楸樹DELLA基因家族生信分析及CbuGRAS9的功能分析

王珊珊 王 瑞 樊二勤 付鵬躍 曲冠證 王 楠

（1.林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091）

成花轉(zhuǎn)變是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的關(guān)鍵發(fā)育過程，該過程受到遺傳和環(huán)境等諸多因子調(diào)控［1-2］。學(xué)者們基于模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）揭示了許多植物成花誘導(dǎo)的分子機(jī)制［1，3］。植物開花由多條內(nèi)外信號途徑調(diào)控，主要遺傳途徑包括光周期途徑、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑、溫度以及年齡途徑［4-5］。這些途徑通過激活成花調(diào)控因子FT、SOC1以及LFY 等促進(jìn)開花，而ELF3、SVP、TEM1 和TEM2 等因子能抑制開花基因的表達(dá)［6］。赤霉素（GAs）途徑被認(rèn)為是調(diào)控開花的主要途徑之一，當(dāng)赤霉素受體感知GA 信號后，通過調(diào)控相關(guān)開花基因（如FT、FLC、SOC1及LFY）的表達(dá)進(jìn)而影響植物開花［7-9］。生長抑制因子DELLA 蛋白是GA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵成分，目前許多研究已經(jīng)證實(shí)DELLA 蛋白的多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在GAs 信號通路中發(fā)揮調(diào)控作用［10］。DELLA蛋白C端的GRAS結(jié)構(gòu)域高度保守，可以通過參與蛋白間的互作和轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程抑制GAs 信號，同時(shí)對于維持DELLA 蛋白的功能也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［11］。DELLA 蛋白的N 端是不高度保守的，其N 端調(diào)控區(qū)所包含的DELLA 和TVHYNP 序列作為GA 信號的感知結(jié)構(gòu)域，對GID1 結(jié)合至關(guān)重要，是GAs 誘導(dǎo)DELLA 蛋白降解的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［12-13］。GAs 存在或者濃度增加的情況下，GAs 與GID1 受體結(jié)合促進(jìn)GID1-GA-DELLA 復(fù)合物的形成，然后經(jīng)過SCFSLY1E3 泛素酶介導(dǎo)靶向DELLA蛋白泛素化，最后致使DELLA 蛋白在26S 蛋白酶體中的最終降解［14-17］。有相關(guān)研究表明，DELLA調(diào)控植物生長可通過不依賴于GA 的方式進(jìn)行［18］，如發(fā)生琥珀?；腄ELLA 能夠通過SIM-SUMO 結(jié)構(gòu)域與GID1相互作用，隨后DELLA蛋白的泛素化降解被誘導(dǎo)［19-21］。盡管已有研究表明DELLA 蛋白可能在生殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但是不同物種中DELLAs 蛋白數(shù)目差異及功能分化還有待進(jìn)一步研究［22］。

對于多年生木本植物而言，開花對其發(fā)育以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提高至關(guān)重要。適宜的開花時(shí)間作為木本關(guān)鍵性狀之一，很大程度上影響木本植物的品質(zhì)［23］。楸樹（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）多年生木本植物，作為我國特有的珍貴樹種和觀賞樹種，廣泛分布在河南、安徽等地［24］。‘百日花’楸樹（Catalpa‘Bairihua’）的獲得是以F1代楸樹為母本，滇楸（C.fargesiif.duclouxii）為父本，經(jīng)過人工控制雜交獲得的F2代雜種［25］。楸樹一般在種植5～7 年后首次開花，而‘百日花’楸樹作為一個(gè)新品種，嫁接當(dāng)年就能開花，且花期要遠(yuǎn)長于普通楸樹，每年累積花期可達(dá)100 d，這在木本植物中很少發(fā)生［23，26-27］。因此，‘百日花’楸樹可作為木本植物中研究生殖轉(zhuǎn)變相關(guān)調(diào)控機(jī)制的重要材料。本研究從楸樹基因組中共鑒定到5 個(gè)DELLAs 基因，分析了其在‘百日花’和對照9-1（Catalpa bungei‘Luoqiu No.1’）中的表達(dá)量差異，明確了差異最顯著的基因CbuGRAS9的分子功能，篩選了與CbuGRAS9 互作的蛋白。本研究不僅有助于進(jìn)一步解析‘百日花’楸提早開花的分子機(jī)制，也將為其他木本植物生殖調(diào)控研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是2022 年5 月在河南省南陽市采集的1 年生嫁接苗9-1 楸（對照）和‘百日花’楸，砧木為1 年生梓樹（C.ovata）。試驗(yàn)中所用到的擬南芥（Arabidopsis thalianaCol-0）和煙草（Nicotiana benthamiana）均由林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 CbuDELLAs蛋白基本信息學(xué)分析使用

利用ExPASy（https：//web.expasy.org）網(wǎng)站在線預(yù)測CbuDELLAs 蛋白的氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)和分子質(zhì)量；利用Plant-mPloc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）在線工具對CbuDELLAs 的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具對其進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）和SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）在線工具對其跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽進(jìn)行分析。使用EMBLEBI（http：//pfam.xfam.org/+TBtools）在線工具對楸樹的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析鑒定；使用MEME（https：//meme-suite.org/meme/meme_5.3.2/tools/meme）網(wǎng)站對楸樹CbuDELLAs 蛋白的保守基序進(jìn)行在線分析，motifs 數(shù)目設(shè)置為12［28］。根據(jù)已知楸樹基因組序列，提取轉(zhuǎn)錄起始位置（ATG）前2 000 bp 序列作為啟動子序列，通過PlantCare 在線網(wǎng)站對基因啟動子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測。

1.3 楸樹CbuDELLAs基因克隆

從楸樹基因組中提取CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS9、CbuGRAS22和CbuGRAS32的 基 因 序列。利用植物總RNA 提取試劑盒（北京兆葵生物科技有限公司）提取9-1 楸和‘百日花’楸不同組織部位的總RNA，包括頂芽、幼葉、功能葉、莖、木質(zhì)部、韌皮部以及‘百日花’楸樹的花，提取詳細(xì)方法參照試劑盒說明書。使用TaKaRa 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Bioedit 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以cDNA 為模板，使用特異性引物擴(kuò)增目的片段，所用引物見本刊網(wǎng)站電子附表1。反應(yīng)體系與程序參考東洋紡（上海）生物科技有限公司的KOD-Plus-Neo 說明書。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒對目的條帶單一的膠塊進(jìn)行膠回收?；厥盏玫降腄NA片段與pEASY-T1 進(jìn)行DNA 連接，連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，涂布于具有Kan 抗性的LB 平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16～18 h。隨機(jī)在抗性平板上挑取單克隆菌斑進(jìn)行PCR 檢測，檢測正確的單克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 CbuDELLAs蛋白的基本信息Table 1 Basic information of CbuDELLAs

1.4 楸樹CbuDELLAs組織特異性表達(dá)分析

利用Instegrated DNA Technologies 在線網(wǎng)站進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì)，以CbuActin（evm.model.group3.531）為內(nèi)參基因，以無性系9-1楸和‘百日花’楸不同組織部位的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測分析。定量PCR檢測所需引物見附表1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系參考TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ試劑說明書。使用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)，分析CbuDELLAs在9-1楸和‘百日花’楸不同組織的相對表達(dá)量。

1.5 CbuGRAS9基因異源轉(zhuǎn)化及表型分析

將目的片段CbuGRAS9與過表達(dá)載體pROKⅡ連接并轉(zhuǎn)入GV3101 農(nóng)桿菌（AgrobacteriumStrain），使用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行表型觀察分析。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及亞細(xì)胞定位觀察

構(gòu)建pGWB405-35S：：CbuGRAS9-GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌菌種中，使用注射法［29］對小葉煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，黑暗室溫條件下培養(yǎng)48 h；取注射后葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 CbuGRAS9 蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性分析及酵母雙雜交文庫篩選

將CbuGRAS9基因構(gòu)建到pGBKT7 載體，在SD/-Trp/-Leu 液體培養(yǎng)基中分別加入Y2HGold（pGBKT7-CbuGRAS9）、陽性對照、陰性對照和毒性對照于恒溫條件下培養(yǎng)；菌液分別稀釋100、1 000、10 000 倍。菌液點(diǎn)樣至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（QDO）培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察轉(zhuǎn)錄自激活活性。挑取誘餌載體的單菌落加入SD/-Trp 液體培養(yǎng)基活化，活化菌液劃線培養(yǎng)。單菌落過夜培養(yǎng)至OD600到達(dá)0.8。將酵母菌液加入液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將楸樹酵母文庫工作菌液與重懸的菌液一同加入液體培養(yǎng)基，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；20 h 后，40 倍光學(xué)顯微鏡下觀察雜交樣品中是否出現(xiàn)三葉草形狀的結(jié)合子。將培養(yǎng)后的菌液離心后再次用液體培養(yǎng)基重懸菌體，重復(fù)2次；取部分菌液梯度稀釋100、1 000、10 000倍，分別將原液與稀釋菌液涂在平板上培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)基上的白色菌落，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測［23］。

1.8 高通量測序及GO富集和KEGG富集分析

將酵母雙雜交篩選的所有菌落混合后進(jìn)行純化回收送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行高通量測序。測序結(jié)果利用cutadapt2.6［30］去除引物序列，將去除引物后的reads 利用bowtie2.3.5.1［28］比對到參考基因組。比對到各個(gè)基因的測序reads count 使用bedtools v2.29.0［31］進(jìn)行提取，將count>0的基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集。GO 分析標(biāo)注目的基因并且注釋分類；通過目的基因的分布情況，判斷目的基因相關(guān)功能。將目的基因與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，標(biāo)記目的基因的分布及富集情況及顯著相關(guān)的信號通路［32］。

2 結(jié)果與分析

2.1 CbuDELLAs蛋白基本信息學(xué)

提取擬南芥中的AtDELLAs 蛋白序列并在楸樹基因組中BLAST，鑒定到5 個(gè)同源蛋白。將5 個(gè)CbuDELLAs蛋白根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)注釋分別命名為CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS9、CbuGRAS22 和CbuGRAS32，均屬于GRAS 家族，DELLA 亞家族。如表1 所示，全部蛋白的氨基酸數(shù)目455～588，相對分子質(zhì)量5.04～6.43 kDa，等電點(diǎn)4.81～5.14。亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果顯示，5 個(gè)CbuDELLAs 蛋白均定位于細(xì)胞核中。除了Cbu-GRAS22 不穩(wěn)定系數(shù)小于40 之外，其他幾個(gè)蛋白不穩(wěn)定系數(shù)都大于40，表明僅CbuGRAS22 是穩(wěn)定蛋白，其余為不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)預(yù)測結(jié)果顯示，CbuDELLAs 蛋白親水性平均系數(shù)-0.246～-0.174，全部為親水性蛋白。

2.2 CbuDELLAs蛋白二級與三級結(jié)構(gòu)

將CbuDELLAs 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，5 個(gè)蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋所占比例最多，在50%左右；其次是無規(guī)則卷曲，占比28.57%～40.82%；β轉(zhuǎn)角和延伸鏈占比分別為4.40%～5.64%和8.90%～10.55%；因此CbuDELLAs 蛋白的主要組成成分是α螺旋和無規(guī)則卷曲（圖1，表2）。蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖2 所示，CbuGRAS1、CbuGRAS32 和CbuGRAS9 都 由15 個(gè)α螺 旋 和9 個(gè)β折 疊 組 成，CbuGRAS2 由14 個(gè)α螺 旋 和11 個(gè)β折 疊 組 成，CbuGRAS22 由14 個(gè)α螺旋和9 個(gè)β折疊組成，表明CbuGRAS1、CbuGRAS32 和CbuGRAS9 的 三 級結(jié)構(gòu)特征相似，與其他兩個(gè)有所不同。

圖2 CbuDELLAs蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測A.CbuGRAS1蛋白三級結(jié)構(gòu)；B.CbuGRAS2蛋白三級結(jié)構(gòu)；C.CbuGRAS9蛋白三級結(jié)構(gòu)；D.CbuGRAS22蛋白三級結(jié)構(gòu)；E.CbuGRAS32蛋白三級結(jié)構(gòu)。Fig.2 Tertiary structure prediction of CbuDELLA proteins A.Tertiary structure of CbuGRAS1；B.Tertiary structure of CbuGRAS2；C.Tertiary structure of CbuGRAS32；D.Tertiary structure of CbuGRAS9；E.Tertiary structure of CbuGRAS22.

表2 CbuDELLAs蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析Table 2 Secondary structure analysis of CbuDELLAs

2.3 CbuDELLAs保守結(jié)構(gòu)域與保守基序

CbuDELLAs 蛋白均包含C 端的GRAS 保守結(jié)構(gòu)域和N 端的DELLA 結(jié)構(gòu)域（見圖3）。使用MEME 在線工具對楸樹DELLAs 蛋白的保守基序分析，motifs數(shù)量設(shè)置為12；CbuGRAS2缺少motif 8和motif 12，而CbuGRAS1、CbuGRAS9、CbuGRAS22和CbuGRAS32 的12 個(gè)保守基序相同且位置基本一致。由此表明CbuGRAS22、CbuGRAS1、Cbu-GRAS9 和CbuGRAS32 有較高的相似性，而Cbu-GRAS2與其他蛋白存在差異性。

圖3 CbuDELLAs蛋白保守結(jié)構(gòu)域與啟動子順式作用元件A.左：CbuDELLAs蛋白保守結(jié)構(gòu)域；右：CbuDELLAs蛋白保守基序；B.CbuDELLAs啟動子順式作用元件分析。Fig.3 Analysis of conserved domain of CbuDELLAs and cis-acting elements of CbuDELLAs promoter A.Left：conserved domain CbuDELLAs；Right：conserved motif of CbuDELLAs；B.Cis-acting elements of CbuDELLAs promoter.

2.4 CbuDELLAs啟動子順式作用元件

從楸樹基因組序列提取CbuDELLAs轉(zhuǎn)錄起始位置前2 000 bp 序列，通過PlantCare 在線網(wǎng)站預(yù)測基因啟動子順式作用元件。預(yù)測結(jié)果顯示，CbuDELLAs基因啟動子含有真核生物啟動子的基本元件CAAT-box 和TATA-box（見圖3B）。經(jīng)可視化分析，CbuDELLAs基因啟動子含有光響應(yīng)作用元件、激素誘導(dǎo)元件（參與赤霉素反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件和參與脫落酸反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件）等，因此推斷CbuDELLAs基因可能通過介導(dǎo)赤霉素信號通路參與‘百日花’楸樹的早花過程。

2.5 CbuDELLAs基因克隆

利用附表1中的引物克隆基因片段，克隆產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示出的條帶位置與目的序列大小一致（見圖4A）。將膠回收后的片段與pEASY-T1進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑取單克隆菌斑進(jìn)行PCR檢測（見圖4），挑選檢測結(jié)果正確的單克隆菌斑進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果與CbuDELLAs基因序列相似性高達(dá)99%以上。

圖4 目的片段克隆及連接到pEASY-T1大腸桿菌菌液PCR檢測M.DL5000 DNA Marker；7.陰性對照；A.楸樹DELLA 基因克?。?～5.基因CbuGRAS1、CbuGRAS2、CbuGRAS22、CbuGRAS32、CbuGRA9 克隆產(chǎn)物）；B.pEASY-T1-CbuGRAS1 在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS1 菌液PCR 產(chǎn)物）；C.pEASY-T1-CbuGRAS2 在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS2 菌液PCR 產(chǎn)物）；D.pEASY-T1-CbuGRAS9 在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS9菌液PCR 產(chǎn)物）；E.pEASY-T1-CbuGRAS22在大腸桿菌菌液中的PCR 檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS22菌液PCR 產(chǎn)物）；F.pEASYT1-CbuGRAS32在大腸桿菌菌液中的PCR檢測（1～6.pEASY-T1-CbuGRAS32菌液PCR產(chǎn)物）。Fig.4 Cloning of the target sequence and PCR detection of the fragment linked to E.coli pEASY-T1 M.DL5000 DNA Marker；7.Negative control；A.Sequences of Catalpa bungei DELLA（s1-5.CbuGRAS1，CbuGRAS2，CbuGRAS22，CbuGRAS32，Cbu-GRA9 PCR products）；B.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS1 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS1）；C.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS2 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS2）；D.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS9 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS9；E.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS22 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS22）；F.PCR detection of pEASY-T1-CbuGRAS9 in E.col（i1-6.PCR products of pEASY-T1-CbuGRAS9）.

2.6 CbuDELLAs在不同組織部位的特異性表達(dá)

以9-1楸和‘百日花’楸不同組織部位的cDNA為模板，檢測CbuDELLAs基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，CbuDELLAs主要在頂芽和幼葉中表達(dá)，在莖和韌皮部中表達(dá)量較低。CbuGRAS9在9-1 中整體表達(dá)量最高，CbuGRAS32次之，CbuGRAS2表達(dá)量整體最低（見圖5A）。而在‘百日花’楸中，除了木質(zhì)部之外CbuGRAS9在各個(gè)組織部位表達(dá)量都最高，CbuGRAS32整體表達(dá)量高于CbuGRAS22，Cbu-GRAS2表達(dá)量最低（見圖5B）。其中，CbuGRAS9在‘百日花’楸和9-1楸頂芽中的表達(dá)量差異最大，其在‘百日花’楸中的表達(dá)量比在9-1 楸中高達(dá)26倍，由此推測CbuGRAS9基因可能在‘百日花’楸早花中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖5 組織特異性表達(dá)分析A.CbuDELLAs 在‘9-1’楸不同組織中表達(dá)分析；B.CbuDELLAs 基因在‘百日花’楸不同組織中表達(dá)分析；*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。Fig.5 Tissue-specific expression analysis of CbuDELLAs A.Expression analysis of CbuDELLAs among different tissues in Catalpa bungei‘ Luoqiu No.1’；B.Expression analysis of CbuDELLAs among different tissues in Catalpa‘ Bairihua’；* represented P value was less than 0.05，** represented P value was less than 0.01，*** represented P value was less than 0.001.

2.7 pROK??-CbuGRAS9 轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定及功能分析

將CbuGRAS9構(gòu)建至pROK 載體并轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，使用浸花法侵染擬南芥，創(chuàng)制由35S 啟動子驅(qū)動的過表達(dá)擬南芥植株。以T3 代擬南芥DNA 進(jìn)行PCR 鑒定，電泳檢測結(jié)果顯示DNA 條帶與目標(biāo)序列條帶大小一致，證明目的載體成功轉(zhuǎn)入擬南芥（見圖6C）。表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的開花時(shí)間明顯被推遲，且轉(zhuǎn)基因株系的葉片大小、株高等指標(biāo)也明顯受到抑制（見圖6A～B）。選取最顯著的3 個(gè)株系進(jìn)行qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中CbuGRAS9基因表達(dá)量顯著提高（見圖6D）。以上結(jié)果表明，CbuGRAS9基因參與介導(dǎo)植物的開花過程。

圖6 CbuGRAS9基因異源轉(zhuǎn)化表型觀察及表達(dá)模式分析A～B.左側(cè)為野生型擬南芥，右側(cè)為過表達(dá)CbuGRAS9轉(zhuǎn)基因擬南芥。陽性鑒定后，選取3株分別取葉片進(jìn)行qRT-PCR分析；C.轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA 水平檢測；M.DL5000 DNA Marke（r1～6.轉(zhuǎn)基因株系PCR 產(chǎn)物；7.陽性對照；8.野生型擬南芥；9.ddH2O 作為陰性對照）；D.轉(zhuǎn)基因擬南芥qRT-PCR檢測（WT.野生型擬南芥株系；L1～L3.轉(zhuǎn)基因擬南芥株系）；***P<0.001。Fig.6 Phenotype observation and expression pattern analysis of heterologus transformation of CbuGRAS9 A-B.The left side of wild-type Arabidopsis thaliana，the right side over-expression of CbuGRAS9 Arabidopsis thaliana.After positive identification，three strains were selected and leaves were taken for qRT-PCR analysis；C.Detection of transgenic Arabidopsis DNA leve（lM.DL5000 DNA Marker；1-6.PCR products of transgenic lines；7.Positive control；8.Wild type Arabidopsis thalianas；9.ddH2O as a negative control）；D.qRT-PCR detection of transgenic Arabidopsis thaliana（WT.Wild-type Arabidopsis thaliana；L1-L3.Transgenic Arabidopsis thaliana）；*** represented P value was less than 0.001.

2.8 CbuGRAS9蛋白亞細(xì)胞定位

使用Plant-mPloc 在線網(wǎng)站對CbuGRAS9 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞核。為了驗(yàn)證這一預(yù)測，構(gòu)建pGWB405-35S：：CbuGRAS9-GFP載體，將構(gòu)建的載體及空載分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至煙草葉片中，通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光信號觀察，證實(shí)CbuGRAS9是核定位蛋白（見圖7A）。

圖7 CbuGRAS9亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性分析A.35S：：CbuGRAS9-GFP；CbuGRAS9與GFP的融合載體；B.CbuGRAS9轉(zhuǎn)錄激活活性分析。Fig.7 Sub-cellular localization and transcriptional activation activity of CbuGRAS9 A.35S：：CbuGRAS9-GFP；fusion vector of CbuGRAS9 and GFP；B.Transcriptional activation activity of CbuGRAS9.

2.9 篩選與CbuGRAS9互作的蛋白

為揭示CbuGRAS9 蛋白介導(dǎo)楸樹早花的分子機(jī)制，是否通過結(jié)合蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使用楸樹酵母文庫篩選可能與CbuGRAS9 互作的蛋白質(zhì)，利用高通量測序進(jìn)一步分析互作蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程與分子功能。

將構(gòu)建好的pGBKT7-CbuGRAS9載體轉(zhuǎn)入Y2HGold 酵母菌液中，在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His（QDO）培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)72 h，pGBKT7-Cbu-GRAS9酵母菌落生長正常，說明CbuGRAS9蛋白存在轉(zhuǎn)錄激活活性且無毒性；將CbuGRAS9 蛋白分為4段分別構(gòu)建至pGBKT7載體中并轉(zhuǎn)入Y2HGold中，在QDO 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果表明CbuGRAS91-552區(qū)間存在轉(zhuǎn)錄激活活性且無毒性（見圖7B）。

將CbuGRAS9基因無轉(zhuǎn)錄激活活性（553～1 662 bp）的片段構(gòu)建至pGBKT7載體中，與實(shí)驗(yàn)室保存的楸樹cDNA 核蛋白二代文庫進(jìn)行雜交，在QDO 培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選；每10～15 個(gè)單菌落混合后進(jìn)行PCR 鑒定，電泳結(jié)果顯示每個(gè)混合樣品均有條帶且大小有明顯差異，證明與文庫互作成功（見本刊網(wǎng)站電子附圖1）。將所有的PCR 產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行高通量測序，共篩選到2 392 個(gè)蛋白，其中包含103 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（見本刊網(wǎng)站電子附件2）。將篩選到的全部基因進(jìn)行基因本體論（GO）分析，結(jié)果顯示在生物學(xué)過程分類中，代謝、細(xì)胞和單個(gè)組織進(jìn)程的條目被明顯富集；在細(xì)胞組學(xué)分類中，主要富集在細(xì)胞組分；在分子功能分類中，結(jié)合和催化活性條目被明顯富集（見圖8A）。KEGG 富集分析結(jié)果，與CbuGRAS9 互作的蛋白主要在核糖體、氨基酸合成、次級代謝、光合作用、TCA循環(huán)等代謝通路（見圖8B）。

圖8 GO富集及KEGG Pathway富集分析Fig.8 GO enrichment and KEGG Pathway enrichment analysis

3 討論

通過生物信息學(xué)分析，在楸樹中獲得的5 個(gè)CbuDELLAs氨基酸數(shù)目為455～588，相對分子質(zhì)量5.04～6.43 kDa，等電點(diǎn)4.81～5.14；CbuDELLAs蛋白均含有DELLA 和GRAS 保守結(jié)構(gòu)域，全部為親水性蛋白且可能是不參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示CbuDELLAs 蛋白均定位于細(xì)胞核中，這與水曲柳（Fraxinus mandshurica）、煙草和葡萄（Vitis vinifera）等物種中同源蛋白的亞細(xì)胞定位類似［33-35］。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，再次證實(shí)了楸樹中的CbuGRAS9 蛋白是核定位蛋白。CbuDELLAs基因的啟動子上含有光響應(yīng)作用元件和激素誘導(dǎo)元件（參與赤霉素反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件和參與脫落酸反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件），表明楸樹中的CbuDELLAs可能參與光信號和赤霉素信號調(diào)控，進(jìn)而可能通過赤霉素途徑參與早開花過程［36-37］。

根據(jù)CbuDELLAs在‘百日花’楸與9-1 楸不同組織部位的相對表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，CbuDELLAs基因在楸樹頂芽和幼葉中表達(dá)；在‘百日花’楸中CbuDELLAs基因表達(dá)量高于對照9-1 楸，其中，CbuGRAS9在‘百日花’楸中的表達(dá)量最高。將CbuGRAS9在擬南芥中異源過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出了開花時(shí)間延遲等表型。在擬南芥中，根據(jù)DELLA 結(jié)構(gòu)域和保守的GRAS 結(jié)構(gòu)域的特征區(qū)分了五類DELLA 蛋白，分別為GAI、RGA、RGL1、RGL2 和RGL3。GAI 和RGA 的功能喪失完全抑制了ga1-3突變體（嚴(yán)重的GA 缺陷突變體ga1-3）的矮化表型，表明GAI 和RGA 參與抑制莖的伸長［38-39］。在花的發(fā)育過程中，RGA、RGL1 和RGL2發(fā)揮了共同調(diào)節(jié)的作用。ga1-3突變體的雄性不育表型可通過RGA、RGL1 和RGL2 的功能缺失突變的組合來抑制。RGL2 抑制種子發(fā)芽，在GAI 和RGA 的 作 用 下 其 抑 制 功 能 得 到 加 強(qiáng)［40-43］。CbuDELLAs 蛋白在GA 信號通路中顯示出重疊且一些不同的功能可能對GA 介導(dǎo)的整個(gè)植物發(fā)育過程提供負(fù)調(diào)控作用［44-45］。梨樹（Pyrus sorotina）中得到了4 個(gè)DELLA基因，這些DELLA基因?qū)χ参锏纳L有抑制效應(yīng)且功能相似，而其中PbDELLA2基因發(fā)揮了最強(qiáng)的抑制作用，對植物的生長發(fā)育調(diào)控最重要［46］。不同的DELLA 蛋白發(fā)揮的功能可能重疊或不同，不同物種間的DELLA 蛋白可能發(fā)揮相似或不同的功能。

目前高通量測序成為分子生物學(xué)不可或缺的手段，助力于進(jìn)一步解析目的蛋白介導(dǎo)細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制。酵母互作文庫篩選到的2 392 個(gè)與CbuGRAS9 互作的蛋白，這些蛋白主要在核糖體、氨基酸合成、次級代謝、光合作用、TCA循環(huán)等代謝通路。篩選出的2 392 個(gè)蛋白中共有104 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，包含開花調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SPL、MYB 和NF-YC 等。已有相關(guān)研究表明，擬南芥中SPL 轉(zhuǎn)錄因子與赤霉素信號途徑中的DELLA蛋白相互作用，調(diào)控下游基因SOC1和miR172 等，進(jìn)而影響植物開花［43］。在陸地棉（Gossypium hirsutum）中，過表達(dá)GhMYB44a和GhMYB44b都促進(jìn)了擬南芥早開花；水稻（Oryza sativa）MYB21-like基因Os01g45090和Os05g49310參與調(diào)控水稻開花［47-48］。在擬南芥中過表達(dá)陸地棉的GhNFYC4導(dǎo)致擬南芥提前開花，表明轉(zhuǎn)錄因子NF-YC 可能參與調(diào)控早花［49］。楸樹中CbuGRAS9 蛋白是否能與開花相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CbuSPL9、MYB 和NF-YC 發(fā)生互作，直接或間接調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，從而影響楸樹的花期有待進(jìn)一步驗(yàn)證。