蛋白,SDS-PAGE觀察純化效果,利用BCA法測定其水平。

1.4 N蛋白免疫小鼠及多克隆抗體制備

將18只8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為PBS組、佐劑組和N蛋白組,每組6只。PBS組和佐劑組分別注射PBS溶液和相應的佐劑。N蛋白組初次免疫時將完全弗氏佐劑與N蛋白1∶1混勻,然后取100 μg N蛋白皮下注射。在第3周時將完全弗氏佐劑換成不完全佐劑,其他步驟與第1次免疫相同。第6周時按照第2次免疫方法進行第3次免疫。最后一次免疫完2周后處死小鼠,分離抗血清和脾細胞。

1.5 血清抗體滴度檢測

采用ELISA法檢測抗血清中抗N蛋白抗體的含量。將150 ng N蛋白加至96孔板中,4 ℃包被過夜,加入封閉液,室溫封閉2 h,微孔板中加入200 μL不同稀釋倍數的抗血清,并設立陽性對照和陰性對照,37 ℃孵育2 h;經PBS洗滌后,每孔加入100 μL HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋),37 ℃繼續(xù)孵育2 h,PBS洗滌后加入顯色劑,酶標儀上測定其OD450值,并計算待測孔中的P/N值。P/N=(待測孔OD450-空白孔OD450)/(陽性對照孔OD450-空白孔OD450),當P/N≥2.1時判定為陽性,產生陽性結果的最大稀釋倍數即為抗體滴度。

1.6 淋巴細胞增殖測定

取100 μL 1×106個/mL脾細胞懸液加入96孔板中,加30 μg N蛋白刺激細胞增殖,同時設置PBS為陰性對照組和加入40 μg刀豆球蛋白A(ConA)為陽性對照組,每組設置5個重復孔。將96孔板放入到37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h,然后加入10 μL MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,測定OD450值,計算脾細胞增殖的刺激指數(simulate index,SI),判斷淋巴細胞增殖情況。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 N蛋白的序列比對

Clustal Omega軟件分析結果顯示,SARS-CoV-2與SARS-CoV的N蛋白的同源性高于97%,但與HCoV-229E和HCoV-NL63的N蛋白的同源性較低(圖1)。

圖1 不同冠狀病毒N蛋白的序列比對

2.2 SARS-CoV-2 N蛋白的二級結構和固有無序結構預測

SARS-CoV-2 N蛋白二級結構中含有無規(guī)卷曲(C)、α螺旋(h)、β折疊(e)和β轉角(t),分別占55.13%、21.24%、16.71%和6.92%,說明該蛋白的主要二級結構元件為無規(guī)卷曲和α螺旋。SARS-CoV-2 N蛋白在0～45、181～208位氨基酸區(qū)域屬于IDP(得分大于0.5的結構域部分為IDP),該預測結果與其自身二級結構中含有大量無規(guī)卷曲相符合(圖2)。

圖2 SARS-CoV-2 N蛋白固有無序結構A為Pondr軟件;B為IUPred軟件。藍色線條為固有無序結構。

2.3 SARS-CoV-2 N蛋白的分子識別特征序列

SARS-CoV-2 N蛋白具有4個分子識別特征序列,分別在1～20位、82～98位、102～118位和403～409位氨基酸(圖3)。

圖3 SARS-CoV-2 N蛋白的分子識別特征序列藍色區(qū)域為分子識別特征序列。

2.4 SARS-CoV-2 N蛋白的B細胞表位序列

N蛋白具有較強的免疫原性。當閾值設為0.5時,SARS-CoV-2 N蛋白含有11個線性B細胞表位,具體線性B細胞表位的氨基酸序列見表1。

表1 SARS-CoV-2 N蛋白的B細胞表位序列

2.5 SARS-CoV-2 N蛋白的純化

重組質粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N中目的基因長度約為1 260 bp,與SARS-CoV-2 N蛋白的基因大小相符合(圖4A)。將質粒轉入大腸桿菌表達菌,誘導重組菌表達N蛋白,得到蛋白相對分子質量為51.5 kDa,與理論相對分子質量相符合。Ni2+親和層析純化得到純度較高的N蛋白(圖4B)。

圖4 重組質粒pET-28a(+)-SARS-CoV-2-N的PCR驗證(A)和SARS-CoV-2 N蛋白的表達與純化(B)

2.6 SARS-CoV-2 N蛋白多克隆抗體的制備

ELISA結果顯示,N蛋白組血清中特異IgG抗體滴度大于PBS組和佐劑組(P<0.05;圖5)。

圖5 血清中N抗體滴度a為P<0.05,與佐劑組和PBS組比較。

2.7 淋巴細胞增殖

N蛋白刺激小鼠脾細胞SI(1.92±0.21)明顯高于PBS組[(1.19±0.25),P<0.05],但與陽性對照組(2.12±0.29)比較,差異無統計學意義。

3 討 論

研究表明,SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-229E等多種冠狀病毒具有極強的傳染性,容易感染老年人、新生兒以及免疫功能低下的人群[8]。SARS-CoV-2現已與人類長期共存,主要引起呼吸道感染,嚴重者導致器官衰竭、甚至死亡。迄今全球已有2億多確診患者,超過570萬死亡人數[8-10]。

SARS-CoV-2能編碼E、M、S和N 4個結構蛋白。E蛋白結構尚不清楚,免疫原性較弱,但能夠誘導炎癥因子分泌,是SARS-CoV-2的毒力因子[11]。M蛋白能夠誘導患者發(fā)生適應性免疫應答[11]。S蛋白識別人上皮細胞表面的血管緊張素轉換酶2,介導SARS-CoV-2對宿主細胞的黏附,是疫苗開發(fā)的重要靶點[11]。N蛋白是冠狀病毒中最為豐富的蛋白之一,目前SARS-CoV-2已經有Alpha、Beta、Delta和Omicron等多種突變株,但是這些突變株的N蛋白相對保守,點突變相對較少,故臨床上采用N蛋白用于冠狀病毒血清學診斷[12-13]。COVID-19患者體內抗N蛋白抗體滴度較高,故N蛋白能夠用于恢復期患者的診斷[12-14]。本文結果顯示,SARS-CoV-2 N蛋白具有良好免疫原性,能夠誘導小鼠分泌高滴度特異性抗體,與文獻[15]報道結果相一致,同時N蛋白能夠刺激小鼠淋巴細胞增殖,這說明N蛋白能夠誘導宿主發(fā)生免疫應答。

生物信息學是將計算機技術和生命科學相結合而形成的一門新科學。利用生物信息能夠預測和分析病毒蛋白的結構和功能[9-10,16]。傳統觀點認為蛋白質只有折疊形成確定的三級結構后才能發(fā)揮功能,但近年來發(fā)現一些蛋白質沒有三級結構,但是依舊具有重要的生物學功能,現在將這類蛋白質稱為IDP。病毒蛋白中存在大量IDP,且是抗病毒的藥物作用靶點[17]。SARS-CoV-2M蛋白具有2個IDP,這兩個結構域可能參與細胞信號轉導和轉錄調節(jié)等功能[18]。本研究預測得到SARS-CoV-2 N蛋白含有大量IDP。用MoRFchib軟件分析結果顯示,SARS-CoV-2 N蛋白有4個區(qū)域可能是分子識別特征序列,能夠參與識別和結合靶分子。SARS-CoV-2 N蛋白與其他冠狀病毒的N蛋白一樣,能夠通過IDP與核酸和靶蛋白發(fā)生相互作用[17-19]。

綜上所述,本文利用生物信息學方法分析了SARS-CoV-2 N蛋白的二級結構、IDP結構域、分子識別特征序列、B細胞表位等生物學性質,純化得到全長N蛋白并測定其免疫學特性,為研究SARS-CoV-2致病機制以及診斷試劑提供實驗基礎。