基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查茶葉中166種農(nóng)藥殘留方法研究

方俊蘭，張丹陽(yáng)，伊岳星，劉穎穎，柴云峰，李祖光*，陳紅平*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

茶葉是世界上僅次于水的消費(fèi)最廣泛的飲料。茶葉中富含茶多酚、氨基酸、黃酮、茶多糖等營(yíng)養(yǎng)功能性物質(zhì)，不僅形成了茶葉特色風(fēng)味品質(zhì)，而且賦予茶葉降血壓、抗菌、預(yù)防腫瘤等功效［1-2］。茶樹喜溫濕環(huán)境，易發(fā)生病蟲草害，不可避免使用化學(xué)農(nóng)藥以提高茶葉產(chǎn)量與質(zhì)量［3-4］。茶葉中化學(xué)農(nóng)藥殘留問(wèn)題一直備受關(guān)注，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)通過(guò)規(guī)定茶葉中的最大殘留限量（MRLs）［5］對(duì)茶葉農(nóng)藥殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以避免不合格茶葉產(chǎn)品被消費(fèi)者飲用。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763.1-2022［6］規(guī)定了茶葉中110 種農(nóng)藥的MRLs，歐盟、日本分別規(guī)定了508 種、236 種農(nóng)藥的MRLs，并采用“一律標(biāo)準(zhǔn)”規(guī)定其他農(nóng)藥的MRLs 為0.01 mg/kg［7-8］。因此，建立茶葉中農(nóng)藥殘留的高通量檢測(cè)與篩查技術(shù)是確保茶葉飲用安全與出口安全的基本技術(shù)條件。

色譜和質(zhì)譜結(jié)合的方法是茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的通用方法，包括氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）等。目前，氣相色譜或液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（LC-MS/MS 或GC-MS/MS）由于其高靈敏度和選擇性，已廣泛用于茶葉中農(nóng)藥的多殘留分析［9-10］。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜能夠在一次運(yùn)行中對(duì)100 多種目標(biāo)分析物進(jìn)行高選擇性和高靈敏度的定量和確認(rèn)，但需對(duì)大量化合物的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化且同時(shí)監(jiān)測(cè)的化合物數(shù)量有上限，不適用于非靶向高通量篩選［11］。高分辨質(zhì)譜儀（HRMS），包括飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）和四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap MS），具有質(zhì)量范圍廣、分辨率和質(zhì)量精度高、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，可在全掃描模式下采集多組分、多離子信息，實(shí)現(xiàn)化合物的非靶向篩選和可追溯性分析［11］，因而廣泛用于環(huán)境、食品等不同基質(zhì)中農(nóng)藥的高通量檢測(cè)與篩查［12-13］。

基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)茶葉中農(nóng)藥殘留的研究較多，農(nóng)藥殘留檢測(cè)數(shù)量與種類不斷擴(kuò)增，定性定量功能更加完善，并逐漸由靶向篩查過(guò)渡到非靶向篩查的新階段，顯著提升了茶葉中農(nóng)藥殘留高通量檢測(cè)水平。盧巧梅［14］建立了茶葉中18 種農(nóng)藥的高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-TOF MS）檢測(cè)方法，Zhang 等［15］建立了茶葉中8 種新煙堿類與4 種氟蟲腈農(nóng)藥的超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）檢測(cè)方法，金莉莉等［16］建立了UHPLC-QExactive Orbitrap MS 測(cè)定茶葉中21 種農(nóng)藥的檢測(cè)方法，張蓉等［17］建立了茶葉中95 種農(nóng)藥的UHPLC-QExactive Orbitrap MS 檢測(cè)方法，Chen 等［18］建立了茶葉中117 種農(nóng)藥的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測(cè)與篩查方法。上述方法的線性范圍、精密度與靈敏度等關(guān)鍵指標(biāo)可與LC-MS/MS 方法相媲美，但UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 在定性分析、陽(yáng)性樣品確證等性能上優(yōu)于LC-MS/MS。

茶葉富含非揮發(fā)性化學(xué)成分，在電噴霧離子源中會(huì)增強(qiáng)或抑制靶標(biāo)物質(zhì)離子化，在定量分析中易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)（ME）［19］，成為液相色譜-電噴霧離子源質(zhì)譜用于農(nóng)藥殘留痕量分析的難點(diǎn)。由于加工工藝差異，導(dǎo)致茶葉的基礎(chǔ)物質(zhì)在不同種類茶葉之間存在較大差異，如發(fā)酵工藝顯著影響茶多酚、茶多糖等特征組分含量，從而呈現(xiàn)出不同茶葉中農(nóng)藥殘留電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)差異，然而目前UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 分析不同茶葉中農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)研究甚少，農(nóng)藥殘留高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)有待進(jìn)一步完善。本文根據(jù)我國(guó)新修訂的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763.1-2022［6］規(guī)定的茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量、茶樹上已登記農(nóng)藥、國(guó)內(nèi)外茶葉質(zhì)量安全通報(bào)的農(nóng)藥，建立了針對(duì)茶葉樣品的農(nóng)藥殘留高通量篩查與定量分析方法。通過(guò)對(duì)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分析，建立農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 結(jié)合TraceFinder 軟件進(jìn)行篩查分析、方法學(xué)驗(yàn)證及基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)，并應(yīng)用建立的方法分析市場(chǎng)上部分茶葉的農(nóng)藥殘留情況。本方法可用于茶葉中農(nóng)藥殘留的高通量篩查分析，具有快速、高效的特點(diǎn)，可為化學(xué)污染物殘留的高通量篩查檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Q-Exactive-Orbitrap HRMS，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；超高效液相色譜儀（Ultimate 3 000 UHPLC，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；Milli-Q 去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore 公司）。使用Xcalibur? 2.2.1版本和TraceFinder 3.3版本（Thermo Fisher Scientific 公司）處理數(shù)據(jù)。

166 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L）購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津）；乙腈（HPLC級(jí)，上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q 去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）純化。醋酸鈉、無(wú)水硫酸鎂（分析純，浙江醫(yī)藥股份有限公司）；異丙基乙二胺（PSA）和石墨化炭黑（GCB）（Bonna-Agela Technologies，天津）。樣品來(lái)源：茶葉樣品從流通市場(chǎng)抽取采集，包括綠茶和紅茶。

1.2 儀器分析條件

色譜條件：采用Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm），柱溫為35 ℃。流動(dòng)相為含0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸銨的水溶液（A 相）及乙腈（B 相），洗脫程序?yàn)椋?～5 min，95%～50% A；5～18 min，50%～5% A；18～23.1 min，5%～95% A。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：采用可加熱電噴霧離子源（HESI）；檢測(cè)模式為正離子模式，電磁頻率為50 Hz，噴霧電壓為3 kV，毛細(xì)管溫度為320 ℃，加熱電壓器溫度為300 ℃，鞘氣（N2＞99%）流速為35 arb，輔助氣（N2＞99%）流速為12 arb，掃描模式為全掃描（Full MS）以及全掃描/二級(jí)掃描（Full MS/dd-MS2）模式，質(zhì)譜掃描范圍為m/z75～750 ，F(xiàn)ull MS 與dd-MS2分辨率分別為70 000 與35 000 FWHM（m/z200），階梯標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量（NCEs）為30、50、70 eV。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立采用UPLC Q-Exactive Orbitrap MS 對(duì)200 μg/L 農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，在Full MS 模式下獲得精確質(zhì)量信息。Xcalibur 軟件采集質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間。將所有農(nóng)藥的名稱、分子式、保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子質(zhì)量數(shù)等信息制作成Excel 表格，導(dǎo)入TraceFinder3.3 軟件，建立農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2 樣品前處理茶葉樣品采用改良QuEChERS 前處理方法。稱取研磨后的茶葉試樣2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，每個(gè)離心管中加入5 mL水和10 mL乙腈。超聲15 min后加入6 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉，在10 000 r/min條件下離心5 min。取2 mL上清液加入含有200 mg PSA和50 mg GCB的2 mL離心管中，渦旋1 min，在10 000 r/min條件下離心5 min。最后將上清液過(guò)膜轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。

1.3.3 農(nóng)藥化合物的篩查與鑒定凈化后的樣品在“1.2”條件下進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinder與建立的農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍測(cè)試綠茶和紅茶2個(gè)品種的空白樣品經(jīng)前處理后得到空白提取液，配制質(zhì)量濃度分別為2、4、10、20、40、100、200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，考察線性關(guān)系并評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證選取綠茶與紅茶空白樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，分別添加10、20、25、50 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行5 次，按照“1.3.2”進(jìn)行前處理后在“1.2”條件下進(jìn)行儀器分析，并評(píng)價(jià)該方法的精密度和準(zhǔn)確度。

1.4 實(shí)際樣品篩查檢測(cè)

選取20份實(shí)際茶葉樣品（包括14份綠茶、6份紅茶），應(yīng)用本方法進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息采集與數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS 包含多種監(jiān)測(cè)模式，一般采用Full MS 和Full MS/dd-MS2模式進(jìn)行定性篩選和定量分析［20］。其中，F(xiàn)ull MS/dd-MS2可提供更多的碎片離子信息，有利于目標(biāo)化合物的鑒定，但會(huì)導(dǎo)致單個(gè)碎片離子的掃描時(shí)間下降，進(jìn)而使得靈敏度下降［21］。因此采集農(nóng)藥化合物的數(shù)據(jù)信息時(shí)首先選擇Full MS模式以獲得更高的靈敏度，但在陽(yáng)性樣品確證時(shí)采用Full MS/dd-MS2掃描模式。

構(gòu)建農(nóng)藥化合物數(shù)據(jù)庫(kù)是進(jìn)行高通量篩選的基礎(chǔ)，前體離子的精確質(zhì)量、碎片離子的精確質(zhì)量和保留時(shí)間是數(shù)據(jù)庫(kù)中的關(guān)鍵參數(shù)。采集農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)，獲得總離子流圖（如圖1）。對(duì)于每種農(nóng)藥，將質(zhì)子化離子（［M+H］+）的精確質(zhì)量數(shù)輸入Xcalibur Qual Browser，作為特征離子信息。對(duì)于確定的前體離子，一般選取至少兩個(gè)碎片離子的理論質(zhì)量。開發(fā)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)見表1，包含166 種農(nóng)藥的名稱、化學(xué)式、保留時(shí)間、前體離子的精確質(zhì)量、碎片離子的精確質(zhì)量信息。質(zhì)量精度是高分辨率質(zhì)量測(cè)量的一個(gè)重要參數(shù)，SANTE 文件建議m/z＞200 的質(zhì)量精度＜5 ppm，m/z＜200 的精度＜1 mDa［22］。經(jīng)計(jì)算，數(shù)據(jù)庫(kù)中所有農(nóng)藥化合物的質(zhì)量精度均小于5 ppm。將這些信息整合在Microsoft Excel 模板中，然后導(dǎo)入TraceFinder 3.3創(chuàng)建可使用的篩查方法。

圖1 166種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/L）的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram（TIC） of 166 pesticides in the mixture standard solution at 200 μg/L

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

選取紅茶、綠茶兩個(gè)茶葉樣品，作為空白基質(zhì)進(jìn)行前處理凈化，獲得空白基質(zhì)提取液。分別使用乙腈和空白基質(zhì)提取液配制7個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.3”進(jìn)行篩查分析，得到溶劑和不同茶葉基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的線性方程及相關(guān)系數(shù)。

（續(xù)表1）

通過(guò)比較由空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和乙腈制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來(lái)評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)（ME）。計(jì)算公式為：ME（%）=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率-1）×100。

根據(jù)制作工藝的不同茶葉可分為六大類，受遺傳、環(huán)境和生產(chǎn)加工等因素的影響，不同類型茶葉中基質(zhì)成分存在明顯差異。因此，不同茶葉中農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)不盡相同［15］。如圖2 所示，綠茶和紅茶中不同農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)分別為-56%～63%、-19%～110%。綠茶和紅茶基質(zhì)中分別有79 種農(nóng)藥（48%）和20 種農(nóng)藥（12%）的基質(zhì)效應(yīng)介于-20%～20%。根據(jù)SANTE/11312/2021［23］，ME在±20%的范圍內(nèi)表明基質(zhì)效應(yīng)可忽略，可通過(guò)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量?？傮w上，紅茶比綠茶的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)更強(qiáng)，表明不同加工方式對(duì)茶葉基質(zhì)效應(yīng)具有影響。因此本研究采用空白基質(zhì)溶液定量，以校正基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的定量偏差。

圖2 綠茶與紅茶中166種農(nóng)藥在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of 166 pesticides in green tea and black tea

2.3 方法驗(yàn)證

按照“1.3.4”方法進(jìn)行線性關(guān)系評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，綠茶中氟環(huán)唑、乙嘧硫磷、丁苯嗎啉、魚藤酮、噻嗪酮、乙霉威、喹螨醚、仲丁威、苯銹啶、唑螨酯、抗蚜威、烯丙苯噻唑、氟唑環(huán)菌胺、蟲酰肼和甲基硫菌靈15 種農(nóng)藥在4～200 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，其余151 種農(nóng)藥在2～200 μg/L 范圍內(nèi)線性良好；紅茶中166種農(nóng)藥在2～200 μg/L范圍內(nèi)線性良好；相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。

以綠茶和紅茶為基質(zhì)，按照“1.3.5”方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。綠茶樣品中151種農(nóng)藥和紅茶樣品中166 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率均在70%～130%之間。在綠茶樣品中166 種農(nóng)藥的RSD 均小于22%，其中150種（99%）農(nóng)藥的RSD在20%以下；在紅茶樣品中166種農(nóng)藥的RSD均小于29%，其中144種（87%）農(nóng)藥的RSD 在20%以下。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于茶葉中農(nóng)藥殘留的篩查。根據(jù)線性范圍、相關(guān)系數(shù)及回收率滿足70%～130%，且RSD小于20%的要求，可知綠茶中氟環(huán)唑、乙嘧硫磷、丁苯嗎啉、魚藤酮4 種農(nóng)藥的定量下限為20 μg/kg，噻嗪酮、乙霉威、喹螨醚、仲丁威、苯銹啶、唑螨酯、抗蚜威、烯丙苯噻唑、氟唑環(huán)菌胺、蟲酰肼、甲基硫菌靈11 種農(nóng)藥的定量下限為25 μg/kg，其余151種農(nóng)藥的定量下限為10 μg/kg；紅茶中166種農(nóng)藥的定量下限均為10 μg/kg。

2.4 實(shí)際樣品分析

為驗(yàn)證本方法在日常茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的適用性，將其應(yīng)用于綠茶與紅茶樣品的實(shí)際篩查。對(duì)20 份樣品（14 份綠茶，6 份紅茶）進(jìn)行分析，有4 份綠茶樣品（28%）檢出9 種農(nóng)藥，含量為0.001 1～0.137 4 mg/kg；有3 份紅茶樣品（50%）檢出9 種農(nóng)藥，含量為0.001 1～0.233 7 mg/kg，均未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)最大殘留限量。綠茶中吡蟲啉的檢出率最高（25%），紅茶中吡蟲啉、啶蟲脒、噻嗪酮的檢出率均為25%。

高分辨質(zhì)譜最大的優(yōu)勢(shì)在于可獲得二級(jí)碎片離子以及離子精確質(zhì)量數(shù)，這對(duì)于鑒定化合物十分有利。農(nóng)藥化合物的鑒定過(guò)程以噻嗪酮為例，其化學(xué)式為C16H23N3OS，在電噴霧正離子模式下可獲得穩(wěn)定的［M+H］+加合離子峰，精確質(zhì)量為m/z306.163 6，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)可找出保留時(shí)間為13.76 min 的色譜峰（如圖3）。在Full MS 模式下標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際樣品的一級(jí)質(zhì)譜圖中均存在精確前體離子，m/z分別為306.163 8 和306.163 6（如圖4A、B）。確證農(nóng)藥化合物時(shí)采用Full MS/dd-MS2模式以獲取更多碎片信息。標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際樣品在該模式下獲得的m/z60～240 前體離子生成的二級(jí)譜圖如圖4C、D 所示，對(duì)比可發(fā)現(xiàn)噻嗪酮離子的質(zhì)量精度和豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液中噻嗪酮離子幾乎一致。實(shí)際樣品中存在m/z86.060 2、m/z106.065 4、m/z116.053 1、m/z145.043 3和m/z201.106 0的碎片離子，且其質(zhì)量誤差均小于5×10-6。

圖3 實(shí)際樣品的總離子流圖及噻嗪酮保留時(shí)間為13.76 min時(shí)的色譜峰Fig.3 Total ion current diagram of a actual sample and the chromatographic peak of buprofezin at retention time of 13.76 min

根據(jù)碎片離子信息可對(duì)噻嗪酮的裂解方式進(jìn)行推測(cè)（如圖5）：首先在雜原子S上加合氫離子成為前體離子，然后發(fā)生由正電荷引起的i斷裂或氫重排。所有碎片離子信息與二級(jí)譜圖信息對(duì)應(yīng)，可以進(jìn)一步確證化合物的存在。

3 結(jié) 論

本研究基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定茶葉中166種農(nóng)藥殘留的分析方法。利用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建了166 種農(nóng)藥的分子離子、特征碎片離子以及二級(jí)質(zhì)譜的譜庫(kù)。目標(biāo)農(nóng)藥在UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 的Full Scan 監(jiān)測(cè)模式下，采用分子離子質(zhì)子化［M+H］+為定量離子，特征碎片離子及二級(jí)質(zhì)譜離子為定性離子。評(píng)價(jià)了綠茶與紅茶進(jìn)行UHPLC-QExactive Orbitrap MS 分析時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)。方法驗(yàn)證結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、可靠，操作簡(jiǎn)便、快速，可應(yīng)用于茶葉中農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)，也可為其他化學(xué)污染物殘留的高通量篩查檢測(cè)提供參考。