基于UPLC-Q-Orbitrap-HRMS 技術鑒定護心膽中異喹啉類生物堿成分

劉 暢，周 熙，羅輝泰，黃 芳，吳惠勤

（廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東省中藥質量安全工程技術研究中心，廣東 廣州 510070）

護心膽（又名紅花雞距草，紫花荷苞牡丹），為罌粟科紫堇屬植物Corydalis sheareriS. Moore 的新鮮或干燥塊根，收載于《廣西實用中草藥新選》，具有活血止痛、清熱解毒等功效，民間常用于治療腹痛泄瀉、跌打損傷、癰瘡腫毒、目赤腫痛、胃痛等［1-2］?，F(xiàn)代藥理學及臨床研究表明，護心膽對毒蛇咬傷引起的疼痛具有治療效果，且具有抗病毒、抗腫瘤活性［3-5］。異喹啉類生物堿（Isoquinoline alkaloids，IQAs）是其主要的抗炎活性成分，小檗堿［6］、藥根堿［7］等能夠明顯改善潰瘍性結腸炎癥狀。但目前對護心膽中生物堿類成分的報道僅有原阿片堿、畢扣扣靈、南天竹堿、別隱品堿及紫堇塊莖堿［8-9］，未有全面分析。為探尋護心膽中更多治療結腸炎的生物堿類成分，本研究采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-Q-Orbitrap-HRMS）技術分析護心膽中IQAs 成分，為護心膽的后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

賽默飛Orbitrap Exploris 120型高分辨質譜儀、FreeStyleTM1.8 SP2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國 Thermo Fisher公司）。賽多利斯TP-114 電子天平（美國Sartorious 公司）；KQ2200 型臺式機械超聲波清洗器（東莞市超聲波設備有限公司）。

1.2 材料與試劑

護心膽（批號20220519）購自廣州市中藥材市場，經(jīng)鑒定為罌粟科紫堇屬植物Corydalis sheareriS.Moore的干燥塊根；甲醇、乙腈為色譜純試劑（德國Merck公司）；蒸餾水由屈臣氏集團提供；其余試劑為分析純。對照品四氫小檗堿（批號RFS-S08901905023）、表小檗堿（批號RFS-B06411812016）、四氫黃連堿（批號RFS-S11311802012）、黃連堿（批號 RFS-H08501910006）、甲基黃連堿（批號RFSJ0261912012）、巴馬汀（批號 RFS-H01501906015）、原阿片堿（批號RFS-Y05211812016）、別隱品堿（批號RFS-B05911804026）、木蘭花堿（批號RFS-M02611811022）、延胡索甲素（批號 RFSY15811812016）、延胡索乙素（批號110726-201819）、非洲防己堿（批號 RFS-F02911807017）、兩面針堿（批號RFS-L03111812016）、脫氫紫堇堿（批號RFS-T03302104008）、白屈菜紅堿（批號RFSB04202006024）、藥根堿（批號RFS-Y05202006001）、血根堿（批號RFS-W01002006015）、二氫血根堿（批號RFS-R06002002009）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，去甲烏藥堿（批號STC2400120）、鹽酸小檗堿（批號RS-03071120）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司，以上對照品質量分數(shù)均大于98%。

1.3 樣品制備

將護心膽藥材粉碎，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入20 mL 50%甲醇水溶液，稱定質量，浸泡30 min，超聲提取30 min，冷卻。再次稱定質量，用50%甲醇水溶液補足損失的質量，搖勻，靜置，取上清液過濾，濾液待上機分析。

分別精密稱取各對照品適量，用甲醇溶解制備對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得1 mg/L對照品溶液。

1.4 液相色譜條件

采用 Poroshell RRHD C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為 0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～2 min，10% B；2～10 min，10%～60% B；10～15 min，60%～95% B；15～17 min，95% B；17.1～20 min，95%～10% B。流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為1 μL，紫外檢測波長為250 nm。

1.5 質譜條件

使用加熱電噴霧離子源（HESI），正離子模式檢測，鞘氣流速為50 L·min-1，輔助氣流速為10 L·min-1，噴霧電壓為3.5 kV，毛細管溫度為325 ℃，輔助器溫度為350 ℃；掃描模式為數(shù)據(jù)依賴的二級質譜數(shù)據(jù)采集模式（dd-MS2），掃描范圍為m/z200～700，源內(nèi)裂解電壓為30 V，碰撞能量為20、40、60 eV。數(shù)據(jù)采集時間為20 min。

1.6 數(shù)據(jù)分析

有對照品的化學成分通過對照品保留時間、精確質量數(shù)與二級質譜圖等信息進行確認。無對照品的化學成分，通過一級精確質量數(shù)、二級碎片裂解規(guī)律，同時結合PubChem 質譜數(shù)據(jù)庫以及FreeStyleTM1.8 SP2 軟件進行定性分析。對于文獻中未報道，但在總離子流譜圖中出現(xiàn)的化學成分通過一級質譜的分子離子峰準確質量數(shù)推測化學式，再根據(jù)二級碎片，結合紫堇屬中藥材的化學成分種類，推測可能的結構式。

2 結果與討論

2.1 異喹啉類生物堿成分的鑒別

為便于對護心膽中IQAs 化學成分進行分析，首先從CNKI、GoogleScholar、Scifinder 等數(shù)據(jù)庫中檢索護心膽的化學成分，再通過Chemspider、Chembook、Massbank、Pubmed等數(shù)據(jù)庫獲取對應化學成分的信息，包括化合物的名稱、分子式、相對分子質量等，以建立護心膽的IQAs化合物數(shù)據(jù)庫。經(jīng)查閱相關文獻［10-11］，結合一級、二級質譜圖以及對照品信息，明確不同類型IQAs 的裂解規(guī)律。結合其特征二級碎片、三級質譜圖、保留時間特征等參數(shù)對護心膽中IQAs 進行了全面鑒定。在此基礎上，采用UPLC-Q-Orbitrap-HRMS 在正離子模式鑒定出62 個生物堿（見表1），包括15 個原小檗堿型生物堿、15個四氫小檗堿類生物堿、14 個芐基異喹啉類生物堿、3 個阿樸菲類生物堿、6 個普羅托品類生物堿、7個苯并菲啶類生物堿、2個二氫苯并菲啶類生物堿。護心膽提取物的總離子流色譜圖（TIC）如圖1所示。

表1 護心膽中異喹啉類生物堿成分的鑒定結果Table 1 Identification of isoquinoline alkaloids constituents of Corydalis suaveolens Hance

2.2 原小檗堿類生物堿、苯并菲啶類生物堿與二氫苯并菲啶類生物堿

原小檗堿類生物堿、二氫苯并菲啶類生物堿與苯并菲啶類生物堿均具有大的共軛結構，其母核在質譜中通常不會發(fā)生裂解。原小檗堿類生物堿的C5與C6位置的碳碳單鍵易脫去2個H，形成更大的穩(wěn)定的大π 共軛體系，所以原小檗堿類生物堿的母核通常不會發(fā)生裂解，主要碎片離子由小分子取代基的掉落形成，較少存在低于m/z230的產(chǎn)物離子。當取代基包含2個或多個甲氧基時，特征碎片離子為［M-CH4］+、［M-CH3］+和 ［M-2CH3］+，如小檗堿和巴馬汀［11］。結合碎片離子及文獻，鑒定出15 個原小檗堿類生物堿，分別為化合物22、23、25、26、29、35、38、40、42、45、49、51、52、55和58。

化合物52 為小檗堿，分子式為C20H18NO4+，在正離子模式下，準分子離子峰為m/z336.123 0［M］+。小檗堿含有鄰二甲氧基，產(chǎn)生特征碎片離子m/z321.099 3 ［M-CH3］+、306.076 0［M-CH4］+，在二級質譜中還可觀察到由m/z320.091 6［M-CH4］+相繼失去CO 產(chǎn)生的碎片離子m/z292.096 8［M-CH4-CO］+。其裂解途徑見圖2。

苯并菲啶類生物堿母核結構具有穩(wěn)定的雙鍵共軛系統(tǒng)，很難發(fā)生裂解，主要的裂解為一些取代基的丟失。根據(jù)其取代基，丟失CH3、CH2O、CO 等一系列取代基的二級碎片，易形成m/z317.067 9、332.091 0、304.095 1、290.082 6 等一系列特征碎片離子［12-14］。通過提取該系列特征碎片離子實現(xiàn)苯并菲啶類生物堿的快速識別。結合碎片離子及文獻，鑒定出7個苯并菲啶類生物堿，分別為化合物31、50、54、56、57、59、60。

化合物50為血根堿，分子式為C20H14NO4+，正離子模式下的準分子離子峰為m/z332.091 7［M］+，根據(jù)其取代基，會產(chǎn)生m/z317.067 9［M-CH3］+、304.096 8［M-CO］+，在二級碎片中還可看到由碎片離子m/z304.096 8［M-CO］+脫去1個CH2O后的碎片離子m/z274.086 3［M-CO-CH2O］+。其裂解途徑見圖3。

二氫苯并菲啶類生物堿與原小檗堿類生物堿的質譜裂解規(guī)律相似。二氫苯并菲啶類生物堿先丟失7位或8位的取代基形成相對較穩(wěn)定的苯并菲啶類生物堿結構，后續(xù)的裂解規(guī)律與苯并菲啶類生物堿的裂解規(guī)律一致［15-17］。

化合物62為二氫血根堿，分子式為C20H15NO4，正離子模式下準分子離子峰為m/z334.107 1。在二級質譜中，可觀察到其丟失1個CH4的特征碎片離子m/z318.075 9［M-CH4］+，脫去CH3后的特征碎片離子m/z319.083 7［M-CH3］+，脫去CH2O 形成的m/z304.100 0［M-CH2O］+及其丟失CO 產(chǎn)生的碎片離子m/z276.102 1［M-CH2O-CO］+。其裂解途徑見圖4。

圖4 二氫血根堿的裂解途徑（A）與MS/MS圖（B）Fig.4 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of dihydrosanguinarine

2.3 四氫小檗堿類生物堿

四氫小檗堿類生物堿易發(fā)生RDA 裂解，生成較小的二級碎片。同時，根據(jù)苯環(huán)上取代基的不同，生成丟失CH3、CH4、CH2O、CO 等一系列取代基的二級碎片。根據(jù)取代基的不同，四氫小檗堿類生物堿易形成m/z164.070 6、176.070 6、178.086 3、190.086 3、192.101 9、206.117 6等一系列特征碎片離子［18-20］。結合碎片離子及文獻，共鑒定出15個四氫小檗堿類生物堿，分別為化合物 13、17～20、24、27、32、37、39、43、44、46、47和53。

化合物18為紫堇單酚堿，分子式為C20H23NO4，在正離子模式下，準分子離子峰為m/z342.170 0［M＋H］+，經(jīng)過逆狄爾斯-阿德爾（RDA）裂解，會產(chǎn)生豐度較高的特征碎片離子m/z192.101 8［M-C9H10O2］+，在二級質譜中還可觀察到由碎片離子m/z192.101 8［M-C9H10O2］+丟失1 個中性碎片CH3后的碎片離子m/z177.078 3［M-C9H10O2-CH3］+。其裂解途徑見圖5。

圖5 紫堇單酚堿的裂解途徑（A）與MS/MS圖（B）Fig.5 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of corydalmine

2.4 芐基異喹啉類生物堿

芐基異喹啉類生物堿的二級質譜碎裂存在兩個明顯特征：（1）發(fā)生α裂解，生成m/z100～200 的二級碎片；（2）根據(jù)N 上含有的甲基數(shù)量不同，可生成［M+H-NH（CH3）2］+、［M+H-NH2（CH3）］+、［M+HNH3］+等不同形式的裂解碎片。同時，在較低的質荷比范圍具有C3H8N+（m/z58.065 1）與C2H6N+（m/z44.049 5）的特征碎片離子。發(fā)生α裂解后，根據(jù)取代基不同，可產(chǎn)生m/z107.049 1、137.059 7、123.044 1、121.064 8、151.075 4 等離子碎片［21-22］。依據(jù)碎片信息及文獻，從護心膽中共鑒定出14 個芐基異喹啉類生物堿，分別為化合物1～6、8、10、12、14～16、21和41。

化合物5 為烏藥堿，分子式為C17H19NO3，在正離子模式下，準分子離子峰為m/z286.143 8［M+H］+。在二級質譜中，可觀察到母核斷裂后的特征碎片離子m/z107.048 9，脫去氨基后的特征碎片離子m/z269.117 4［M-NH3］+，烏藥堿中存在相鄰的羥基和甲氧基結構，還會失去CH3OH 從而形成m/z237.091 4［M-NH3-CH3OH］+。其裂解途徑見圖6。

2.5 阿樸菲類生物堿

阿樸菲類生物堿的N 上可連接0～2 個甲基，其質譜裂解規(guī)律與芐基異喹啉類生物堿一致，根據(jù)N上含有的甲基數(shù)量不同，可生成［M+H-NH（CH3）2］+、［M+H-NH2（CH3）］+、［M+H-NH3］+等不同形式的裂解碎片。同時，在較低的質荷比范圍產(chǎn)生m/z58.0651與44.049 5的特征碎片離子。但阿樸菲類生物堿具有較大的共軛結構，其母核結構不易發(fā)生斷裂，不會形成m/z較小、豐度較大的碎片離子［23-25］。結合碎片離子及文獻，共鑒定出3個阿樸菲類生物堿，分別為化合物7、9、34。

化合物9 為木蘭花堿，分子式為C20H24NO4+，在正離子模式下，準分子離子峰為m/z342.170 0［M］+。木蘭花堿含有NH（CH3）2結構，會形成特征離子碎片m/z297.112 0［M-NH（CH3）2］+。在二級質譜中可觀察到其丟失1 個CH3得到的m/z282.088 5 ［M-NH（CH3）2-CH3］+及掉落CH4O 產(chǎn)生的m/z265.085 8［M-NH（CH3）2-CH4O］+。碎片離子m/z265.085 8 在斷裂的過程中發(fā)生異構化，相繼失去CO 和CH3形成碎片離子m/z237.090 8［M-NH（CH3）2-CH4O-CO］+。其裂解途徑見圖7。

圖7 木蘭花堿的裂解途徑（A）與MS/MS圖（B）Fig.7 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of magnoflorine

2.6 普羅托品類生物堿

普羅托品類生物堿不存在大π 共軛系統(tǒng)，母核易發(fā)生斷裂，經(jīng)RDA 裂解形成小分子片段。羰基上的O易發(fā)生脫水，母核失去1分子H2O形成穩(wěn)定的4環(huán)結構，［M＋H-H2O］+的碎片峰是普羅托品類生物堿區(qū)別于其他IQAs 的最重要特征。同時，由于N 上含有甲基，易形成C2H6N+（m/z44.049 5）的特征碎片［26-27］。結合碎片離子及文獻，共鑒定出6 個普羅托品類生物堿，分別為化合物11、28、30、33、36、48。

化合物30為原阿片堿，分子式為C20H19NO5，正離子模式下，準分子離子峰為m/z354.133 5。母核發(fā)生脫水，失去1 個H2O 產(chǎn)生m/z336.122 7［M-H2O］。經(jīng)過RDA 裂解，形成碎片離子m/z206.081 1［M-C9H7O2］+，繼續(xù)丟失1 個OH 后產(chǎn)生碎片m/z189.078 4［M-C9H7O2-OH］+，或脫去1 個H2O 后產(chǎn)生m/z188.070 5［M-C9H7O2-H2O］+。其裂解途徑見圖8。

圖8 原阿片堿的裂解途徑（A）與MS/MS圖（B）Fig.8 Fragmentation process（A） and MS/MS spectrum（B） of protopine

護心膽作為地方用藥，具有解毒、止痛、消腫的功效，民間常以搗敷或嚼服用于治療跌打損傷、癰瘡腫毒、胃痛以及毒蛇咬傷，展現(xiàn)出良好的應用價值。護心膽與紫堇屬多數(shù)中藥材存在相似的化學組成，主要含生物堿類成分，異喹啉類生物堿可能是其主要的活性成分之一，具有廣泛的藥理活性［28］。然而，目前其異喹啉類生物堿組成尚未明確。

護心膽中含有的小檗堿、巴馬汀、木蘭花堿具有抗炎、抗氧化應激和抗菌等多種活性，在治療腸胃炎癥、胰腺炎、腎病綜合征、關節(jié)炎等疾病方面具有重要作用［29-31］。藥根堿可以抗動脈血栓和靜脈血栓，其可能主要通過作用于內(nèi)源性凝血途徑而發(fā)揮抗血栓作用［32］。本實驗對護心膽的異喹啉類生物堿進行全面鑒定，闡明了護心膽中的主要化學物質組成，為進一步明確其藥效物質基礎、質量控制以及作用機制研究奠定了基礎。

3 結 論

UPLC-Q-Orbitrap-HRMS 技術可通過其精確質量數(shù)及二級質譜圖結合化合物的質譜裂解規(guī)律與質譜數(shù)據(jù)庫快速鑒定化合物成分，是中藥有效成分定性分析的最有效手段之一。本研究首次采用該技術在正離子模式下采集護心膽甲醇提取物的色譜質譜圖，并對色譜圖中的各個色譜峰進行精確質量數(shù)識別。以紫堇屬中藥材中已知的不同類型異喹啉類生物堿作為參照，同時結合保留時間、相對分子質量、二級質譜碎片離子、相關文獻，共鑒定出62 個異喹啉類生物堿，包括15 個原小檗堿型生物堿、15 個四氫小檗堿類生物堿、14 個芐基異喹啉類生物堿、3 個阿樸菲類生物堿、6 個普羅托品類生物堿、7 個苯并菲啶類生物堿、2 個二氫苯并菲啶類生物堿。本研究對護心膽中異喹啉類生物堿成分進行全面系統(tǒng)的解析，為其成分分析、藥效物質基礎研究及質量控制提供了科學依據(jù)。