孤獨(dú)癥譜系障礙相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子EB基因罕見(jiàn)變異導(dǎo)致神經(jīng)元軸突發(fā)育障礙

胡龍妃, 譚潔瓊, 胡章雪

1.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心兒科,重慶 400010;2.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中心,湖南長(zhǎng)沙 410000

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,全球患病率約為1%[1],具有高度遺傳性和病因異質(zhì)性[2-3],ASD發(fā)病機(jī)制尚不明確,有研究表明,遺傳是ASD的主要病因,其與環(huán)境因素交互作用導(dǎo)致神經(jīng)連接和大腦發(fā)育異常,從而導(dǎo)致ASD發(fā)生[4]。目前已發(fā)現(xiàn)100多個(gè)ASD的易感或致病基因[5-8],遺傳學(xué)研究提示,染色體異常、常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)變異、新發(fā)和罕見(jiàn)的拷貝數(shù)變異及新發(fā)和罕見(jiàn)的基因變異等均參與ASD的發(fā)生[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)的3個(gè)罕見(jiàn)新發(fā)變異c.A520T、c.G65A和c.C1393T可能與神經(jīng)發(fā)育障礙發(fā)生有關(guān)[11-12]。TFEB是轉(zhuǎn)錄因子家族MiTF/TFE的成員之一,可參與調(diào)控溶酶體生物發(fā)生及功能、細(xì)胞代謝及自噬等生命活動(dòng)[13-14]。本文旨在探究TFEB的3種變異是否參與ASD的發(fā)生及其致病機(jī)制,為ASD提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞及儀器

Torin1(Selleckchem公司),Rapamycin(Sigma公司),DMSO和DAPI(Sigma-Aldrich公司),DMEM高糖培養(yǎng)基、0.05%胰蛋白酶、Opti-MEM(GibcoTM公司),Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000(Invitrogen公司),QIAGEN質(zhì)粒Midi試劑盒、Qiagen RNeasy mini Kit、SuperScript III First-Strand Synthesis System(Qiagene公司),SYBR Green qPCR混合物(TAKARA公司),Dual-Luciferase? Reporter(DLRTM)Assay System(Promaga公司)。小鼠腦神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞293(HEK293細(xì)胞)系中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中心保存。神經(jīng)元細(xì)胞取自B6品系小鼠(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)胎鼠。實(shí)時(shí)定量PCR儀、水平電泳槽、蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及電源(Bio-Rad公司),解剖顯微鏡、熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡(Leica公司),超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)。

1.2 構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

通過(guò)生物學(xué)信息篩選出TFEB的3個(gè)有害變異c.G65A(p.R22Q)、c.A520T(p.I174F)和c.C1393T(p.R465W),構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒:引物設(shè)計(jì)與突變位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ),突變包含在引物序列的中間。引物退火連接。DpnI酶切1 h、轉(zhuǎn)化,提取質(zhì)粒DNA并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。提前將N2a細(xì)胞種至24孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～90%匯合時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染,每孔用50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋200 ng質(zhì)粒DNA,充分混勻后加入0.5 μL NeofectTM試劑,室溫靜置15～30 min。緩慢均勻地添加DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物到孔板中,37 ℃孵育細(xì)胞24～48 h進(jìn)行收樣。

1.3 免疫熒光檢測(cè)TFEB WT及突變體亞細(xì)胞定位

實(shí)驗(yàn)分為過(guò)表達(dá)TFEB野生型(WT)組、過(guò)表達(dá)p.R22Q組、過(guò)表達(dá)p.I174F組及過(guò)表達(dá)p.R465W組。在N2a細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒,培養(yǎng)24 h后分別添加DMSO及1 μmol/L Torin 1(mTOR抑制劑)處理1 h,免疫熒光檢測(cè)亞細(xì)胞定位:收集細(xì)胞,加入4%多聚甲醛固定液室溫固定;PBS漂洗后加入0.1%Triton X-100/PBS室溫透化;PBS漂洗,挑出爬片,封閉1 h;加一抗4 ℃過(guò)夜;PBS漂洗,加二抗室溫避光孵育1 h;PBS漂洗,DAPI染核;PBS漂洗,封片,激光共聚焦顯微鏡掃描和拍攝。

1.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞核質(zhì)比及蛋白半衰期

為進(jìn)一步證實(shí)突變體是否影響TFEB的細(xì)胞定位,N2a細(xì)胞分為過(guò)表達(dá)pEGFP-N1空載體組、過(guò)表達(dá)TFEB WT組、過(guò)表達(dá)p.R22Q組、過(guò)表達(dá)p.I174F組及過(guò)表達(dá)p.R465W組。細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離、免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞核質(zhì)比:分別收集細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì),用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組取等量樣本進(jìn)行凝膠電泳,先80 V電泳30 min,后改為120 V電泳60 min。電泳后290 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h,封閉1 h,加一抗,4 ℃過(guò)夜,TBST洗膜,加二抗室溫孵育1 h,洗膜,ECL發(fā)光法顯影。內(nèi)參為L(zhǎng)amin B1和Tubin。

變異也可以通過(guò)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性來(lái)增強(qiáng)或減弱蛋白功能,為證實(shí)突變體對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響,實(shí)驗(yàn)分為過(guò)表達(dá)TFEB WT組、過(guò)表達(dá)p.R22Q組、過(guò)表達(dá)p.I174F組及過(guò)表達(dá)p.R465W組,通過(guò)核糖體抑制劑CHX處理抑制新生蛋白質(zhì)合成,免疫印跡檢測(cè)TFEB WT及點(diǎn)突變蛋白半衰期。各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,將培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基,用100 g/L CHX抑制新生蛋白的合成,處理0、6、12 h后用SDS裂解細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)TFEB的蛋白水平。內(nèi)參為Actin。

1.5 原代小鼠神經(jīng)元培養(yǎng)

將培養(yǎng)板涂覆0.1 g/L poly-D-lysine包被過(guò)夜。從E16-E18的小鼠胚胎中分離皮質(zhì)組織,并小心去除腦膜和血管。將組織在37 ℃下用0.25%Trypsin-EDTA消化15 min,用含10%FBS的DMEM終止消化得到細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并在添加了B27、GlutaMAX和青霉素/鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基中以1×105個(gè)/cm2種植細(xì)胞。將神經(jīng)元維持在37 ℃、5%CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng),每3～4天更換一半培養(yǎng)基。

1.6 構(gòu)建mTFEB-shRNA質(zhì)粒

利用NCBI及Life Technologies網(wǎng)站設(shè)計(jì)出3條shRNA序列,通過(guò)公司訂購(gòu)合成引物。引物退火連接,酶切pLKO.1 puro克隆載體,EcoRI/AgeI酶切、連接、轉(zhuǎn)化。獲得重組質(zhì)粒-pLKO.1 puro-shRNA-TFEB并經(jīng)Sanger測(cè)序鑒定。

1.7 神經(jīng)元磷酸鈣轉(zhuǎn)染

為研究TFEB在神經(jīng)元軸突發(fā)育中的作用,實(shí)驗(yàn)分為干擾組(包括shRNA-NC組、TFEB-shRNA-1組和TFEB-shRNA-2組)和過(guò)表達(dá)組(包括空載體組、TFEB WT組)。同時(shí)共轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒以顯示成功轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元。首先,提前1天在24孔板中接種神經(jīng)元細(xì)胞,次日開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將2.5 μg待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒與1.9 μL 2 mol/L氯化鈣混勻,并加入ddH2O補(bǔ)齊體系至15 μL,再次混勻后緩慢滴加15 μL 2×HBS(pH 7.07),混勻后,室溫下避光靜置30 min。緩慢添加轉(zhuǎn)染體系到6孔板中,37 ℃孵育80 min。用Wash Solution清洗神經(jīng)元,在Neurobasal培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)神經(jīng)元至第5天時(shí)進(jìn)行收樣。

為研究TFEB變異對(duì)神經(jīng)元軸突發(fā)育的影響,設(shè)置NC組和TFEB-shRNA干擾組(包括過(guò)表達(dá)NC組、過(guò)表達(dá)TFEB WT組、過(guò)表達(dá)p.R22Q組、過(guò)表達(dá)p.I174F組及過(guò)表達(dá)p.R465W組)。體外培養(yǎng)2天時(shí)分別轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒,于3天后收樣,通過(guò)免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度。

Rapamycin是自噬調(diào)控因子mTOR的抑制劑,可以激活自噬-溶酶體功能,因此設(shè)置shRNA-NC組、TFEB-shRNA組和TFEB-shRNA+Rapamycin組。在體外培養(yǎng)2天的胎鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒,于3天后收樣,通過(guò)免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TFEB下游自噬-溶酶體基因表達(dá)

提取總RNA,合成互補(bǔ)DNA(cDNA),然后進(jìn)行qPCR。條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,循環(huán)40次。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算感興趣基因的相對(duì)表達(dá)水平,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

1.9 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定檢測(cè)TFEB變異對(duì)其轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的影響

將HEK293細(xì)胞種在24孔板中,然后使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染4×CLEAR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒以及Renilla熒光素酶對(duì)照質(zhì)粒。48 h后,裂解細(xì)胞,熒光素酶活性使用Dual-Luciferase? Reporter(DLRTM)Assay System進(jìn)行檢測(cè)。Firefly熒光素酶活性使用Renilla熒光素酶活性來(lái)進(jìn)行標(biāo)化,以校正轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性的變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,使用Image J軟件對(duì)原始圖片進(jìn)行圖像分析,使用GraphPad Prism9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和統(tǒng)計(jì)圖像繪制。兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn),3組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 變異導(dǎo)致TFEB細(xì)胞內(nèi)分布異常

過(guò)表達(dá)TFEB WT和突變體免疫熒光結(jié)果顯示TFEB亞細(xì)胞定位,TFEB WT主要定位于細(xì)胞質(zhì),突變體p.R22Q及p.R465W主要定位于細(xì)胞核,而突變體p.I174F定位于細(xì)胞質(zhì),但所有的突變體在自噬激活劑Troin處理后,與WT一樣都能正常定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖1)。分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,免疫印跡檢測(cè)顯示,點(diǎn)突變p.R22Q及p.R465W與野生型相比,核質(zhì)比增加;而點(diǎn)突變p.I174F核質(zhì)比較野生型差異無(wú)顯著性(圖2)。

圖1 TFEB變異對(duì)其亞細(xì)胞定位的影響(600×)綠色為TFEB-GFP WT及突變體,藍(lán)色為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。

圖2 變異對(duì)TFEB核分布的影響(n=4)a為P<0.05,與WT比較。

2.2 變異不影響TFEB蛋白的穩(wěn)定性

如圖3所示,TFEB的這3種變異蛋白的穩(wěn)定性均未發(fā)生顯著改變。

圖3 變異對(duì)TFEB蛋白穩(wěn)定性的影響(n=3)

2.3 TFEB調(diào)控原代培養(yǎng)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)

通過(guò)在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中轉(zhuǎn)染兩個(gè)靶向TFEB不同位點(diǎn)的shRNA來(lái)干擾TFEB的表達(dá),探討TFEB對(duì)神經(jīng)元軸突發(fā)育的影響,結(jié)果顯示,TFEB干擾后能顯著減少神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度(圖4A),而過(guò)表達(dá)TFEB-GFP則能增加神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度(圖4B)。

圖4 TFEB在體外調(diào)控原代培養(yǎng)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)A為干擾內(nèi)源性TFEB;B為過(guò)表達(dá)TFEB。a為P<0.001,與shRNA-NC或Vector比較。

2.4 TFEB變異導(dǎo)致軸突長(zhǎng)度縮短

如圖5A所示,p.R22、p.I174和p.R465在人、猴、小鼠和大鼠中都非常保守,這些位點(diǎn)的變異可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。在干擾TFEB后,再過(guò)表達(dá)TFEB WT可以恢復(fù)由干擾內(nèi)源性TFEB引起的神經(jīng)元突觸縮短,而p.R22Q、p.I174F和p.R465W變異則不能恢復(fù)該神經(jīng)元突觸縮短(圖5B、C),表明這些突變體已經(jīng)損害了TEFB的神經(jīng)軸突發(fā)育促進(jìn)功能。

圖5 ASD相關(guān)的TFEB變異導(dǎo)致體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度縮短A為TFEB氨基酸序列的保守性分析;B和C為干擾內(nèi)源性TFEB后分別過(guò)表達(dá)野生型TFEB及突變體的軸突生長(zhǎng)情況。a為P<0.05,b為P<0.01,與WT比較。

2.5 自噬激動(dòng)劑Rapamycin恢復(fù)由TFEB缺陷引起的軸突縮短

Rapamycin可以恢復(fù)由TFEB干擾引起的神經(jīng)元軸突縮短(圖6),這表明TFEB可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬-溶酶體功能影響神經(jīng)元軸突發(fā)育。

圖6 Rapamycin恢復(fù)由TFEB缺陷引起的軸突縮短a為P<0.05,b為P<0.01,與shRNA-TFEB比較。

2.6 TFEB變異導(dǎo)致自噬-溶酶體基因表達(dá)降低

過(guò)表達(dá)野生型TFEB可以增加自噬-溶酶體相關(guān)基因的表達(dá),而p.R22Q、p.I174F和p.R465W變異則不能(圖7),表明這些突變體已經(jīng)損害了TEFB的自噬-溶酶體基因的轉(zhuǎn)錄活性。

圖7 ASD相關(guān)的TFEB變異導(dǎo)致自噬-溶酶體基因表達(dá)降低A為過(guò)表達(dá)野生型TFEB和突變體后自噬-溶酶體相關(guān)基因的表達(dá)水平;B為野生型TFEB及突變體的4X-CLEAR熒光素酶活性。a為P<0.05,b為P<0.01,與WT比較。

3 討 論

自噬是所有真核生物中高度保守的細(xì)胞分解過(guò)程,參與多種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生理過(guò)程,例如適應(yīng)代謝應(yīng)激、清除細(xì)胞異常和防止DNA損傷[15-16]。溶酶體通過(guò)mTORC1-TFEB軸在營(yíng)養(yǎng)感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮積極作用[17-19]。TFEB是自噬-溶酶體形成的最重要的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、凋亡、分化和其他細(xì)胞生理功能起著關(guān)鍵作用。TFEB的功能異?？梢詫?dǎo)致自噬-溶酶體功能障礙,Rapamycin是自噬調(diào)控因子mTOR的抑制劑,可以激活自噬-溶酶體功能。自噬途徑可能參與了ASD的發(fā)病機(jī)制。文獻(xiàn)[20]在ASD病例中發(fā)現(xiàn)自噬途徑相關(guān)的基因外顯子拷貝數(shù)變異增加,通過(guò)富集和通路分析ASD病例中的相關(guān)基因,他們觀察到包括GABARAPL2、GABARAPL1、MAP1LC3A、GABARAP和MAP1LC3B在內(nèi)的5個(gè)與自噬相關(guān)的基因的顯著富集,這些基因是酵母自噬基因Atg8的哺乳動(dòng)物同源物,這項(xiàng)研究表明自噬在ASD中發(fā)生了失調(diào)。PTEN變異介導(dǎo)的mTOR的激活(抑制自噬)在小鼠中表現(xiàn)出孤獨(dú)癥樣行為和異常的神經(jīng)元樹(shù)突結(jié)構(gòu),這也表明自噬在ASD的發(fā)生中可能起重要作用[21]。同時(shí),缺乏ambra-1(beclin-1的一個(gè)正調(diào)控因子,是自噬體形成的主要參與者)的雌性小鼠觀察到了類似于孤獨(dú)癥的表型,這進(jìn)一步表明ASD中自噬可能存在失調(diào)[22]。雷帕霉素作為mTOR的抑制劑可以激活自噬,恢復(fù)孤獨(dú)癥癥狀,并改善PTEN變異小鼠的異常神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)[23-24]。最近的研究在ASD患者死亡后的顳葉皮層中也觀察到過(guò)度活躍的mTOR和受損的自噬[25]。

總之,本研究發(fā)現(xiàn),作為自噬-溶酶體功能最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TFEB變異可能參與ASD的發(fā)生,導(dǎo)致神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的損害,同時(shí),自噬的激活能恢復(fù)TFEB變異引起的神經(jīng)軸突縮短,提示TFEB和自噬溶酶體功能缺陷參與了ASD疾病的發(fā)生。