不同色澤核桃內(nèi)種皮多酚和核桃仁分離蛋白理化性質(zhì)的差異

張 燕,馬家輝,王 偉,任麗秋,李曉芹,朱建津,成向榮,*

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122; 2.蘇州市食品檢驗檢測中心,江蘇 蘇州 215104)

核桃(JuglansregiaL.)是一種可食用的核果類堅果,因其營養(yǎng)豐富和有益健康的特性而享譽全球。我國的核桃種植歷史悠久,種植面積和產(chǎn)量均居世界第一[1]。核桃仁是核桃的主要可食用部位,含有較高的生物活性分子和植物化學(xué)物質(zhì),如必需脂肪酸、蛋白質(zhì)、纖維、植物甾醇、維生素E和酚類物質(zhì)等[2]。核桃仁表面包裹著一層薄膜,即核桃內(nèi)種皮,其所含的酚類物質(zhì)含量遠高于內(nèi)部核桃仁[3]。

核桃內(nèi)種皮顏色是決定消費者偏好的關(guān)鍵參數(shù)?！逗颂胰省?LY/T 1922-2010)[4]規(guī)定,核桃仁按照內(nèi)種皮色澤可分為淡黃、淺琥珀和琥珀等不同等級。核桃常作為干果進行銷售,內(nèi)種皮色澤直接影響到核桃的交易價格[5]。內(nèi)種皮顏色變深還會導(dǎo)致核桃仁風(fēng)味變差;且以顏色較深的核桃仁為原料生產(chǎn)的核桃油和核桃奶等產(chǎn)品顏色往往發(fā)褐,口感苦澀[6]。此外,核桃內(nèi)種皮顏色與核桃仁中油脂組成、內(nèi)種皮酚類化合物含量息息相關(guān)。Pakrah等[7]研究表明,核桃內(nèi)種皮顏色與多不飽和脂肪酸含量呈正相關(guān),而與油脂過氧化值呈負相關(guān),即顏色淺的核桃仁具有更高的營養(yǎng)價值和更低的酸敗度。據(jù)報道,淺色核桃內(nèi)種皮中的酚類化合物含量和抗氧化能力均高于深色核桃內(nèi)種皮[8]?？傊?目前僅有依據(jù)核桃仁外觀的分級,并沒有深入研究不同分級組分中核桃蛋白的差異。

內(nèi)種皮中的酚類物質(zhì)能和蛋白質(zhì)相互作用,影響核桃蛋白的提取率、穩(wěn)定性和色澤等品質(zhì)。研究表明,核桃內(nèi)種皮中的酚類物質(zhì)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀;雖然酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用可以提高抗氧化性,但高濃度的酚類物質(zhì)與苦味和深棕色有關(guān),會極大地影響食物中蛋白質(zhì)的品質(zhì)[9]。黃子林等[10]的研究結(jié)果表明,核桃衣多酚能夠改善植物蛋白溶解性。張雪春等[11]發(fā)現(xiàn),在多酚作用下,核桃蛋白溶解性與持水性降低,吸油性增加,且不同多酚對核桃蛋白加工性質(zhì)影響程度不同。因此,推測不同色澤核桃仁中酚類物質(zhì)組成不同,進而導(dǎo)致提取的蛋白質(zhì)在氧化水平和理化性質(zhì)上存在差異。

本研究根據(jù)核桃內(nèi)種皮色澤對核桃仁進行分級,并通過去皮處理得到相應(yīng)色澤的內(nèi)種皮和去皮核桃仁。分析色澤對內(nèi)種皮中酚類化合物含量、抗氧化活性和物質(zhì)組成的影響;并通過堿溶酸沉法提取相應(yīng)色澤核桃仁中的核桃分離蛋白,評價不同色澤核桃仁中核桃蛋白氧化水平與理化性質(zhì)的差異,為合理開發(fā)和利用核桃內(nèi)種皮和核桃蛋白提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

5430R臺式高速冷凍離心機,德國艾本德公司;Synergy H4多功能酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司;UV-1800紫外可見分光光度計,日本島津公司;超高效液相色譜儀和高分辨質(zhì)譜儀,美國安捷倫科技有限公司;TS-8轉(zhuǎn)移脫色搖床,碧云天生物技術(shù)有限公司;KJ-300超聲波發(fā)生器,無錫市科潔超聲電子設(shè)備有限公司;ME204E/02電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

本實驗所用核桃品種為溫185,購于新疆維吾爾自治區(qū)溫宿縣。Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。5,5-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]、2,4-二硝基苯肼(dinitrophenylhydrazine, DNPH)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、乙酸乙酯、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)為分析純,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他試劑,如鹽酸胍、丙酮、甲醇、正己烷、福林酚、氫氧化鈉、氯化鈉、過硫酸鉀、沒食子酸、水溶性維生素E(Trolox)等均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 核桃仁分級

去除核桃外殼,參考《核桃仁》(LY/T 1922-2010)[4]的分級標(biāo)準,按照內(nèi)種皮色澤,將核桃仁分為淡黃、淺琥珀和琥珀3個等級。使用液氮急凍分離核桃內(nèi)種皮與核桃仁[12],-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 脫脂核桃粉與脫脂內(nèi)種皮粉的制備

稱取去皮核桃仁500.00 g,45 ℃烘干12 h后粉碎為核桃漿。使用正己烷進行脫脂,設(shè)定料液比為1∶5(質(zhì)量體積比,g·mL-1),攪拌2 h后抽濾,重復(fù)提取3次。最后將抽濾后的脫脂粉置于通風(fēng)櫥中,待溶劑揮干即得脫脂核桃粉,保存于-20 ℃冰箱備用。

稱取10.00 g內(nèi)種皮用粉碎機粉碎,冷凍干燥24 h,去除內(nèi)種皮水分。其余步驟同上。將得到的脫脂內(nèi)種皮粉保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5 核桃內(nèi)種皮多酚的提取

稱取1.00 g脫脂內(nèi)種皮粉,按料液比1∶20(質(zhì)量體積比,g·mL-1)加入體積分數(shù)80%的丙酮溶液,冰浴條件下超聲處理20 min,4 ℃、3 186×g離心15 min,分離上清液,重復(fù)操作2次。收集上清液在30 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,10 mL甲醇復(fù)溶后經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾,保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.6 核桃內(nèi)種皮多酚提取物游離酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定樣品中的總酚含量[13]。取0.5 mL稀釋后的樣品,加入2.5 mL福林酚溶液(10倍去離子水稀釋),旋渦混勻后避光反應(yīng)5 min,再加入2 mL質(zhì)量分數(shù)7.5%的Na2CO3溶液,混勻后避光靜置反應(yīng)60 min,然后765 nm波長下測吸光度。以0.5 mL甲醇為空白對照,以沒食子酸制定標(biāo)準曲線(y=7.529 32x-0.002 35,R2=0.966 9)?？偡雍恳詥挝毁|(zhì)量內(nèi)種皮干重所含的沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalents, GAE)表示,單位為mg·g-1。

1.7 核桃內(nèi)種皮多酚提取物抗氧化活性測定

DPPH自由基清除活性的測定參考Brand-Williams等[14]的方法。0.1 mL稀釋后的樣品加入2.9 mL DPPH溶液(0.06 mmol·L-1,甲醇溶解),混勻后避光反應(yīng)60 min,在517 nm波長下檢測吸光度。以甲醇作為對照,以Trolox為標(biāo)樣制定標(biāo)準曲線(y=3.082 65x+0.017 76,R2=0.995 0),抗氧化能力以Trolox等價抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC)表示,即以單位質(zhì)量內(nèi)種皮干重所含Trolox當(dāng)量(Trolox equivalents,TE)表示,單位為mmol·g-1。

ABTS自由基陽離子清除活性的測定參考Re等[15]的方法。7 mmol·L-1ABTS和2.45 mmol·L-1K2S2O8水溶液避光放置16 h后,以去離子水為對照,用去離子水稀釋至734 nm吸光度為0.70±0.02。取70 μL稀釋后的樣品,加入2.93 mL ABTS溶液,混勻后避光反應(yīng)6 min,在734 nm測定吸光度。以去離子水作為對照,以Trolox為標(biāo)樣制定標(biāo)準曲線(y=1.299 82x-0.024 63,R2=0.985 6),抗氧化能力以TEAC表示,單位為mmol·g-1。

1.8 核桃內(nèi)種皮多酚提取物的UPLC-MS/MS分析

取1.5 mL核桃內(nèi)種皮多酚提取物加入2 mL離心管,真空濃縮后用甲醇配制成1 mg·mL-1的溶液,過0.22 μm微孔膜后進樣分析。

色譜條件:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)。柱溫為35 ℃。流動相(A)為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液,流動相(B)為乙腈,流速設(shè)定為0.3 mL·min-1,優(yōu)化后的梯度洗脫程序如下:0～25 min,5% B～100% B;25～30 min,100% B;30～30.01 min,100% B～5% B;30.01～35 min,5% B。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源正離子模式進行離子化。干燥氣流量800 L·h-1;干燥氣溫度400 ℃;離子源溫度120 ℃;碰撞能量:10～40 V,40～120 V;錐孔氣流量50 L·h-1。

1.9 多維變量統(tǒng)計分析

通過ProteoWizard將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式,利用MZmine 2.39軟件構(gòu)建色譜圖、進行解卷積、同位素峰聚集、色譜峰匹配,最終導(dǎo)出csv格式文件。通過MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和聚類熱圖分析[16]。

1.10 核桃仁分離蛋白的制備

根據(jù)王豐俊等[17]的方法,采用堿溶酸沉法提取核桃仁分離蛋白,并進行相應(yīng)調(diào)整。具體方法為準確稱量140.00 g脫脂核桃粉,將脫脂核桃粉與去離子水以1∶10(質(zhì)量體積比,g·mL-1)的比例混合,調(diào)節(jié)pH值為9.0,在37 ℃攪拌3 h后,離心(4 ℃,2 039×g,20 min)獲得上清液。將上清液pH值調(diào)節(jié)至5.5,室溫放置2 h后離心(4 ℃,3 186×g,10 min),獲取沉淀。用去離子水洗滌沉淀物呈中性,沉淀物冷凍干燥即得核桃仁分離蛋白,將淡黃色內(nèi)種皮核桃仁制備的核桃仁分離蛋白標(biāo)記為Z1,相應(yīng)地,淺琥珀色標(biāo)記為Z2,琥珀色標(biāo)記為Z3,儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.11 蛋白質(zhì)含量測定

采用Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品的蛋白質(zhì)濃度[18]。取0.25 g樣品,加入25 mL去離子水,調(diào)pH值至8.5,室溫攪拌30 min后離心(4 ℃,12 745×g,10 min)。取5 μL上清液于96孔板中,加入250 μL考馬斯亮藍染色液后,立即于595 nm測定吸光度。以標(biāo)準牛血清蛋白為標(biāo)樣制定標(biāo)準曲線(y=0.607 47x+0.048 2,R2=0.992 0)。蛋白質(zhì)含量以單位質(zhì)量樣品中所含的蛋白質(zhì)質(zhì)量表示,單位為mg·g-1。

1.12 核桃仁分離蛋白游離巰基含量測定

參考鄧欣倫等[19]的方法并進行適當(dāng)修改。以含86 mmol·L-1Tris、90 mmol·L-1甘氨酸、4 mmol·L-1EDTA,pH值為8.0的緩沖液為溶劑,分別配制4 mg·mL-1的DTNB溶液、2 mg·mL-1的核桃仁分離蛋白溶液。往2.5 mL核桃仁分離蛋白溶液中加入50 μL DTNB溶液,25 ℃恒溫振蕩1 h后離心(4 ℃,12 745×g)。取上清液,于412 nm測定吸光度。核桃仁分離蛋白中游離巰基含量計算方法見式(1)。

c0=75.53×D412×D/C。

(1)

式(1)中:c0為巰基含量(μmol·g-1);D412為樣品吸光度;C為離心后上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg·mL-1);D為稀釋因子(1.02)。

1.13 核桃仁分離蛋白的羰基含量測定

參考裴昊銘[20]的方法并進行適當(dāng)修改。配制6 mg·mL-1的核桃仁分離蛋白水溶液,調(diào)pH值至9.0,室溫振蕩1 h至完全溶解。用2 mol·L-1HCl溶液為溶劑配制10 mmol·L-1的DNPH溶液。取0.35 mL核桃仁分離蛋白溶液,加入1 mL DNPH鹽酸溶液,30 ℃保溫1 h后,加入450 μL體積分數(shù)40%的三氯乙酸,充分振蕩,靜置20 min后于4 ℃離心(5 533×g,30 min),去除上清液,保留沉淀。取1.5 mL乙醇-乙酸乙酯溶液(體積比1∶1)洗滌沉淀,重復(fù)3次。洗滌完畢后,加入1.5 mL 6 mol·L-1的鹽酸胍溶液,37 ℃保溫0.5 h,使沉淀物溶解。最終在370 nm測量吸光度?？扇苄院颂胰史蛛x蛋白的羰基含量計算方法見式(2)。

(2)

式(2)中:c1為羰基含量(μmol·g-1);D370為樣品吸光度;ε為摩爾消光系數(shù),22 mL·μmol-1·cm-1;B為比色光徑,1 cm;C為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

1.14 核桃仁分離蛋白的溶解性測定

稱取0.25 g核桃仁分離蛋白,加入25 mL去離子水,調(diào)節(jié)溶液pH值至8.5,將搖床調(diào)至適當(dāng)振幅,振蕩1 h。將該溶液放置于4 ℃靜置16 h,使之充分水合。在4 ℃條件下10 324×g離心30 min。采用Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.15 核桃仁分離蛋白的持水性與持油性測定

在50 mL離心管中準確稱0.75 g核桃仁分離蛋白,并記錄此時的離心管質(zhì)量m1與樣品質(zhì)量m2。將20 mL去離子水添加到離心管中,充分混合樣品。將離心管放在40 ℃恒溫水中30 min,充分吸收水分后,于4 ℃離心(3 186×g,20 min)。使用滴管吸棄上清液,記錄此時離心管質(zhì)量m3,按式(3)計算蛋白質(zhì)持水性。

準確稱取0.75 g核桃仁分離蛋白,與6 mL大豆油混勻,記錄樣品質(zhì)量m4與加入樣品后的離心管質(zhì)量m5。40 ℃恒溫水浴鍋靜置30 min,4 ℃離心(3 186×g,20 min),使用滴管吸棄上清液,稱重記錄此時離心管質(zhì)量m6,按式(4)計算蛋白質(zhì)持油性。

(3)

(4)

式(3)、(4)中:Chw為持水性(g·g-1);Cho為持油性(g·g-1)。

1.16 核桃仁分離蛋白的起泡能力、泡沫穩(wěn)定性測定

取20 mL 0.01 g·mL-1核桃仁分離蛋白溶液于50 mL離心管中,初始高度為H0。把超速分散器調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臋n位,對蛋白質(zhì)進行1 min的切割,測量泡沫高度H1。放置30 min,記錄泡沫高度H2。蛋白質(zhì)溶液起泡能力和泡沫穩(wěn)定性計算方法分別見式(5)和(6)。

(5)

(6)

式(5)和(6)中:Cf為起泡能力;Sf為泡沫穩(wěn)定性。

1.17 核桃仁分離蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性測定

參考孫敬敬[21]的方法并進行適當(dāng)修改。取10 mL 0.01 g·mL-1核桃仁分離蛋白溶液,加入5 mL大豆油,混合均勻,使用高速攪打機攪打1 min。將50 μL攪打后的溶液分散于5 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%的SDS溶液,充分混勻。于500 nm測定吸光度D0,30 min后再次測定吸光度D1。乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的計算公式分別為式(7)和式(8)。

(7)

(8)

式(7)與式(8)中:EAI為乳化活性(m2·g-1);ESI為乳化穩(wěn)定性(%);D0為0 min時吸光度;D1為30 min時的吸光度;N為稀釋倍數(shù)(100);c為核桃仁分離蛋白溶液的質(zhì)量濃度,g·mL-1;L為0.01 m光路;φ為分散系數(shù)(0.25)。

1.18 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設(shè)置3組平行實驗,實驗所得結(jié)果用平均值±標(biāo)準差表示,數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 8.0軟件進行分析和繪圖,同時使用SPSS 23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan檢驗進行顯著性分析,顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同色澤核桃仁的篩選

依據(jù)《核桃仁》(LY/T 1922-2010)規(guī)定,將核桃仁按照內(nèi)種皮色澤分為淡黃色、淺琥珀色和琥珀色3組。然后去除干癟霉變的核桃仁,選擇完整的核桃仁進行液氮急凍分離得到內(nèi)種皮和去皮核桃仁。將內(nèi)種皮冷凍干燥后進行脫脂處理得到脫脂內(nèi)種皮粉,將去皮核桃仁磨漿、脫脂,采用堿溶酸沉法提取核桃仁分離蛋白。成品如圖1所示。

A,淡黃色內(nèi)種皮組;B,淺琥珀色內(nèi)種皮組;C,琥珀色內(nèi)種皮組。縱行從左到右依次為核桃仁、核桃內(nèi)種皮、脫脂內(nèi)種皮粉、核桃仁分離蛋白。A, The light walnut pellicle group; B, The light amber walnut pellicle group; C, The amber walnut pellicle group. The longitudinal row from left to right are walnut kernel, walnut pellicle, defatted walnut pellicle powder, walnut kernel protein isolate.圖1 樣品的外觀形態(tài)Fig.1 Appearance of samples

2.2 核桃內(nèi)種皮酚類化合物含量與抗氧化能力

2.2.1 不同色澤內(nèi)種皮的多酚含量

采用溶劑浸提法提取內(nèi)種皮中總酚類化合物,結(jié)果如圖2所示,淡黃色內(nèi)種皮多酚含量為(308.49±13.43)mg·g-1,淺琥珀色內(nèi)種皮多酚含量為(296.86±4.95)mg·g-1,僅次于淡黃色內(nèi)種皮,琥珀色內(nèi)種皮多酚含量最低,為(271.19±16.32)mg·g-1。淡黃色內(nèi)種皮、淺琥珀色內(nèi)種皮多酚含量顯著(P<0.05)高于琥珀色內(nèi)種皮。這可能是因為隨著內(nèi)種皮顏色的加深,酚類物質(zhì)的氧化程度增加,從而導(dǎo)致內(nèi)種皮多酚含量降低,這與梁蓉等[22]的研究結(jié)果相符。此外,孫鵬程等[5]的研究也表明,內(nèi)種皮顏色越深,其種皮中多酚含量越少。

Z1、Z2、Z3分別為淡黃色內(nèi)種皮組、淺琥珀色內(nèi)種皮組、琥珀色內(nèi)種皮組。柱狀圖上方無相同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。Z1, Z2, and Z3 are the light walnut pellicle group, the light amber walnut pellicle group, the amber walnut pellicle group, respectively. Different lowercase letters above the columns represent significantly different (P<0.05). The same as below.圖2 不同色澤核桃內(nèi)種皮的多酚含量Fig.2 Polyphenols content in walnut pellicle with different colors

2.2.2 不同色澤內(nèi)種皮多酚抗氧化能力

淡黃色內(nèi)種皮的DPPH自由基清除活性的TEAC值為(5.53±0.38)mmol·g-1,顯著(P<0.05)高于淺琥珀色與琥珀色內(nèi)種皮(圖3)。ABTS自由基清除能力測定的結(jié)果趨勢與DPPH自由基清除活性相同,也是淡黃色內(nèi)種皮>淺琥珀色內(nèi)種皮>琥珀色內(nèi)種皮,且組間差異顯著(P<0.05)(圖3)?？梢?隨著核桃內(nèi)種皮顏色加深,核桃內(nèi)種皮多酚提取物的抗氧化活性顯著(P<0.05)下降,其原因可能是內(nèi)種皮多酚被氧化,導(dǎo)致多酚含量下降,從而影響其抗氧化活性。

圖3 不同色澤核桃內(nèi)種皮的DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性Fig.3 DPPH free radical scavenging activity and ABTS free radical scavenging activity of walnut pellicle with different colors

2.2.3 內(nèi)種皮多酚組成

核桃內(nèi)種皮多酚總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)如圖4所示。淡黃色、淺琥珀色、琥珀色核桃內(nèi)種皮多酚的峰形基本一致,但部分質(zhì)譜信號所對應(yīng)離子峰的相對豐度存在差異,表明3組內(nèi)種皮多酚的物質(zhì)組成有差異。

圖4 不同色澤核桃內(nèi)種皮多酚的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram spectra of polyphenols from walnut pellicles with different colors

通過主成分分析(PCA)與偏最小二乘判別分析(PLS-DA)進一步分析淡黃色、淺琥珀色、琥珀色3組核桃內(nèi)種皮多酚提取物中化合物的差異。由圖5-B與圖5-C可知,淡黃色內(nèi)種皮多酚的3個平行樣品與淺琥珀色內(nèi)種皮多酚的3個平行樣品聚集在一起,而與琥珀色內(nèi)種皮多酚的3個平行樣品明顯分開。這說明淡黃色與淺琥珀色內(nèi)種皮多酚物質(zhì)組成與琥珀色內(nèi)種皮多酚物質(zhì)組成存在差異。聚類熱圖是一種可視化的分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)分布的方法[16],能夠用顏色深淺表示各成分的豐度。制作聚類熱圖,分析核桃內(nèi)種皮多酚的組間差異,如圖5-A所示。9個樣品被分為3大類,且各成分在3組不同色澤內(nèi)種皮提取物中豐度存在差異,這表明淡黃色、淺琥珀色、琥珀色3組內(nèi)種皮多酚在物質(zhì)組成上存在差別。這與TIC、PCA和PLS-DA的結(jié)果相吻合。

A,聚類熱圖分析;B,PCA分析;C,PLS-DA分析;D,Z1組和Z2組火山圖;E,Z2組和Z3組火山圖;F,3種物質(zhì)的峰面積。A, Cluster heat map; B, PCA analysis; C, PLS-DA analysis; D, Volcano plot of group Z1 and group Z2; E, Volcano plot of group Z2 and group Z3; F, Peak area of 3 substances.圖5 不同色澤內(nèi)種皮多酚分析Fig.5 Analysis of polyphenols from walnut pellicles with different colors

火山圖可以用于展示組間顯著差異數(shù)據(jù),本研究通過將淡黃色與淺琥珀色、淺琥珀色與琥珀色進行兩兩比對,以P<0.05為條件篩選出3種顯著差異的化合物(圖5-D和圖5-E)。如圖5-F所示,這3種化合物的質(zhì)荷比(m:z)分別為792.597 5、147.075 6、127.039 0,推測這3種物質(zhì)分子式分別為C42H79N7O8、C5H10N2O3、C6H6O3。

2.3 不同色澤核桃仁分離蛋白氧化水平與理化性質(zhì)的差異

2.3.1 蛋白質(zhì)含量與氧化水平

為探究不同色澤核桃仁所提取的核桃仁分離蛋白純度的差異,分別測定脫脂核桃粉與核桃仁分離蛋白的蛋白質(zhì)含量,結(jié)果如圖6所示。不同色澤核桃仁提取出的脫脂核桃粉的蛋白質(zhì)含量并無顯著差異(P>0.05),但核桃仁分離蛋白的蛋白質(zhì)含量有顯著差異(P<0.05)。淡黃色組核桃仁分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為(974.20±66.35) mg·g-1,顯著(P<0.05)高于琥珀色組(圖6-B)?？梢?雖然不同色澤內(nèi)種皮核桃仁的脫脂蛋白粉蛋白質(zhì)含量差異不大,但相應(yīng)提取的核桃仁分離蛋白的純度有顯著性差異。這可能是由于隨著核桃內(nèi)種皮色澤加深,核桃蛋白氧化程度加深,溶解性下降,從而導(dǎo)致所提取的核桃仁分離蛋白含量下降。

圖6 脫脂核桃粉(A)和核桃仁分離蛋白(B)的蛋白質(zhì)含量Fig.6 Protein content of defatted walnut powder (A) and protein isolates of walnut kernel (B)

半胱氨酸殘基對氧化敏感,易發(fā)生相應(yīng)的修飾,因此,蛋白質(zhì)氧化的程度可以通過巰基含量來反映[23]。由圖7-A可知,琥珀色組核桃仁分離蛋白游離巰基含量為(11.28±1.51)μmol·g-1,顯著(P<0.05)低于淡黃色和淺琥珀色組。這可能是因為隨著內(nèi)種皮色澤增加,相應(yīng)蛋白質(zhì)氧化程度升高,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)展開,巰基被氧化成二硫鍵和不可逆的磺酸基,從而導(dǎo)致游離巰基含量降低[24]。在蛋白質(zhì)氧化損傷的研究中,羰基含量也經(jīng)常被用作蛋白質(zhì)氧化損傷的關(guān)鍵指標(biāo)[25]。由圖7-B可知,淡黃色和淺琥珀色組核桃仁分離蛋白的羰基含量沒有顯著差異(P>0.05),而琥珀色組核桃仁分離蛋白羰基含量為(4.61±0.13)μmol·g-1,顯著(P<0.05)高于淡黃色和淺琥珀色組,這與游離巰基的結(jié)果相符合。巰基和羰基含量的變化表明不同色澤內(nèi)種皮核桃仁提取的核桃仁分離蛋白的氧化程度存在差異,內(nèi)種皮色澤淺的核桃仁分離蛋白的氧化程度較低。

圖7 核桃仁分離蛋白的游離巰基含量和羰基含量Fig.7 Content of free sulfhydryl groups and carbonyl groups in protein isolates of walnut kernel

2.3.2 核桃仁分離蛋白的溶解性

核桃仁分離蛋白的溶解性是蛋白質(zhì)親水能力的重要指標(biāo),是蛋白質(zhì)持水性、乳化性和起泡能力等重要功能特性的基礎(chǔ)[26]。3組核桃仁分離蛋白溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別如圖8所示,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度越高,說明核桃仁分離蛋白的溶解性越好。琥珀色組核桃仁分離蛋白溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為(7.23±1.15)mg·mL-1,顯著低于淡黃色組[(10.31±0.60)mg·mL-1]與淺琥珀色組[(9.78±0.53)mg·mL-1](P<0.05)。雖然核桃經(jīng)過了去皮處理,但核桃仁中仍有部分酚類物質(zhì)。這些酚類物質(zhì)有的來自核桃仁本身,有的則是因為核桃仁的特殊構(gòu)造,難以完全將內(nèi)種皮剝脫干凈,而有極少量殘留引入[9]。推測在堿溶酸沉提取核桃仁分離蛋白的過程中,琥珀色組核桃仁中的酚類物質(zhì)在有氧堿性條件下氧化成醌類物質(zhì),與核桃仁分離蛋白發(fā)生共價相互作用,從而形成了顆粒較大、不溶解的復(fù)合物,而導(dǎo)致核桃仁分離蛋白的溶解性較差[10]。此外,不同內(nèi)種皮色澤核桃仁提取的核桃仁分離蛋白的氧化程度不同,其蛋白質(zhì)的構(gòu)象也不相同,這也會對溶解性造成影響。

圖8 核桃仁分離蛋白的溶解性Fig.8 Solubility of protein isolates of walnut kernel

2.3.3 核桃仁分離蛋白的持水性與持油性

持水性、持油性是評價核桃仁分離蛋白功能特性的重要指標(biāo)。如圖9-A所示,淡黃色和淺琥珀色組核桃仁分離蛋白的持水力分別為(3.07±0.19)、(2.98±0.11)g·g-1,均顯著(P<0.05)高于琥珀色組。核桃仁分離蛋白與核桃仁中多酚相互作用形成不溶性聚集體,減弱蛋白質(zhì)與水的相互作用,導(dǎo)致持水性降低,這也與溶解度的結(jié)果相符合[27]。如圖9-B所示,淡黃色組核桃仁分離蛋白的持油力為(5.67±4.65)g·g-1,顯著(P<0.05)高于淺琥珀色組和琥珀色組。這可能是因為不同色澤核桃仁提取的核桃仁分離蛋白溶解性存在差異,進而導(dǎo)致其持油性降低。這與岳鑫[28]的研究結(jié)果相似。當(dāng)紅松種鱗多酚的添加量增加時,蛋白質(zhì)的溶解性降低,從而導(dǎo)致其與脂質(zhì)結(jié)合的能力也下降,進而導(dǎo)致乳清蛋白持油性降低。

圖9 核桃仁分離蛋白的持水性(A)和持油性(B)Fig.9 Water holding capacity (A) and oil holding capacity (B) of protein isolates of walnut kernel

2.3.4 核桃仁分離蛋白的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性

核桃仁分離蛋白起泡能力與泡沫穩(wěn)定性如圖10所示。由圖10-A可知,淡黃色組核桃仁分離蛋白的起泡能力顯著(P<0.05)高于淺琥珀色組和琥珀色組。這可能是因為核桃仁分離蛋白與核桃仁中多酚相互作用形成不溶性聚集體,導(dǎo)致溶液的液相界面張力變大,從而使核桃仁分離蛋白起泡能力下降。此外,因為淡黃色內(nèi)種皮中多酚氧化程度低,核桃仁分離蛋白中酚類物質(zhì)含量相對較高,這些酚類物質(zhì)在一定程度上可能提高核桃仁分離蛋白的起泡能力[27]。由圖10-B可知,3組不同蛋白的泡沫穩(wěn)定性并無顯著性差異(P>0.05)。這可能是因為盡管3種核桃仁分離蛋白溶液經(jīng)過攪打,但其形成的泡沫表面強度和剛性較為相似。

圖10 核桃仁分離蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性Fig.10 Foaming property and foam stability of protein isolates of walnut kernel

2.3.5 核桃仁分離蛋白的乳化活性與乳化穩(wěn)定性

不同核桃仁分離蛋白的乳化能力如圖11-A所示。琥珀色組核桃仁分離蛋白具有較好的乳化能力,為(27.99±2.12)m2·g-1,顯著高于淺琥珀色組(P<0.05)。雖然核桃仁分離蛋白乳化活性與其溶解度密切相關(guān),溶解度高的蛋白乳化活性應(yīng)該更好,但蛋白質(zhì)粒徑、溫度、分子柔性等方面均可能對核桃仁分離蛋白乳化活性產(chǎn)生影響[29]。琥珀色組蛋白乳化活性較高,可能是因為其核桃仁分離蛋白氧化程度高,由于巰基氧化形成的二硫鍵導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子共價交聯(lián)而形成大分子聚集體,更易結(jié)合到油-水界面形成穩(wěn)定的蛋白膜[30]。核桃仁分離蛋白乳化穩(wěn)定性如圖11-B所示,3組核桃仁分離蛋白的乳化穩(wěn)定性有顯著性差異(P<0.05),且琥珀色組>淺琥珀色組>淡黃色組。其原因可能在于琥珀色組核桃仁分離蛋白中有更多的大分子聚集體,能夠有效地阻止油脂聚集,提高了蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性[30]。

圖11 核桃仁分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.11 Emulsification and emulsification stability of protein isolates of walnut kernel

3 結(jié)論

不同色澤核桃仁的內(nèi)種皮酚類化合物含量、組成與抗氧化活性存在差異。隨著核桃仁內(nèi)種皮色澤的加深,內(nèi)種皮提取物中總酚含量、DPPH和ABTS自由基清除能力都顯著降低,其原因可能是因為隨著內(nèi)種皮顏色的加深,酚類物質(zhì)的氧化程度增加,從而導(dǎo)致物質(zhì)組成發(fā)生改變,多酚含量和抗氧化能力降低。此外,不同色澤核桃仁分離蛋白的氧化程度與理化性質(zhì)存在差異。淡黃色和淺琥珀色核桃仁提取出的蛋白質(zhì)氧化程度較琥珀色低,淡黃色內(nèi)種皮核桃仁分離蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性與泡沫穩(wěn)定性顯著優(yōu)于琥珀色,而琥珀色內(nèi)種皮核桃仁分離蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性顯著優(yōu)于淡黃色與淺琥珀色?？傊?不同色澤內(nèi)種皮核桃仁中營養(yǎng)物質(zhì)的組成和性質(zhì)存在差異,這對科學(xué)分級核桃仁和合理開發(fā)利用不同色澤核桃仁提供了理論基礎(chǔ)。但本研究只關(guān)注了單一品種的核桃,后續(xù)研究需要增加核桃品種,進一步明確核桃仁內(nèi)種皮色澤與核桃仁中的油脂、多糖、維生素等更多營養(yǎng)物質(zhì)的相關(guān)性,這對不同等級核桃仁的差異化開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。