單克隆接種／成像設(shè)備VIPS在CHO工程細胞株單克隆篩選中的應(yīng)用

謝濤，彭秀娥，孫青，張朝，陳文燁，張寬

石藥集團巨石生物制藥有限公司石藥集團新型藥物制劑與輔料國家重點實驗室，河北 石家莊 050000

近年，重組蛋白類藥物成為多種疾病的有效治療手段［1-2］。工程細胞株開發(fā)是重組蛋白類藥物開發(fā)的基礎(chǔ)，對蛋白類藥物的安全性和有效性具有較大影響。工程細胞株的單克隆源性指用于制備產(chǎn)品的細胞要求來源于同一祖細胞，是影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵因素，獲取工程細胞株單克隆源性的證明是藥物研發(fā)整體控制策略的關(guān)鍵步驟［3-4］。傳統(tǒng)單克隆篩選采用有限稀釋法，克隆形成率較低，為確保獲得足夠的候選克隆，每次實驗均需接種30～50塊96孔板，且進行連續(xù)2輪篩選，工作量極大［5-8］。采用單克隆篩選儀器ClonePix 并基于半固體培養(yǎng)基進行單克隆挑選可提高克隆形成率，但也需進行連續(xù)2 輪篩選或另加1 輪有限稀釋法篩選亞克隆，才可提供充分的單克隆源性證明，耗時較長（6～8 個月）［9-11］，無法滿足目前新藥研發(fā)進度。流式細胞分選、單細胞打印機等聯(lián)用單克隆成像系統(tǒng)的單克隆篩選方法可有效縮短細胞株開發(fā)時間，提高單克隆篩選的合規(guī)性［12-16］。近期推出的單細胞光導(dǎo)系統(tǒng)Beacon 和英國Solentim 公司生產(chǎn)的單克隆接種／成像設(shè)備VIPS（Verified In-situ Plate Seeding）實現(xiàn)了單克隆接種、拍照一體化，可在短期內(nèi)獲得單克隆細胞株，并能提供有效的單克隆源性證明［17-20］。

VIPS 可在小于1 psi 的壓力下進行單細胞接種，但由于不同細胞株對接種壓力的耐受及生長培養(yǎng)基的適應(yīng)性不同，導(dǎo)致克隆形成率存在較大差異，為獲得足夠的候選克隆，需針對細胞株進行單克隆生長培養(yǎng)基組合優(yōu)化。在克隆篩選過程中，單克隆源性照片是項目合規(guī)性的關(guān)鍵證據(jù)，不同品牌96 孔板結(jié)構(gòu)上的輕微差異可導(dǎo)致拍照時光學(xué)折射率不同，出現(xiàn)重影、模糊、拼接偏差等現(xiàn)象，尤其在板孔邊緣尤為明顯，需在確定96 孔板型號的前提下摸索最適培養(yǎng)基添加體積，達到最佳拍照效果。本研究以CHO來源的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞池為研究對象，對不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑組合進行優(yōu)化，并通過調(diào)整單細胞培養(yǎng)基體積，提高克隆形成率，確保單克隆成像清晰。以期建立應(yīng)用VIPS 進行CHO 工程細胞株單克隆篩選的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同目的基因的CHO 工程細胞池Cell pool 1、Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4均由石藥集團巨石生物制藥有限公司制備，均于液氮中保存。

1.2 主要試劑及儀器 CD CHO Medium購自美國Gibco公司；L-蛋氨酸亞砜酰亞胺（L-methionine sulfoximine，MSX）購自美國Sigma公司；MediumⅠ、MediumⅡ、Supplement a、Supplement b及Supplement c均為市售產(chǎn)品；單克隆接種／成像設(shè)備VIPS購自英國Solentim公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將Cell pool 1 于37 ℃水浴中快速解凍復(fù)蘇，用含50 μmol／L MSX 的CD CHO Medium 重懸，200 ×g離心5 min；棄上清，再次重懸，按0.3 ×106個／mL 的密度接種至30 mL 含50 μmol／L MSX的CD CHO Medium中，移至125 mL搖瓶，于37 ℃，5%CO2環(huán)境下，120 r／min 搖床培養(yǎng)，每3～4 d 進行細胞傳代，傳代接種密度為（0.2～0.3）×106個／mL。細胞傳代培養(yǎng)至少2～3 次，細胞活率≥95%時用于后續(xù)試驗。

1.4 CHO 工程細胞株單克隆篩選方法的建立 將Cell pool 1 密度調(diào)節(jié)至（1.0～1.4）× 104個／mL，取2.5 mL 加至VIPS 的細胞池中，啟動設(shè)備的單細胞接種程序，將單細胞接種至載有不同組合及體積（見表1）培養(yǎng)基的96 孔板中，隨后VIPS 進行拍照，并按下式計算單克隆接種率；于接種后2h及7、10 和14 d 再次拍照，記錄96 孔板中細胞圖像，作為單克隆源性證明，并按下式計算克隆形成率及變異系數(shù)（CV），根據(jù)圖像信息，生成細胞增殖曲線，由細胞增殖曲線斜率和峰值的差異獲得單克隆增殖速率。

表1 單克隆生長培養(yǎng)基的組合及體積Tab.1 Combinations and volume of monoclonal growth medium

1.5 CHO工程細胞株單克隆篩選方法適用性的驗證將Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4 按1.4 項方法傳代，細胞密度均調(diào)節(jié)為（1.0～1.4）× 104個／mL，取2.5 mL，加至VIPS 細胞池，采用最佳單克隆生長培養(yǎng)基組合及體積進行單克隆接種和培養(yǎng)，統(tǒng)計單克隆接種率、克隆形成率、單克隆增殖速率，并評價單克隆圖像效果。

2 結(jié)果

2.1 CHO工程細胞株單克隆篩選方法的建立

2.1.1 單克隆接種率 1～18 號Cell pool 1 的單克隆接種率均值為78%，標(biāo)準(zhǔn)差為5%，CV為6%，見表2。表明不同培養(yǎng)基的接種率穩(wěn)定。

表2 Cell pool 1單克隆接種率統(tǒng)計表Tab.2 Statistics of monoclonal inoculation rate of Cell pool 1

2.1.2 克隆形成率 1～8、17和18號培養(yǎng)條件下Cell pool 1 未觀察到克隆形成，9～16 號可觀察到克隆形成，表明MediumⅠ、CD CHO Medium 及含添加劑的CD CHO Medium 組合培養(yǎng)基不適合該細胞株的單克隆生長，確定MediumⅡ為最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基MediumⅡ（78%）比較，添加Supplement a的組合培養(yǎng)基培養(yǎng)Cell pool 1的克隆形成率均值（43%）下降45%，添加Supplement b 和Supplement c 的克隆形成率均值（85%和79%）分別上升9%和2%。見表3。

表3 Cell pool 1克隆形成率統(tǒng)計表Tab.3 Statistics of clone formation rate of Cell pool 1

2.1.3 單克隆增殖速率 與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組MediumⅡ比較，添加Supplement a和Supplement b的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的增殖速率提高，且細胞數(shù)量增加2 倍以上；添加Supplement c的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞增殖數(shù)量變化較小，部分孔板圖像見圖1。表明Supplement a 和Supplement b 添加劑與基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合均可大幅提高細胞的增殖速率，但添加Supplement a使克隆形成率下降45%（2.1.2 項結(jié)果）；添加Supplement b 的孔底雜質(zhì)較多，無法獲得清晰的單克隆源性圖像證明。因此，兩者均不能作為添加劑用于單克隆細胞篩選。根據(jù)上述結(jié)果確定單獨使用MediumⅡ為最適單克隆生長培養(yǎng)基。

圖1 Cell pool 1部分單克隆培養(yǎng)板的圖像展示Fig. 1 Image display of part monoclonal culture plates of Cell pool 1

2.1.4 單克隆圖像效果 接種后2h及7、10 和14 d的細胞單克隆源性圖像顯示，培養(yǎng)基體積為200 μL／孔的細胞單克隆源性圖像有重影現(xiàn)象，100 μL／孔的圖像效果明顯好轉(zhuǎn)，見圖2。100 及200 μL／孔接種克隆形成率均值分別為72%（9、11、13、15號）和70%（10、12、14、16號），表明兩種接種體積對細胞增殖的影響較小。確定最佳培養(yǎng)體積為100 μL／孔。

圖2 不同培養(yǎng)基體積培養(yǎng)細胞的成像效果比較Fig. 2 Comparison of imaging effects of cells in different medium volumes

2.2 CHO工程細胞株單克隆篩選方法適用性的驗證

2.2.1 單克隆接種率 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4 單克隆接種率均值為78%，標(biāo)準(zhǔn)差為2%，CV為2%，表明不同細胞池單克隆接種率穩(wěn)定，見表4。

表4 不同細胞池的單克隆接種率Tab.4 Clone inoculation rate of different cell pools

2.2.2 克隆形成率 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4 克隆形成率均值為67%，標(biāo)準(zhǔn)差為3%，CV為5%，表明不同細胞池克隆形成率穩(wěn)定，見表5。

表5 不同細胞池的克隆形成率Tab.5 Clone formation rate of different cell pools

2.2.3 單克隆增殖速率 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4細胞均能正常增殖，增殖速率略有差異。部分孔板圖像見圖3。

圖3 接種不同細胞池孔板的細胞增殖情況Fig. 3 Proliferation of cells in well plates inoculated with different cell pools

2.2.4 單克隆圖像效果 Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4均可觀察到完整的細胞由1個分裂成2個，2個分裂成4 個，直至呈現(xiàn)細胞群的清晰圖像。單克隆細胞分裂增殖過程見圖4。

圖4 單克隆細胞分裂增殖過程Fig.4 Process of monoclonal cell division and proliferation

3 討論

人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）Q5D指出，生產(chǎn)重組產(chǎn)品的細胞克隆應(yīng)為源自一個祖細胞且含有所需序列的轉(zhuǎn)染細胞。工程細胞株的單克隆源性關(guān)系到產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定性，因此，生產(chǎn)用工程細胞株的單克隆源性受到監(jiān)管機構(gòu)的高度重視［21-23］。本研究通過調(diào)整孔板培養(yǎng)體積，可獲得清晰的單克隆源性影像證據(jù)，滿足監(jiān)管機構(gòu)的要求。前期試驗研究發(fā)現(xiàn)，每孔添加150、180、200 μL 的單克隆生長培養(yǎng)基，在孔邊緣細胞均出現(xiàn)重影，而添加100 μL 時重影現(xiàn)象明顯減少或消失。本研究也發(fā)現(xiàn)，每孔培養(yǎng)體積由200 μL 改為100 μL 后，孔底重影區(qū)域變小，即使細胞處于重影區(qū)域，重影現(xiàn)象也并不明顯，能夠達到分辨單細胞的要求。但100 μL 的體系較小，在孔板培養(yǎng)過程中需密切關(guān)注環(huán)境濕度，避免出現(xiàn)因培養(yǎng)基過量蒸發(fā)導(dǎo)致體系滲透壓升高，從而出現(xiàn)細胞死亡的情況。

培養(yǎng)基成分決定了細胞的生長環(huán)境，直接影響細胞的生長、蛋白的產(chǎn)量及質(zhì)量，培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化廣泛應(yīng)用于工程細胞株生產(chǎn)的各階段［24-25］。本研究針對單個細胞體外培養(yǎng)不易生長的特點，優(yōu)化了多種單克隆生長培養(yǎng)基組合，結(jié)果表明，單克隆生長培養(yǎng)基對單個細胞生長狀態(tài)影響顯著，Medium Ⅱ與Supplement b組合既能提高克隆形成率又能提高單克隆增殖速率，但孔底雜質(zhì)較多，無法獲得清晰的單克隆源性圖像證明，嘗試增加37 ℃混勻時間及采用0.22 μm濾膜過濾等方式均未能解決板底雜質(zhì)多的問題（未發(fā)表）。推測原因可能為兩種試劑中部分成分產(chǎn)生反應(yīng)形成沉淀，該問題有待進一步研究解決。在采用MediumⅡ進行單克隆接種時發(fā)現(xiàn)，少量細胞在接種后出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，細胞培養(yǎng)7 d 后，該現(xiàn)象逐漸消失。這種現(xiàn)象可能與MediumⅡ成分有關(guān)，今后將通過改變MediumⅡ濃度、更換96孔板材質(zhì)等方法進一步優(yōu)化。

綜上所述，本研究建立了使用VIPS進行工程細胞株單克隆篩選的方法，并在不同細胞池中進行了驗證，單克隆接種率和克隆形成率均穩(wěn)定，且單克隆源性圖像效果清晰，可滿足監(jiān)管機構(gòu)的要求。本研究為單克隆篩選過程中出現(xiàn)的問題提供了新的解決思路。