基于線粒體異常的乳腺癌治療新策略：線粒體移植

馬亮亮 孫力超

作者單位：100021 北京 國(guó)家癌癥中心，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2020年最新研究數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌超過了肺癌成為全球女性最常見的癌癥，中國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率高且呈上升趨勢(shì)，占全球乳腺癌死亡率的18%［1］。乳腺癌的治療方案包括手術(shù)治療、放療和藥物治療，早期浸潤(rùn)性乳腺癌和導(dǎo)管原位癌通常以手術(shù)切除為主［2］，放療可作為手術(shù)后降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一種輔助治療［3］。藥物治療用于乳腺癌的全身療法［4］，治療方案取決于乳腺癌的分子分型。大約70%的乳腺癌患者表現(xiàn)為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性或孕激素受體（progenstogen receptor，PR）陽(yáng)性，常用激素治療［5］；人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過表達(dá)的患者占15%～20%，常用曲妥珠單抗治療［6-7］；三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）尚缺乏靶向治療方法，傳統(tǒng)化療仍是唯一的治療選擇［8］。乳腺癌治療失敗往往與固有或獲得性耐藥相關(guān)［9］，因此尋找新的乳腺癌治療方式，降低患者耐藥性，是乳腺癌治療亟需解決的難題。

WARBURG［10］首次報(bào)道了線粒體在細(xì)胞癌變過程中的潛在作用，揭示了線粒體缺陷可能是腫瘤的特征之一。目前已在乳腺癌［11］、肝癌［12］、胃癌［13］中發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)和功能的異常。因此，逆轉(zhuǎn)線粒體代謝異?？赡苁前┌Y治療的潛在方法［14-15］。近年來，線粒體移植作為一種治療線粒體疾病的創(chuàng)新策略受到越來越多的關(guān)注，其目的是將功能正常的外源性線粒體轉(zhuǎn)移到線粒體缺陷細(xì)胞中，從而促進(jìn)ATP 的產(chǎn)生，幫助細(xì)胞自我修復(fù)［16］。本文綜述了乳腺癌中線粒體異常和線粒體移植治療策略，為線粒體移植療法成為乳腺癌臨床治療方案的選擇提供依據(jù)。

1 線粒體異常對(duì)乳腺癌的作用

1.1 線粒體形態(tài)和氧化磷酸化異常

最初，SPRINGER［17］通過電子顯微鏡觀察了乳腺癌中的線粒體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的線粒體具有多形性，線粒體表現(xiàn)出腫脹、外膜屈曲、嵴結(jié)構(gòu)紊亂、嵴與線粒體長(zhǎng)軸平行、基質(zhì)髓鞘樣、基質(zhì)空泡和形狀扭曲等特征。隨后，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系出現(xiàn)線粒體形態(tài)腫脹、扭曲、嵴數(shù)量減少及結(jié)構(gòu)紊亂的現(xiàn)象，伴有基質(zhì)空泡化和嵴排列方向與線粒體長(zhǎng)軸平行的變化［18-19］。另外，有研究報(bào)道乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生ATP 的能量代謝方式因細(xì)胞類型而異，如KAMADA等［20］發(fā)現(xiàn)在MCF-7（ER和PR陽(yáng)性）、SKBR3（HER2陽(yáng)性）和MDA-MB-231（TNBC）乳腺癌細(xì)胞系中，25%的MCF-7、50%的SKBR3 和75%的MDA-MB-231 細(xì)胞依賴糖酵解產(chǎn)生ATP，這表明依賴糖酵解產(chǎn)生ATP 的程度在乳腺癌不同分子亞型之間有所不同。還有研究發(fā)現(xiàn)在TNBC 中參與氧化磷酸化的核編碼基因下調(diào)［21］。這些證據(jù)表明在乳腺癌中線粒體形態(tài)和氧化磷酸化功能存在異常。

1.2 線粒體DNA突變

線粒體DNA 由于缺乏組蛋白的保護(hù)和切除大片段DNA 損傷的核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）機(jī)制，并且靠近電子傳遞鏈，容易受到氧自由基的攻擊進(jìn)而發(fā)生突變［22-24］。線粒體DNA 突變可能會(huì)造成線粒體氧化磷酸化功能缺陷，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生［25-26］。由于線粒體DNA 缺乏內(nèi)含子，因此大多數(shù)突變發(fā)生在編碼區(qū)，這會(huì)造成編碼呼吸鏈蛋白的基因功能異常，導(dǎo)致線粒體ROS的產(chǎn)生和氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，這些變化會(huì)觸發(fā)促癌基因的激活和抑癌基因的失活，引發(fā)細(xì)胞增殖失控，從而加速癌癥的發(fā)生［27-28］。目前，在乳腺癌中已經(jīng)檢測(cè)到線粒體DNA 體細(xì)胞突變，如JAHANI 等［29］在53 例乳腺癌患者組織中的線粒體DNA 測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)A10398G 突變最為常見，提示線粒體A10398G突變?cè)谌橄侔┲邪l(fā)揮一定作用。另外，LI 等［30］在83 例乳腺癌患者組織中的線粒體DNA測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)RNR2-2463 indelA、COX1-6296 C＞A、COX1-6298 indelT、ATP6-8860 A＞G、ND5-13327 indelA 等5種突變可能是乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素，并可能對(duì)乳腺癌治療起到指導(dǎo)作用。還有研究對(duì)乳頭抽吸液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA 的204、207 和16293 堿基位點(diǎn)發(fā)生突變，這些突變被認(rèn)為是乳腺癌的一種指征，并且提出將線粒體DNA D-loop區(qū)域的突變作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物［31-32］。在原發(fā)性乳腺癌中，線粒體DNA 變異大多數(shù)是單核苷酸變異，而不是小的插入或缺失［33-34］。此外，線粒體DNA變異分布在整個(gè)線粒體基因組中，并且在不同乳腺癌患者之間表現(xiàn)出顯著異質(zhì)性［35］。綜上所述，線粒體DNA 位置特殊，基因結(jié)構(gòu)緊密，易受突變影響，并且修復(fù)機(jī)制有限，被認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。

1.3 線粒體動(dòng)力學(xué)異常

線粒體是一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，通過融合和裂變調(diào)節(jié)大小、數(shù)量和形態(tài)。線粒體融合由3 種GTPases 蛋白介導(dǎo)：mitofusin 1（Mfn1），mitofusin 2（Mfn2）和視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，OPA1），線粒體裂變受動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）調(diào)控［36］。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞通過改變線粒體動(dòng)力學(xué)以獲得增殖和生存優(yōu)勢(shì)［37］。例如，在乳腺癌［38］、肺癌［39］和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［40］等癌癥組織中可觀察到碎片化的線粒體。還有研究報(bào)道線粒體融合增加與腫瘤細(xì)胞化療耐藥存在直接關(guān)聯(lián)［37，41］。CHEN 等［42］研究發(fā)現(xiàn)線粒體裂變?cè)赥NBC 臨床樣本中顯著增加，并與TNBC 患者較差的生存率相關(guān)；WEINER-GORZEL 等［43］研究發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比較，TNBC 腫瘤樣本中顯示線粒體裂變蛋白Drp1 上調(diào)和線粒體融合蛋白Mfn1下調(diào)，表明在TNBC 中存在線粒體動(dòng)力學(xué)失衡的情況，這可導(dǎo)致線粒體碎片化程度增加，且與TNBC的高侵襲性有關(guān)。另外，大約70%的TNBC 患者存在PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路異常激活，且異常激活的通路可導(dǎo)致線粒體裂變?cè)黾?，并保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受凋亡［44］。在人浸潤(rùn)性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)線粒體裂變蛋白Drp1 表達(dá)顯著上調(diào)，通過沉默Drp1 或過表達(dá)線粒體融合蛋白Mfn1可以抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力［38］。以上研究結(jié)果說明線粒體動(dòng)力學(xué)異常失衡可能導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

1.4 線粒體的逆行信號(hào)

線粒體也可以逆向調(diào)控核內(nèi)基因的表達(dá)而調(diào)控生命活動(dòng)，這個(gè)過程被稱為逆行信號(hào)傳導(dǎo)［45］。線粒體逆行信號(hào)傳導(dǎo)通路參與并影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。JIANG等［46］發(fā)現(xiàn)線粒體中的單鏈DNA 結(jié)合蛋白1（single stranded DNA binding protein 1，SSBP1）在TNBC 中下調(diào)，促進(jìn)了TNBC 細(xì)胞在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。在機(jī)制上，SSBP1 的缺失降低了線粒體DNA 拷貝數(shù)，增強(qiáng)了鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)的線粒體逆行信號(hào)，從而誘導(dǎo)c-Rel/p50 核定位，激活TGFβ 啟動(dòng)子活性，最終引發(fā)由TGFβ 驅(qū)動(dòng)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。SUN 等［47］發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜蛋白TMEM126A 缺失可能通過調(diào)控線粒體逆行信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生增多和線粒體膜電位去極化，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)乳腺癌轉(zhuǎn)移特性。另外，miR-663介導(dǎo)線粒體-細(xì)胞核的逆行信號(hào)并受ROS調(diào)控，隨著線粒體ROS生成量的增多，miR-663的表達(dá)水平隨之降低，進(jìn)而加速小鼠體內(nèi)乳腺癌的發(fā)展［48］。由此可知，線粒體功能障礙可能通過觸發(fā)逆行信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的形成和進(jìn)展。

2 線粒體移植在乳腺癌中的治療策略

最初，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間是通過轉(zhuǎn)移完整的線粒體，而不是單純的線粒體DNA 來幫助受體細(xì)胞改善線粒體功能［49-50］。基于此，研究人員提出了將整個(gè)線粒體直接移植到病變部位中，以探索外源性線粒體的拯救作用。1982 年，CLARK 和SHAY［51］提取了純化的包含抗生素抗性基因的線粒體，然后將純化的線粒體與抗生素敏感細(xì)胞混合，發(fā)現(xiàn)線粒體被細(xì)胞內(nèi)化，從而提高了細(xì)胞抵抗抗生素能力。接著，ALI POUR等［52］發(fā)現(xiàn)外源線粒體與心肌細(xì)胞共孵育可在短期內(nèi)顯著改善受體細(xì)胞線粒體呼吸作用。TEITELL 團(tuán)隊(duì)［53］將具有抗氯霉素的線粒體移植到對(duì)氯霉素敏感并缺乏線粒體DNA 的小鼠雜交細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體細(xì)胞保留了含有抗氯霉素的線粒體，并且改進(jìn)了受體細(xì)胞呼吸功能；同時(shí)該團(tuán)隊(duì)發(fā)明了將線粒體永久轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并形成具有獨(dú)特線粒體DNA-細(xì)胞核DNA 組合的Mitopunch 技術(shù)［54］。該技術(shù)可以在細(xì)胞無損的情況下，將線粒體精確地從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，產(chǎn)生具有所需線粒體DNA序列的細(xì)胞。

除在體外實(shí)驗(yàn)中觀察到線粒體轉(zhuǎn)移外，還可以將線粒體直接注射到生物體內(nèi)。例如，DOULAMIS等［55］將肌肉細(xì)胞的同種異體或自體線粒體注射到大鼠缺血再灌注損傷的心臟中，發(fā)現(xiàn)左心室功能恢復(fù)以及心肌梗塞面積減少。還有研究將自體線粒體注入豬模型的左冠狀動(dòng)脈口以修復(fù)心肌損傷［56］。另外，在大鼠模型中局部腦內(nèi)或全身動(dòng)脈內(nèi)注射線粒體可顯著減少腦梗死面積和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的數(shù)量［57］。目前線粒體移植采用共培養(yǎng)、肽標(biāo)記、顯微注射、直接注射和經(jīng)血管輸注等方法提高線粒體呼吸和移植效率［58-59］，見圖1。在臨床實(shí)踐中，線粒體顯微注射技術(shù)已經(jīng)非常成熟，自體線粒體顯微注射可以提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，幫助婦女分娩，降低胎兒疾病的發(fā)生率［60］。由此可見，線粒體移植技術(shù)對(duì)治療線粒體異常導(dǎo)致的疾病有重要的價(jià)值。

圖1 線粒體移植方式Fig.1 Mitochondrial transplantation methods

越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行線粒體移植能夠改善癌細(xì)胞的惡性表型和能量代謝方式。JIANG 等［61］發(fā)現(xiàn)人乳腺上皮細(xì)胞MCF-12A的線粒體可以進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D 和MDA-MB-231 中，并通過抑制癌細(xì)胞糖酵解和葡萄糖攝取能力抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其對(duì)紫杉醇的敏感性。CHANG 等［62］還發(fā)現(xiàn)來自健康個(gè)體的線粒體能夠轉(zhuǎn)運(yùn)到乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，降低MCF-7細(xì)胞中線粒體裂變蛋白Drp1 的表達(dá)，促進(jìn)線粒體的融合，形成管狀線粒體網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌抗腫瘤活性。隨后，該團(tuán)隊(duì)利用TNBC 小鼠模型比較單獨(dú)線粒體移植以及與Pep-1肽結(jié)合的線粒體移植兩種方式對(duì)移植效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植與Pep-1 肽結(jié)合的線粒體可顯著提高移植效率并顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死［63］。因此，單獨(dú)的線粒體在組織中的穿透能力較弱，與Pep-1 肽結(jié)合的線粒體可以顯著提高線粒體在特定病變細(xì)胞中的移植效率。綜上所述，線粒體移植是一種有前途的乳腺癌治療策略，可能在乳腺癌臨床治療中發(fā)揮重要作用。

3 小結(jié)與展望

線粒體功能的恢復(fù)取決于線粒體應(yīng)激水平、自噬信號(hào)、生物發(fā)生、融合和裂變過程之間的復(fù)雜平衡。目前，已有較多線粒體移植的方法，但不同方法的移植效率各不相同，需要根據(jù)細(xì)胞或組織類型優(yōu)化這些方法并開發(fā)更有效的細(xì)胞或組織特異性遞送技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)線粒體的精確靶向移植。此外，影響線粒體進(jìn)入受體細(xì)胞的因素、線粒體如何逃離內(nèi)體和溶酶體、哪些途徑會(huì)影響外源性線粒體與細(xì)胞內(nèi)線粒體融合以及線粒體移植之后如何逆行調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因的表達(dá)等線粒體移植研究方向值得關(guān)注。為了在臨床中開發(fā)基于線粒體治療乳腺癌的策略，仍需進(jìn)一步開展基礎(chǔ)和臨床研究以闡明乳腺癌中線粒體移植的時(shí)間區(qū)間和細(xì)胞表型改變的機(jī)制，以確定線粒體移植療法在乳腺癌患者中的最佳移植時(shí)機(jī)和作用。