韓 雍,馬艷鑫,汪 慧,王 雅
(1.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院,甘肅 慶陽(yáng) 745000;2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730050)
重金屬離子污染對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了嚴(yán)重影響。銀(Ag)是一種天然重金屬,主要以游離態(tài)存在于含銀礦石中,廣泛應(yīng)用于化學(xué)、化學(xué)工程、攝影、珠寶、醫(yī)藥和電子電氣設(shè)備等領(lǐng)域[1]。因銀和銀基化合物在工業(yè)和日常生活中的廣泛使用而產(chǎn)生的大量銀離子(Ag+)廢液,加劇了環(huán)境污染。在生態(tài)系統(tǒng)中,Ag+通過(guò)食物鏈或直接通過(guò)飲用水進(jìn)入人體,進(jìn)而在人體內(nèi)聚積,并導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問(wèn)題[2-3]。銀可破壞酶的活性并與各種代謝物結(jié)合,最終導(dǎo)致細(xì)胞毒性、器官衰竭和線粒體功能下降,其在人體內(nèi)的蓄積可能會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的負(fù)面影響[4-5]。現(xiàn)有Ag+的檢測(cè)方法,如電化學(xué)法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子吸收光譜法、中子活化分析法和X 射線熒光法等[6-7],存在操作復(fù)雜、靈敏度低、成本高、對(duì)儀器設(shè)備精度和操作人員專業(yè)性要求高等局限。因此,開發(fā)高靈敏、高效便捷的分析方法準(zhǔn)確檢測(cè)Ag+,對(duì)監(jiān)測(cè)重金屬污染,保障人體健康具有重要意義。
光譜檢測(cè)法具有便捷高效的優(yōu)勢(shì),以半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)為基礎(chǔ)的熒光檢測(cè)方法顯示出良好的應(yīng)用前景。碳點(diǎn)(CDs)作為一種新型有機(jī)量子熒光材料,因具有綠色合成、毒性低、生物相容性和水溶性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)越性能而得到廣泛關(guān)注,是傳統(tǒng)有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)的替代物之一[8]。CDs憑借優(yōu)良的熒光性質(zhì),在生物成像[9]、分析檢測(cè)[10]、催化[11]、納米醫(yī)學(xué)[12]、光電設(shè)備[13]等方面廣泛應(yīng)用。由于檢測(cè)體系因素復(fù)雜,單發(fā)射CDs 熒光較難實(shí)現(xiàn)滿意檢測(cè),而具有自校準(zhǔn)特性的比率熒光探針因?qū)崟r(shí)響應(yīng)快、分辨率高、靈敏度高、具有較強(qiáng)的干擾能力而得到廣泛關(guān)注[14]。比率熒光探針是利用同一激發(fā)波長(zhǎng)下兩個(gè)熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度比進(jìn)行檢測(cè),可以限制內(nèi)置背景干擾,提高信噪比,進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性[15]。大多數(shù)用于Ag+檢測(cè)的熒光響應(yīng)均基于單一的熒光探針,易受傳感器濃度變化、光源或檢測(cè)器漂移及復(fù)雜樣品中的環(huán)境等因素的影響[16],而比率熒光傳感器可以避免這些問(wèn)題。因此構(gòu)建一種性能優(yōu)異的比率熒光傳感器,并結(jié)合一些便攜設(shè)備用于環(huán)境水樣中Ag+的定量和可視化半定量檢測(cè)具有重大意義。
本工作構(gòu)建了一種用于Ag+檢測(cè)的簡(jiǎn)便、快速、靈敏、便攜和可靠的可視化比率熒光傳感器。首先通過(guò)水熱法分別以檸檬酸、L-半胱氨酸(L-Cys)和鄰苯二胺(OPD)為前體合成了藍(lán)光碳點(diǎn)(B-CDs)和黃光碳點(diǎn)(Y-CDs),隨后通過(guò)雜化使其形成雙碳點(diǎn)(d-CDs)。d-CDs 的熒光光譜在370 nm 下激發(fā)時(shí)產(chǎn)生420 nm 和560 nm 兩處發(fā)射峰,向該d-CDs 傳感器加入Ag+時(shí)分別能夠引起這兩處發(fā)射波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度的減弱和增強(qiáng),為實(shí)現(xiàn)可視化半定量檢測(cè)環(huán)境水樣中Ag+的殘留量提供了理論依據(jù)。通過(guò)對(duì)d-CDs 的形貌、官能團(tuán)和光學(xué)特性進(jìn)行表征,分析了d-CDs對(duì)Ag+的熒光響應(yīng)機(jī)制。并考察了d-CDs在環(huán)境水樣中對(duì)Ag+的檢測(cè)能力。
檸檬酸、L-半胱氨酸(L-Cys)、鄰苯二胺(OPD)(上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司);硝酸銀(AgNO3)、氯化鉀(KCl)、硫酸銅(CuSO4)、硫酸鐵(Fe2(SO4)3)、硫酸亞鐵(FeSO4)、氯化鈷(CoCl2)、硫酸鉛(PbSO4)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鎂(MgSO4)、硝酸鋁(Al(NO3)3)、硫酸鋅(ZnSO4)、氯化鈉(NaCl)(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司);乙醇、甲醇、丙酮、硼酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);磷酸(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司);冰乙酸、氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠);二氯甲烷(上海麥克林生化科技股份有限公司);石油醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);三氯甲烷(白銀良友化學(xué)試劑有限公司)。以上試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
Talos F200S 透射電子顯微鏡(TEM,美國(guó)FEI 公司);UV2300II 紫外-可見分光光度計(jì)(UV-Vis,上海天美科學(xué)儀器有限公司);D8 X 射線衍射儀(XRD,德國(guó)Bruker AXS 公司);ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜(XPS)、Nicolet iS20 傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)(美國(guó)Thermo Scientific 公司);F97pro 熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司);ST2100 pH計(jì)(常州奧豪斯儀器有限公司);KH5200DE超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)和H1850離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。
參考文獻(xiàn)方法制備藍(lán)光碳點(diǎn)(B-CDs)[17]:稱取1 g 檸檬酸和0.5 gL-Cys 于40 mL 超純水中混合,超聲使其完全溶解。將均質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到50 mL 的四氟乙烯襯里反應(yīng)器中,于180 ℃下反應(yīng)2 h。室溫自然冷卻后,8 000 r/min 下離心15 min,將所得上清液用0.22 μm 微濾膜過(guò)濾,得到淺黃色B-CDs 溶液,于4 ℃條件下儲(chǔ)存,備用。
黃光碳點(diǎn)(Y-CDs)的合成參考文獻(xiàn)[18]并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn):將1 g OPD 溶于40 mL超純水中,超聲分散均勻。隨后將溶液置入高壓反應(yīng)釜中,于180 ℃下反應(yīng)4 h。冷卻至室溫后,8 000 r/min 下離心15 min除去沉淀物,用0.22 μm微濾膜過(guò)濾,濾液于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
將制備的B-CDs 與Y-CDs 分別稀釋500 倍和10 倍后按溶液體積比3∶1 的比例混合形成雙碳點(diǎn)(d-CDs),該d-CDs 的熒光光譜在370 nm 下激發(fā)時(shí)產(chǎn)生560 nm 和420 nm 兩處發(fā)射峰,此時(shí)熒光強(qiáng)度的比值為IF560∶IF420=1.8∶1。在2 mL pH 7.0 的Britton-Robinson(BR)緩沖液體系中,添加1 mL 不同濃度的Ag+標(biāo)準(zhǔn)溶液與1 mL 的d-CDs,室溫孵育45 min 后,于370 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光測(cè)量并記錄B-CDs和Y-CDs的熒光強(qiáng)度(分別為IF420和IF560)。以Ag+標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度濃度為橫坐標(biāo),d-CDs的熒光比率IF560/IF420為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限(LOD)由LOD=3ε/σ(ε與σ分別代表空白信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n>6)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)進(jìn)行計(jì)算。所有測(cè)量均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。
為研究該傳感器對(duì)其他金屬離子的抗干擾能力,分別向傳感器溶液中加入干擾離子Al3+、Co2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+、Pb2+和Zn2+,并記錄熒光強(qiáng)度比值IF560/IF420的變化。
為了評(píng)估比率熒光傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的可行性和實(shí)用性,選擇湖水、自來(lái)水和礦泉水作為實(shí)際樣品,經(jīng)過(guò)濾凈化后,向?qū)嶋H樣品中分別加入不同濃度的Ag+標(biāo)準(zhǔn)溶液并測(cè)量相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。
采用TEM 對(duì)所合成的雙碳點(diǎn)d-CDs進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)研究,圖1A、B分別為d-CDs的TEM 圖像和粒徑分布圖。由圖1A 可知,d-CDs 呈球形,分散性好且分布均勻。圖1B 所示的粒徑范圍為0.63~3.52 nm,平均粒徑為2.14 nm。通過(guò)FTIR研究d-CDs的官能團(tuán)結(jié)構(gòu),由圖1C分析可知,這些特征峰分別由O—H 的伸縮振動(dòng)(3 368~3 204 cm-1),2 920、614 cm-1處C—H 的伸縮振動(dòng),2 585 cm-1處—SH,1 703、1 385 cm-1處C=O 的非對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng),1 497 cm-1處C—N 的彎曲振動(dòng),1 555 cm-1處苯環(huán)C=C的骨架振動(dòng),1 197 cm-1處C—O 的伸縮振動(dòng),829 cm-1處—NH2和743 cm-1處C—S 的拉伸振動(dòng)所引起。上述結(jié)果表明d-CDs 中存在芳香族化合物的結(jié)構(gòu)及親水性基團(tuán)。圖1D 為d-CDs 的XRD 圖像,其在23.56°處出現(xiàn)較寬的衍射峰,說(shuō)明d-CDs 具有無(wú)定形結(jié)構(gòu)。另外出現(xiàn)的雜峰表明合成的碳點(diǎn)可能摻雜了其他雜質(zhì)。
圖1 d-CDs的TEM圖像(A)、粒徑分布圖(B)、紅外譜圖(C)及XRD譜圖(D)Fig.1 TEM image(A),diameter size distribution curve(B),F(xiàn)TIR spectrum(C),XRD pattern(D) of d-CDs
通過(guò)XPS 進(jìn)一步對(duì)d-CDs 的元素進(jìn)行分析,圖2A 中以291.4、405.31、540.59 eV 為代表的特征峰,分別對(duì)應(yīng)C、N 和O 三種元素。其中C1s 的高分辨光譜(圖2B)中顯示有3 個(gè)鍵 C—C/C=C(284.8 eV)、C—N/C—S(286.0 eV)和O—C=O(288.7 eV);N1s的高分辨光譜(圖2C)中顯示兩種不同化學(xué)態(tài)的N,吡啶N(399.1 eV)和吡咯N(400.4 eV);O1s 的高分辨光譜(圖2D)中顯示兩個(gè)O—C 鍵:C—O(531. 7 eV)、O—C(531. 9 eV)和一個(gè)C=O 鍵(533. 1 eV)。通過(guò)XPS 未能檢測(cè)出—SH,分析可能是—SH被氧化所致。XPS和FTIR圖譜結(jié)果說(shuō)明所合成的d-CDs含有巰基和芳香環(huán)結(jié)構(gòu),另外大量羥基和羧基的存在使得d-CDs具有較好的水溶性。
圖2 d-CDs的XPS圖譜Fig.2 XPS spectra of d-CDs
Ag+的紫外吸收光譜和d-CDs的熒光光譜圖如圖3A所示。由圖可知,Ag+在220 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰。另外在370 nm波長(zhǎng)激發(fā)下,d-CDs分別在420 nm和560 nm處產(chǎn)生兩個(gè)發(fā)射峰。d-CDs溶液在日光燈下呈淡黃色,在紫外燈照射下發(fā)藍(lán)色熒光(圖3A 插圖)。圖3B 為d-CDs 在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜,激發(fā)波長(zhǎng)在350~380 nm 范圍內(nèi)變化時(shí),420 nm 和560 nm 處的熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大分別呈現(xiàn)下降和增加的趨勢(shì),但發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生位移。為更好地實(shí)現(xiàn)Ag+的可視化比率熒光檢測(cè),選擇370 nm作為最適激發(fā)波長(zhǎng)。
圖3 Ag+的紫外吸收光譜圖和 d-CDs的熒光光譜圖(A)及d-CDs 在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜(B)Fig.3 Absorbance spectrum of Ag+ and fluorescence spectrum of d-CDs(A) and fluorescent spectra of d-CDs excited at varying wavelengths(B)
為了提高所構(gòu)建的d-CDs 比率熒光傳感器檢測(cè)Ag+的靈敏度,對(duì)pH 值、反應(yīng)溫度和孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。
考察了不同pH 值(4.0~10.0)的BR 溶液對(duì)Ag+加入前后d-CDs 傳感器體系的影響。如圖4A 所示,在未加入Ag+時(shí),pH 值的變化對(duì)熒光強(qiáng)度比值IF560/IF420幾乎無(wú)影響。加入Ag+并混勻孵育一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn),pH 4.0~6.0 范圍即酸性環(huán)境下,IF560/IF420先大幅度增加后趨于緩慢增加;在pH 6.0~7.0 范圍內(nèi),IF560/IF420顯著增加,并在pH 7.0 處達(dá)到最大熒光強(qiáng)度值,此時(shí)熒光強(qiáng)度具有較好的穩(wěn)定性,故選擇pH 7.0作為體系的最適pH值用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖4 檢測(cè)條件的優(yōu)化Fig.4 Optimizations of testing conditions
優(yōu)化了d-CDs傳感器檢測(cè)Ag+的溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)和孵育時(shí)間(0~85 min)。結(jié)果顯示,溫度對(duì)于熒光強(qiáng)度的影響不明顯(圖4B)。選擇0~85 min的孵育時(shí)間進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4C 所示,加入Ag+后,傳感器的IF560/IF420在0~45 min 之間急劇增加,45 min 后緩慢增加。表明起初隨著Ag+的加入,Ag+能夠快速與d-CDs傳感器體系表面的官能團(tuán)結(jié)合,使熒光強(qiáng)度比值IF560/IF420增加,隨著Ag+與d-CDs 傳感器體系的逐漸接觸,d-CDs 傳感器對(duì)Ag+的檢測(cè)能力下降,導(dǎo)致IF560/IF420增加緩慢并趨于穩(wěn)定。因此分別選擇室溫和45 min作為最適反應(yīng)溫度和孵育時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
為了探究該傳感器檢測(cè)Ag+的靈敏度,在最佳檢測(cè)條件下向所構(gòu)建的d-CDs比率熒光傳感器中加入不同濃度的Ag+(0~40 μmol/L),分析其響應(yīng)程度。結(jié)果如圖5 所示,隨著Ag+濃度的逐漸增加,體系在420 nm 處的熒光強(qiáng)度減弱,而在560 nm 處的熒光增強(qiáng),熒光強(qiáng)度比值IF560/IF420與Ag+的濃度在0~40μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y=0.004 04x+0.610 37,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 7。由LOD=3ε/σ計(jì)算得到LOD為1.26 μmol/L。另外通過(guò)紫外燈照射,可以實(shí)現(xiàn)Ag+的可視化半定量檢測(cè)(圖5 插圖)。與其他已報(bào)道的檢測(cè)方法相比[19-23](表1),本方法的LOD 并非最低,但本文所使用的碳點(diǎn)合成方法具有工藝簡(jiǎn)單、原料低廉和操作方便等優(yōu)勢(shì),且可通過(guò)紫外燈照射實(shí)現(xiàn)Ag+的可視化半定量測(cè)定。
表1 不同熒光傳感器檢測(cè)銀離子對(duì)比Table 1 Comparison of different fluorescence sensors for Ag+ detection
圖5 d-CDs在不同濃度Ag+(0~40 μmol/L)中的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of d-CDs at different concentrations of Ag+(0-40 μmol/L)
為了評(píng)估本研究所構(gòu)建的d-CDs比率熒光傳感檢測(cè)方法的特異性,以濃度為1 mmol/L 的其他干擾離子Al3+、Co2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mg2+、Na+、Pb2+、Zn2+進(jìn)行選擇性評(píng)價(jià)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,向體系中加入1 mL 10 μmol/L Ag+和上述干擾離子,孵育45 min。結(jié)果如圖6 所示,在高倍濃度(100 倍)干擾離子存在時(shí),該傳感器對(duì)干擾離子幾乎無(wú)響應(yīng),而對(duì)Ag+響應(yīng)較明顯,表現(xiàn)出良好的選擇性。
圖6 d-CDs對(duì)不同離子的響應(yīng)情況Fig.6 Response of d-CDs to different metal ions
FTIR 和XPS 分析結(jié)果表明,d-CDs 表面含有巰基基團(tuán)、芳香環(huán)結(jié)構(gòu)以及大量的羥基和羧基,金屬離子能夠與這些官能團(tuán)結(jié)合形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)而引起d-CDs 溶液的熒光猝滅。結(jié)合Ag+的紫外吸收峰與d-CDs的熒光光譜圖進(jìn)行分析,推斷熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和內(nèi)濾作用(IFE)不是d-CDs識(shí)別Ag+的主要原因。在370 nm 激發(fā)下,體系中加入Ag+會(huì)引起d-CDs在420 nm 和560 nm 處的發(fā)射峰強(qiáng)度分別減弱和增強(qiáng),表明Ag+在不同發(fā)射峰處的響應(yīng)機(jī)理不同。Ag+能與d-CDs 表面含有的羥基、羧基發(fā)生官能團(tuán)配位形成d-CDs/Ag+復(fù)合物,可能通過(guò)光致能量轉(zhuǎn)移(PET)猝滅d-CDs在420 nm 處的熒光發(fā)射,但560 nm 處的黃色熒光主要依賴于碳核發(fā)光,金屬離子對(duì)其影響較弱,故PET對(duì)黃色熒光發(fā)射無(wú)明顯影響[24]。隨著Ag+濃度的增大,d-CDs 溶液在365 nm 紫外燈下顯示出由藍(lán)色至黃色的變化,并觀察到溶液中產(chǎn)生絮凝物,推測(cè)是由于Ag+與d-CDs 表面的巰基結(jié)合導(dǎo)致碳點(diǎn)表面能量陷阱大量缺失,引起熒光猝滅;而Ag+對(duì)碳核560 nm 處的黃色熒光影響不明顯,故隨著藍(lán)色熒光的減弱,體系發(fā)光由黃色熒光主導(dǎo),熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)。由現(xiàn)有反應(yīng)機(jī)理推測(cè),該體系主要表現(xiàn)出420 nm 處的藍(lán)色熒光和560 nm 處的黃色熒光競(jìng)爭(zhēng)發(fā)射的情況,在碳點(diǎn)比率熒光檢測(cè)金屬離子的應(yīng)用方面具有一定的實(shí)踐意義。
選擇湖水、自來(lái)水和礦泉水作為實(shí)際樣品,經(jīng)離心過(guò)濾處理后,進(jìn)行3 個(gè)不同濃度(0、5、10μmol/L)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2 所示。實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為98.2%~105%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.49%~3.8%。結(jié)果表明該d-CDs比率熒光傳感器能夠可靠、有效地檢測(cè)實(shí)際樣品中的Ag+。
表2 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率Table 2 Spiked recoveries of real samples
本研究通過(guò)將B-CDs 與Y-CDs 雜化形成d-CDs,構(gòu)建了一種特異性識(shí)別Ag+的可視化比率熒光傳感器。通過(guò)對(duì)d-CDs 進(jìn)行表征和光學(xué)特性分析,研究了其對(duì)Ag+的響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明,Ag+能與d-CDs 表面官能團(tuán)發(fā)生配位形成d-CDs/Ag+復(fù)合物,推測(cè)可能是碳點(diǎn)表面官能團(tuán)與金屬離子絡(luò)合產(chǎn)生的PET 猝滅了體系的藍(lán)色熒光。另外Ag+能夠與d-CDs 中的巰基結(jié)合產(chǎn)生絮凝物,隨著藍(lán)色熒光的減弱,體系呈現(xiàn)出黃色熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。將d-CDs 傳感器應(yīng)用于環(huán)境水樣的檢測(cè),加標(biāo)回收率為98.2%~105%,方法檢出限為1.26 μmol/L。同時(shí)通過(guò)紫外燈照射可肉眼直觀半定量檢測(cè)Ag+。以上結(jié)果證實(shí)了所構(gòu)建的可視化比率熒光傳感器檢測(cè)環(huán)境水樣中Ag+的可靠性與實(shí)用性。本探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、靈敏度高、可靠性強(qiáng),在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和資源匱乏地區(qū)水質(zhì)檢測(cè)中具有較大的應(yīng)用前景,并為未來(lái)紙基傳感器的研究提供了一定的理論依據(jù)。