基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定不同加工方式丹參的化學(xué)成分

范佳麗，紀(jì)文華，王 曉，郭蘭萍，李麗麗*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院） 山東省分析測(cè)試中心 山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100007；3.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院） 藥學(xué)院 山東省高等學(xué)校天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014）

丹參是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge. 的干燥根和根莖，是常用的大宗中藥材之一。據(jù)［1-2］2020年版《中國(guó)藥典》記載，丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰等功效，用于胸痹心痛、膠腹脅痛、癥痕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛［3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參在治療心血管疾病［4-5］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］、消化系統(tǒng)疾?。?］、慢性腎?。?］等方面療效顯著，應(yīng)用廣泛。

近年來，丹參藥材的需求量持續(xù)增加。丹參藥材大多采用人工栽培，干燥后切片使用。按照加工方法不同，丹參切片可分為干切片和鮮切片兩大類。傳統(tǒng)切片往往是將丹參干燥后，水洗潤(rùn)軟切片，悶潤(rùn)過程中可能會(huì)導(dǎo)致有效成分的損失［9-10］。丹參趁鮮加工是先切片后干燥，干燥方式會(huì)影響其成分含量［11］。丹參加工方法的研究已有一些報(bào)道，以往研究往往只關(guān)注丹參中幾種成分。趙志剛等［12］通過測(cè)定迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 的含量，對(duì)整體和切斷加工的丹參質(zhì)量進(jìn)行了比較分析。張雪梅等［13］基于丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量，研究了丹參趁鮮加工與傳統(tǒng)加工對(duì)其飲片質(zhì)量的影響。王小平等［14］對(duì)不同加工方式丹參中的丹參酮ⅡA、丹酚酸B和丹參素進(jìn)行了研究，指出不同加工方式對(duì)丹參品質(zhì)有重要影響，其成片率、有效成分含量有顯著性差異。

植物中含有豐富的化學(xué)成分，基于在植物中的功能不同，可分為初生代謝物和次生代謝物。初生代謝物為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)和能量，次生代謝物是植物抵抗外來脅迫（抗病、抗逆）的關(guān)鍵成分［15-16］。液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（LC-HRMS）法，由于具有高靈敏、高通量等優(yōu)點(diǎn)，在植物化學(xué)成分分析，特別是農(nóng)產(chǎn)品加工研究中應(yīng)用廣泛［17-19］。本研究基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)丹參進(jìn)行化學(xué)成分分析，首先對(duì)丹參中的初生代謝物和次生代謝物進(jìn)行定性分析，然后探究不同切片加工方法下丹參中初生和次生代謝物成分的變化趨勢(shì)，探究切片加工方法對(duì)丹參品質(zhì)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)Merck 公司）；甲酸（色譜級(jí)，德國(guó)Honeywell Fluka 公司）；超純水由Millipore Direct-Q8UV-R 超純水系統(tǒng)（美國(guó)）制備。超高效液相色譜儀（ACQUITY，H-Class，美國(guó)沃特世公司），飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Q-TOF MS，ImpactⅡ，德國(guó)布魯克公司），快速水分測(cè)定儀（ATXY-101，濰坊中特電子儀器有限公司）。渦旋振蕩器（Vortex-Genie 2，美國(guó)Scientific Industries 公司）。標(biāo)準(zhǔn)品：丹參酮Ⅰ購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、咖啡酸、色氨酸、苯丙氨酸、檸檬酸、脯氨酸購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。

1.2 樣品信息

丹參采自濟(jì)南市萊蕪區(qū)苗山鎮(zhèn)丹參種植基地，經(jīng)山東省分析測(cè)試中心王曉研究員鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.。分別制備丹參鮮切片和干切片：鮮切后分別進(jìn)行曬干和烘干干燥處理；干切分為全干切片和傳統(tǒng)切片。將采收的整支丹參除去雜質(zhì)和殘莖，分成四組進(jìn)行處理。丹參鮮切片曬干樣品（X-S）：將新鮮丹參切成2～3 mm的厚片后曬干（8 h）。丹參鮮切片烘干樣品（X-H）：將新鮮丹參切成2～3 mm 的厚片后，放入烘箱中烘干（60 ℃，3 h）。全干切片樣品（G-Q）：將丹參整支曬干至輕折可斷（8 d），噴灑微量水使丹參表面稍潤(rùn)后切成2～3 mm 的厚片，曬干。傳統(tǒng)切片樣品（G-C）：將丹參整支曬干至輕折可斷（8 d），分多次將少量水噴灑在丹參上，翻動(dòng)使水分緩緩浸入丹參中而不使水分流失，切成2～3 mm厚片，曬干。測(cè)試4種樣品的含水量均不大于13%，符合2020版藥典要求。

1.3 樣品制備

將不同處理丹參樣品粉碎成粉末，過篩（藥典三號(hào)篩）。準(zhǔn)確稱取100 mg 樣品于2 mL Eppendorf 管中，加入1.5 mL 甲醇/水溶劑（3∶1，體積比）［20］，使用渦旋振蕩器渦旋2 min （3 000 r/min），離心15 min，取上清液。每個(gè)樣品平行6份。取不同處理丹參樣品粉末各1 g，混合均勻，制備質(zhì)控（QC）樣品。

1.4 LC-MS分析條件

色譜柱為Agilent SB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent 公司），流速為0.3 mL/min，柱溫35 ℃。流動(dòng)相A 和B 分別為0.1 %甲酸水溶液和乙腈溶液。洗脫梯度如下：0～2 min，5% B；2～3 min，5%～30% B；3～8 min，30% B；8～9 min，30%～40% B；9～18 min，40%～46% B；18～28 min，46%～54% B；28～43 min，54%～85% B；43～45 min，85%～100% B；45～50 min，100% B；50～55 min，100%～5% B?？倳r(shí)間為55 min。

質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓分別為3 500 V（正離子模式）和3 000 V（負(fù)離子模式）；干燥氣溫度為200 ℃；干燥氣體流速為8 L/min；霧化氣壓力為200 kPa；碰撞池射頻電壓振幅為750 Vpp；脈沖前等待時(shí)間為5 μs；傳輸時(shí)間為60 μs；碰撞能量為7 eV；質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z為50～1 500；二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)碰撞能為10～50 eV。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將采集得到的LC-MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入MS-DIAL軟件進(jìn)行峰識(shí)別、峰匹配、峰對(duì)齊等處理，得到包含質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間和峰面積的表格?；诓煌瑯悠返姆迕娣e值進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。使用SIMCA 軟件（瑞典）進(jìn)行主成分（PCA）分析；由SPSS軟件（美國(guó)）進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)；由MEV軟件（美國(guó)）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 丹參代謝物定性分析

基于質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)［21-26］，對(duì)丹參中的初生代謝物和次生代謝物進(jìn)行定性分析。丹參在正離子模式和負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。在丹參樣品中共鑒定出44種化合物（表1），包括27種初生代謝物和17種次生代謝物。初生代謝物包括7種氨基酸類、13種脂肪酸類、5種有機(jī)酸類和2種核苷類，次生代謝物包括5種丹酚酸類和12種丹參酮類。

表1 丹參中定性的代謝物Table 1 The identified metabolites in Salvia miltiorrhiza Bge.

圖1 丹參在正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Salvia miltiorrhiza Bge. in the positive ion（A） and negative ion（B） modes

2.2 方法學(xué)考察

使用QC樣品考察方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。制備5個(gè)QC樣品，每間隔6 h采樣1次。計(jì)算5個(gè)QC樣品中每個(gè)峰對(duì)應(yīng)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），統(tǒng)計(jì)不同RSD 范圍（0～10%、10%～20%、20%～30%、＞30%）內(nèi)的峰個(gè)數(shù)，以及相應(yīng)的峰面積之和。計(jì)算不同RSD 范圍內(nèi)峰個(gè)數(shù)占比和累計(jì)峰面積占比。結(jié)果顯示，在正離子模式下有95.1%的峰的RSD 在30%以內(nèi)，峰面積占比為93.6%；在負(fù)離子模式下有93.2%的峰的RSD 在30%以內(nèi)，峰面積占比為94.1%。說明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，滿足代謝組學(xué)分析的要求。

2.3 不同切片方式丹參樣品的代謝組學(xué)分析

2.3.1 PCA分析對(duì)鮮切片曬干樣品（X-S）、鮮切片烘干樣品（X-H）、全干切片樣品（G-Q）、傳統(tǒng)切片樣品（G-C）進(jìn)行PCA 分析。分別將正離子和負(fù)離子模式下不同化合物的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 軟件，選擇PCA-X 模型，設(shè)置不同分組，確定主成分，繪制4 種處理方式下丹參樣品的PCA 得分圖。如圖2 所示，不同加工方式的丹參樣品在主成分1（PC1）有明顯分離。在正離子模式下（圖2A）PC1為0.38，在負(fù)離子模式下（圖2B）PC1 為0.552。從圖2 可以看出鮮切片樣品烘干和曬干處理差異較小，與傳統(tǒng)切片和全干切片差異較大。

圖2 不同切片方式下丹參的PCA得分圖Fig.2 The score plots of Salvia miltiorrhiza Bge. with different processing methods

對(duì)不同處理方式下的丹參樣品進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，得到p值，并計(jì)算兩組樣品之間的峰面積比值。篩選p＜0.05 和比值＞1.5 的代謝物為差異化合物。結(jié)果顯示，鮮切片烘干樣品和曬干樣品相比有5 個(gè)差異化合物；鮮切片烘干樣品與傳統(tǒng)切片樣品相比有16 個(gè)差異化合物；鮮切片曬干樣品與傳統(tǒng)切片樣品相比有16 個(gè)差異化合物；鮮切片烘干樣品和全干切片樣品相比有18 個(gè)差異化合物；鮮切片曬干樣品與全干切片樣品相比有19 個(gè)差異化合物；傳統(tǒng)切片樣品與全干切片樣品相比有16 個(gè)差異化合物。說明鮮切片烘干和曬干處理差異較小，傳統(tǒng)切片與全干切片差異較大，鮮切法與干切法差異較大。

2.3.2 次生代謝物9 種丹參酮類和1 種丹酚酸類物質(zhì)被篩選為差異次生代謝物。差異次生代謝物在不同樣品中的分布圖見圖3。丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹酚酸B 是藥典的指標(biāo)性成分。丹參酮Ⅰ在全干切片樣品中的峰面積值（平均值±SD，3 868 167±466 537）分別是鮮切片烘干樣品（2 269 407±93 997）、鮮切片曬干樣品（2 616 672±120 916）和傳統(tǒng)切片樣品（3 514 229±399 576）的1.70倍、1.48倍和1.10倍。丹參酮ⅡA 在全干切片樣品中的峰面積值（17 385 237±4 374 738）分別是鮮切片烘干樣品（11 284 460±2 228 373）、鮮切片曬干樣品（11 046 136±733 077）和傳統(tǒng)切片樣品（14 762 916±3 776 880）的1.54 倍、1. 57 倍和1.17 倍。隱丹參酮在全干切片樣品中的峰面積值（70 704 673±2 314 886）分別是鮮切片烘干樣品（67 093 994±5 235 287）、鮮切片曬干樣品（61 949 314±1 237 301）和傳統(tǒng)切片樣品（36 708 048±1 649 559）的1.05倍、1.14倍和1.92倍。丹酚酸B在全干切片樣品中的峰面積值（1 274 115±22 245）分別是鮮切片烘干樣品（859 757±40 055）、鮮切片曬干樣品（1 009 508±15 811）和傳統(tǒng)切片樣品（784 800±13 593）的1.48 倍、1.26 倍和1.62 倍。丹參酮I 和丹參酮ⅡA 在全干切片和傳統(tǒng)切片中豐度相當(dāng)，高于鮮切片。隱丹參酮在傳統(tǒng)切片中的豐度顯著低于其他3 種。丹酚酸B 在全干切片中的豐度較高。

圖3 差異次生代謝物在不同加工方式丹參樣品中的分布圖Fig.3 Histograms of differential secondary metabolite in different processing methods of Salvia miltiorrhiza Bge.

對(duì)于其他丹參酮類代謝物，鮮切片烘干樣品和曬干樣品相比，丹參新酮Ⅰ和異隱丹參酮具有顯著性差異，丹參新酮Ⅰ在鮮切片曬干樣品中的峰面積值（385 494±90 013）是烘干樣品（233 350±68 377）的1.65 倍。異隱丹參酮在鮮切片曬干樣品中的峰面積值（2 000 566±148 268）是烘干樣品（1 126 942±90 192）的1.78倍。全干切片樣品與傳統(tǒng)切片樣品相比，次丹參酮、丹參新酮Ⅰ、丹參新醌乙、丹參新酮Ⅱ、亞甲基丹參醌、異隱丹參酮具有顯著性差異，其在全干切片樣品中的峰面積值（27 028 020±935 733、1 004 468±154 400、28 363 504±915 903、691 372±22 912、9 574 806±230 702、2 120 150±195 371）分別是傳統(tǒng)切片樣品（11 504 494±396 042、522 273±87 393、14 486 140±393 821、295 515±5 838、4 388 218±173 931、1 177 546±177 314）的2.35 倍、1.92 倍、1.96 倍、2.34 倍、2.18 倍和1.80倍。全干切片樣品與鮮切片曬干樣品相比，丹參新酮Ⅰ、丹參新酮Ⅱ、亞甲基丹參醌變化明顯，其在全干切片樣品中的峰面積值分別是鮮切片曬干樣品（385 494±90 013、451 633±11 633、5 531 431±144 917）的2.61 倍、1.53 倍和1.73 倍。傳統(tǒng)切片樣品與鮮切片曬干樣品相比，次丹參酮、丹參新醌乙、丹參新酮Ⅱ和異隱丹參酮具有顯著性差異，其在鮮切片曬干樣品中的峰面積值（28 469 799±553 917、23 084 728±627 683、451 633±11 633、2 000 566±148 268）分別是傳統(tǒng)切片樣品（11 504 494±396 042、14 486 140±393 821、295 515±5 838、1 177 546±177 314）中的2.47 倍、1.59 倍、1.53 倍和1.70倍。以上結(jié)果說明，鮮切片曬干處理比烘干處理得到更多的丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)。大部分丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)在全干切片樣品中豐度最高，高于鮮切曬干片和傳統(tǒng)切片樣品。有研究指出，丹參整體曬干處理顯著優(yōu)于切段曬干，切段曬干處理下丹參酮等活性成分損失較大［9，12］。干燥是一個(gè)復(fù)雜的生化過程，在干燥的過程中，植物的生物合成仍在進(jìn)行，當(dāng)含水量極低時(shí)，生物合成被中止［27］。相對(duì)于鮮切加工，干切加工方式下，丹參的完整度高，水分損失慢，可以積累更多的丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)。傳統(tǒng)切片中悶潤(rùn)處理易造成丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)的流失［10］。

2.3.3 初生代謝物脂肪酸類、氨基酸類、有機(jī)酸類以及核苷類初生代謝物在不同加工方式的丹參樣品中具有顯著性差異。圖4為差異脂肪酸類代謝物的熱圖。脂肪酸類代謝物在全干切片樣品中豐度最高，在傳統(tǒng)切片中次之，在鮮切片樣品中較低。這是因?yàn)橹舅犷惢衔锏闹苄暂^強(qiáng)，在傳統(tǒng)切片的悶潤(rùn)處理中損失較少。

圖4 差異脂肪酸類代謝物熱圖Fig.4 Heat map of differential fatty acids metabolites

鮮切片烘干樣品與鮮切片曬干樣品相比，脯氨酸、色氨酸、鳥嘌呤有顯著性差異，在鮮切片烘干樣品中的峰面積值分別是曬干樣品的1.51 倍、1.87倍和2.83倍（圖5）。全干切片樣品與傳統(tǒng)切片樣品相比，亮氨酸、2-異丙基蘋果酸有顯著性差異，兩者在全干切片樣品中的峰面積值分別是傳統(tǒng)切片樣品的1.62倍和1.63倍。全干切片與鮮切片曬干樣品相比，苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、2-異丙基蘋果酸、鳥嘌呤、腺嘌呤有顯著性差異，其在全干切片樣品中的峰面積值分別是鮮切片曬干樣品的1.71 倍、1.59 倍、3.93 倍、1.61倍、1.64倍、1.82倍、2.80倍和1.57倍。傳統(tǒng)切片樣品與鮮切片曬干樣品相比，脯氨酸、色氨酸、2-異丙基蘋果酸、鳥嘌呤、腺嘌呤有顯著性差異，其在傳統(tǒng)切片樣品中的峰面積值是鮮切片曬干樣品的5.41 倍、2.20 倍、2.96 倍、2.40 倍和1.71 倍。以上結(jié)果說明，氨基酸類成分受加工方式的影響較為顯著。全干切片和傳統(tǒng)切片中氨基酸的豐度均較高。芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）是次生代謝物合成的前體物質(zhì)，其在干切樣品中豐度較高，與丹酚酸和丹參酮類化合物的趨勢(shì)一致。

圖5 有機(jī)酸類、核苷類、氨基酸類成分在不同加工方式丹參樣品中的分布圖Fig.5 Histograms of organic acids，nucleosides and amino acids in different processing methods of Salvia miltiorrhiza Bge.

3 結(jié) 論

本文基于LC-HRMS 對(duì)不同加工方式下的丹參切片樣品進(jìn)行初生代謝物和次生代謝物分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分初生和次生代謝物的豐度在干切法樣品中高于鮮切法樣品。這可能是由于干切法丹參的完整性好，水分流失慢，代謝活動(dòng)較活躍，積累了更多的有效成分。全干切片中丹參酮和丹酚酸類成分高于傳統(tǒng)切片，品質(zhì)較好。但在實(shí)際量產(chǎn)中也要考慮全干切片在切制時(shí)易裂開、成片率低等問題。