三組遺傳全雄尼羅羅非魚與吉富羅非魚的養(yǎng)殖性狀及雄性率比較

摘 要：為篩選子代生長快、成活率高、雄性率高的親本組合，以選育獲得的3個YY型超雄尼羅羅非魚家系為父本，以吉富羅非魚為母本，繁育獲得了全雄尼羅羅非魚苗種。對3個遺傳全雄群體（A、B、C）與其母本吉富群體進行了養(yǎng)殖對比試驗，并分別采用壓片法、分子標記檢測等方法對生理性別、遺傳性別進行鑒定，評估各群體間的養(yǎng)殖性狀差異，統(tǒng)計雄性率。試驗結(jié)果顯示，3個遺傳全雄群體的平均體質(zhì)量比吉富群體高17.39 g，遺傳全雄群體的生長速度均顯著快于吉富群體（P＜0.05），其中C群體的生長速度比吉富群體快21.21%；3個遺傳全雄群體的雄性率在99%～100%，平均雄性率為99.54%，高于吉富群體的雄性率（56.34%）。試驗結(jié)果表明，3個遺傳全雄群體的雄性率均能滿足羅非魚全雄養(yǎng)殖需求，其中遺傳全雄C群體的生長速度最快，可作為主要組合用于全雄羅非魚苗種的規(guī)模化繁育，具有較高的推廣價值。

關(guān)鍵詞：尼羅羅非魚；全雄；超雄；生長；雄性率

羅非魚是世界性的養(yǎng)殖魚類，同時也是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦的優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖對象［1］，具有生長快、食性雜、抗病力強、易加工且對水質(zhì)要求比較低等優(yōu)點，適合于池塘、水庫、網(wǎng)箱、流水、工廠化等各種養(yǎng)殖模式。在所有羅非魚養(yǎng)殖種類中，尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的生長速度最快。據(jù)2022年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國羅非魚的總產(chǎn)量達到173.9萬t，在淡水養(yǎng)殖魚類中位列第6，其中尼羅羅非魚占據(jù)了大部分產(chǎn)量［2］。

雌、雄羅非魚在生長速度上存在明顯差異，雄性個體的生長速度比雌性個體快40%～50%［3-4］。因此，生產(chǎn)上廣泛采用全雄養(yǎng)殖方法以提升產(chǎn)量和效益。通過人工干預(yù)獲得尼羅羅非魚全雄苗種進行養(yǎng)殖，不僅可以提高其生長速度和增重率，還能有效減少飼料成本、縮短養(yǎng)殖周期，具有重要的研究意義和廣闊的市場前景。

目前，有關(guān)人工控制手段培育單性苗種的方法已有較多研究報道。生產(chǎn)全雄羅非魚苗種的方法主要有4種：（1）性逆轉(zhuǎn)方法。利用雄性激素直接誘導(dǎo)實現(xiàn)全雄魚的生產(chǎn)［5］。但該方法對激素用量的控制具有較高的要求，過量使用可能造成死亡率過高［6］，且容易因為激素代謝不完全而導(dǎo)致激素殘留［7］。目前甲睪酮（Methyltestosterone）等激素類藥物已被歐盟和我國列為禁藥［8］。（2）高溫誘導(dǎo)方法。通過對羅非魚魚苗在性別決定的關(guān)鍵時期進行高溫處理，可以獲得較高的雄性比例。但該方法誘導(dǎo)的雄性比例不穩(wěn)定，而且會增加致病風(fēng)險［9］。（3）種間雜交方法。通過對尼羅羅非魚雌魚（XX基因型）與奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）雄魚（ZZ基因型）進行雜交，獲得ZX基因型的全雄后代，雄性率可達95%［10］；尼羅羅非魚與荷那龍魚（Hornorum Tilapia）進行雜交的后代雄性率可達98%以上［11］。然而，該方法要求純系親本進行雜交，其雜交后代的生長速度略慢，且雄性比例不穩(wěn)定［12］。（4）三系配套法。該方法又稱超雄魚技術(shù)，即先繁育獲得具有YY基因型的超雄個體，與雌性化的YY雌性個體配組進行超雄魚批量繁育，再以YY超雄魚為父本、XX雌性為母本進行繁育，獲得的XY型遺傳全雄子代的雄性率可達99.58%［13］。三系配套法雖然耗時較長，且工作量較大，但產(chǎn)出的全雄苗種不含激素，也不需要再經(jīng)過激素處理，可直接用于商業(yè)化養(yǎng)殖，因而是全雄羅非魚苗種生產(chǎn)的主要趨勢之一［14］。

盡管采用超雄魚為父本可進行遺傳全雄苗種的大規(guī)模繁育，但前期的研究結(jié)果表明，不同超雄家系繁育所獲得的子代存在生長速度和雄性率的差異。因此，為篩選適宜的親本組合用于遺傳全雄苗種的推廣，本研究對3組遺傳全雄尼羅羅非魚及其母本群體吉富羅非魚進行了養(yǎng)殖試驗，并對各群體的生長性狀、成活率以及雄性率等指標進行了比較。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用超雄尼羅羅非魚親本為上海市水產(chǎn)研究所通過選育獲得，吉富羅非魚為上海市水產(chǎn)研究所保存的GIFT品系尼羅羅非魚經(jīng)過多代選育的后代［5］。上海市水產(chǎn)研究所選育的超雄群體由多個家系組成，以不同的雌性化的XY個體為母本、普通XY個體為父本進行一對一配組繁育獲得，先通過性別特異性分子標記篩選獲得YY超雄尼羅羅非魚，再對YY超雄魚進行雌性化誘導(dǎo)、規(guī)?；庇投啻x育［5］。以不同YY超雄家系為父本繁育獲得的遺傳全雄子代，其生長速度和雄性率稍有差異。本研究在選育的超雄尼羅羅非魚群體中，選擇3個生長快、子代雄性率高的超雄家系（體質(zhì)量為750～1 000 g/尾的2齡雄魚）作為父本，以吉富羅非魚群體中體質(zhì)量為600～800 g/尾的2齡雌魚作為母本進行配組。

1.2 試驗設(shè)計

2022年6月中旬，分別以3個YY型超雄尼羅羅非魚家系為父本，吉富羅非魚為母本繁育獲得遺傳全雄子代，分別編號為A群體、B群體、C群體。

將全雄子代于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中培育至全長達3～4 cm后，分別投放于同一口室外池塘的3個網(wǎng)箱中，另選1個網(wǎng)箱放養(yǎng)普通吉富羅非魚作為對照群體，每個網(wǎng)箱放養(yǎng)試驗魚150尾。各網(wǎng)箱的養(yǎng)殖條件完全一致，采取定時、定量、定點的方式每日人工拋投配合飼料，并觀察試驗魚攝食情況。飼料選用天邦飼料公司的精養(yǎng)淡水魚4號料，其粗蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維質(zhì)量分數(shù)分別為31%、3%、10%。每日投喂2次，9：00和16：00各1次。日投飼量為魚體質(zhì)量的1%～3%，確保每次投喂后無殘余飼料。定時啟動池塘內(nèi)的增氧機進行增氧，確保水體溶解氧充足。

在放苗50 d后，即7月底，將4個網(wǎng)箱中的試驗魚全部起捕。由于在養(yǎng)殖試驗過程中有少量個體死亡，4個群體共計捕獲574尾魚，其中遺傳全雄A群體144尾，遺傳全雄B群體140尾，遺傳全雄C群體148尾，吉富群體142尾。

1.3 采樣和測量

1.3.1 體質(zhì)量、全長測量

對4個群體共計574尾試驗魚樣本全部進行常規(guī)生物測量。魚體全長使用游標卡尺進行測量（精確至0.1 mm），體質(zhì)量使用電子天平進行測定（精確至0.01 g）。

1.3.2 生理性別鑒定

首先采用生殖孔外觀觀察法對全部樣本進行雌、雄個體生理性別鑒定。觀察生殖孔尖端突起形狀，并確認開口數(shù)量。通常雄性生殖孔突起頂端較尖，輸精管與輸尿管共用一個開口（見圖1-a）；雌性生殖孔突起頂端較圓，隱約可見其上有橫向的開口，產(chǎn)卵管與輸尿管各有一個開口（見圖1-b）。

隨后采用性腺形態(tài)觀察法進行鑒別。為進一步確認試驗魚的性別，將魚體沿腹部進行解剖后，可見位于魚類腹腔背部的性腺組織，用鑷子將之輕輕挑起，觀察性腺形態(tài)結(jié)構(gòu)。通常雄性個體性腺早期小而細，呈半透明的白色，背面有毛細血管；雌性個體性腺較粗，偶爾可見顆粒狀的卵母細胞。

無法通過性腺形態(tài)辨別的個體采用醋酸洋紅染色壓片法進行鑒定。將已進行腹腔解剖的個體，使用鑷子和剪刀小心取出性腺組織，并將其置于干凈的載玻片上，然后，向載玻片上滴加2～3滴5%（體積分數(shù)）的冰醋酸溶液，靜置30 s，直至性腺變成乳白色。隨后，將性腺轉(zhuǎn)移到滴有50 μL醋酸洋紅染色液的載玻片上，并滴入50 μL結(jié)晶紫染色液，靜置3～5 min后，蓋上蓋玻片，輕輕擠壓將性腺組織壓平以便于觀察。將載有性腺組織的載玻片放到顯微鏡下，于4倍模式下觀察并拍照。通常在顯微鏡下觀察到的性腺形態(tài)：雄性性腺，即精巢內(nèi)精原細胞成簇緊密堆積在一起，細胞間的間隔不明顯，呈現(xiàn)團霧狀（見圖1-c）；雌性性腺，即卵巢，可清晰地觀察到圓形的卵母細胞，細胞體積較大，細胞之間有明顯的間隔區(qū)分，邊緣清晰（見圖1-d）。

1.3.3 分子標記法驗證遺傳性別

每一群體隨機抽取10尾樣本，剪取尾鰭組織固定于95%（體積分數(shù)）的乙醇溶液中，置于4 ℃冰箱48 h后，更換95%乙醇溶液，隨后凍存于-80 ℃冰箱中備用。使用天根生化科技（北京）有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取后的DNA使用微量分光光度計（奧盛，Nano-300，中國）測量濃度。稱取適量瓊脂糖粉末［生工生物工程（上海）股份有限公司］置于錐形瓶中，加入稀釋50倍的TAE溶液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，放置于微波爐中加熱3 min，待粉末完全溶解后，滴入9 μL核酸染料［生工生物工程（上海）股份有限公司］，混勻后倒入電泳池內(nèi)，冷卻40 min后，即制備成1.5%瓊脂糖凝膠液，用于檢測DNA質(zhì)量。檢測完成后，將DNA樣本凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)試驗。

性別特異性分子標記引物為實驗室前期開發(fā)（F：TCTACCATCGCAGAGTCCAGCA，R：GGGACACGGAGGTAACAAAC）。

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）使用T100普通PCR儀［伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］進行，擴增體系為25 μL，使用Takara公司生產(chǎn)的Ex Taq酶試劑盒進行配制，包括：Ex Taq酶0.125 μL，10×Ex Taq buffer（緩沖液）2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加入合適體積的DNA模板，隨后加入無酶水至25 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共31個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。之后將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，成像后分析片段長度，鑒定XX個體。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。對4個群體生長性狀進行分析，并采用單因素方差分析方法（one-way ANOVA）進行顯著性分析，設(shè)顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

存活率為試驗魚存活數(shù)占放養(yǎng)總數(shù)的百分比。雄性率為雄性個體數(shù)量與總個體數(shù)量的百分比。

2 結(jié)果

2.1 四個群體養(yǎng)殖情況比較

由表1可見，3個遺傳全雄群體（A、B、C）的體質(zhì)量在120.19～132.16 g，平均體質(zhì)量為126.42 g，平均全長為17.41 cm；吉富群體的平均體質(zhì)量為109.03 g，平均全長為16.30 cm。分析結(jié)果顯示，3個遺傳全雄群體的體質(zhì)量均顯著高于吉富群體（Plt;0.05），而各遺傳全雄群體間差異不顯著（P＞0.05）。3個遺傳全雄群體（A、B、C）的生長速度均顯著快于吉富群體，分別快10.24%、16.39%和21.21%（P＜0.05）。4個群體的存活率在93.33%～98.67%，群體間沒有顯著差異（P＞0.05），但其中遺傳全雄C群體的存活率最高，達到98.67%。

2.2 四個群體性別鑒定方式的占比

不同性別鑒定方式在各群體的占比情況見圖2。其中，約90%的個體可以通過直接觀察法鑒定生理性別，而約有10%相對較小且性腺特征不明顯的個體，需使用壓片法進行鑒定。

2.3 遺傳性別的分子鑒定

對來自4個群體的共40個樣本進行分子標記鑒定，結(jié)果顯示，抽檢的3個遺傳全雄群體的樣本均出現(xiàn)X條帶及Y條帶，其遺傳性別均為“XY”型；而對照組的吉富群體樣本僅顯示X條帶或同時顯示X、Y條帶，分別代表遺傳性別為“XX”或“XY”型（見圖3）。

2.4 雄性率比較

4個群體的雄性率統(tǒng)計情況見表2。結(jié)果顯示，3個遺傳全雄群體的平均雄性率為99.54%，遠高于吉富群體的雄性率（56.34%）。

3 討論

3.1 遺傳全雄尼羅羅非魚生長性狀

生長速度是魚類的重要性狀之一，其表現(xiàn)直接影響魚類養(yǎng)殖周期的長短和養(yǎng)殖效益。本試驗選用的超雄尼羅羅非魚親本經(jīng)多代選育，而吉富羅非魚親本為上海市水產(chǎn)研究所保存的GIFT品系，該品系在前期的研究中表現(xiàn)出優(yōu)異的生長性狀。在前期的研究中，本實驗室繁育的遺傳全雄尼羅羅非魚苗種（全長2～3 cm），經(jīng)100 d的池塘養(yǎng)殖后平均體質(zhì)量達到559.00 g［5］。本試驗中，遺傳全雄尼羅羅非魚苗種（全長3～4 cm）經(jīng)50 d的網(wǎng)箱養(yǎng)殖后平均體質(zhì)量達到了126.42 g。遺傳全雄群體的生長速度顯著快于吉富群體，其整體平均體質(zhì)量比吉富群體高17.39 g，其中遺傳全雄C群體的生長速度最快，比吉富普通群體快21.21%，且該群體存活率最高，達到98.67%。總的來說，遺傳全雄C群體表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢，可作為主要組合用于全雄羅非魚苗種的規(guī)?；庇钥s短養(yǎng)殖周期，降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。

3.2 遺傳全雄尼羅羅非魚的雄性率

羅非魚的雄性率是評估全雄苗種優(yōu)劣的重要指標。在20世紀80—90年代，種間雜交和雄性激素處理是生產(chǎn)單雄性羅非魚苗種的研究熱點。有研究表明，尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚雜交后可獲得生長速度較快的尼奧羅非魚，但這種方法雄性率不穩(wěn)定，通常在93.0%～97.8%［14-15］。使用外源雄激素甲睪酮處理后的羅非魚，其雄性率在83%～100%，但甲睪酮暴露于自然水域所形成的環(huán)境雄激素難以降解，且殘留時間長，對水生生物的正常發(fā)育和生殖過程會造成不利影響［16-18］。因此，超雄魚技術(shù)成為最具前景的羅非魚全雄苗種繁育技術(shù)之一。1980年，研究人員利用超雄魚技術(shù)獲得了莫桑比克超雄羅非魚，其子代雄性率達到了100%，但生長速度相對較慢［19］。1997年，研究人員將尼羅羅非魚的性逆轉(zhuǎn)技術(shù)與雜交選育技術(shù)相結(jié)合，培育出了可育的YY雄魚，其子代雄性率為95.6%［20］。研究表明，使用GIFT衍生品系繁育的超雄羅非魚，3個子代群體的雄性率為94.1%～99.6%［21］。本研究中，3個遺傳全雄群體的雄性率均達99%以上。同時，采用性別特異性分子標記對3個遺傳全雄群體和吉富羅非魚的抽檢樣本進行遺傳性別鑒定，結(jié)果顯示，遺傳全雄群體的遺傳性別均為XY型，吉富羅非魚群體則有XX、XY兩種遺傳性別，與預(yù)期一致。這一遺傳性別鑒定結(jié)果的差異，可作為遺傳全雄群體鑒定的依據(jù)。本研究結(jié)果表明，以YY型超雄尼羅羅非魚為父本、吉富品系尼羅羅非魚為母本進行繁育的遺傳全雄技術(shù)在尼羅羅非魚養(yǎng)殖中具有一定優(yōu)勢，能夠穩(wěn)定獲得高雄性率的苗種，可為全雄羅非魚苗種的大規(guī)模繁育提供新的選擇。

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Comparison of culture traits and male ratio between three populations of genetically all-male Nile tilapia and GIFT tilapia

FENG Ziyuan1， WANG Can1，2， LIU Feng1

（1. Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai Fisheries Technical Extension Station，Shanghai 200433，China; 2. Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract： In order to screen the parent combination with fast growth， high survival rate and high male rate in offspring， three YY genotype super male Nile tilapia families were used as male parents，while GIFT tilapia was selected as female parents to breed all-male Nile tilapia seedlings.Comparative farming experiments were carried out on between three genetically all-male populations and GIFT population.The biological and genetic sex were identified by pressing method and molecular marker detection，etc.Meanwhile the differences of breeding traits among different populations were evaluated，and the male rate was calculated.The results showed that the average body weight of the three genetically all-male populations was 17.39 g higher than that of the GIFT population，and the growth rate of genetically all-male C was 21.21% faster than that of the GIFT population.There was a significant difference between the genetically all-male population and the GIFT population（P＜0.05）.The male rate of the three all-male populations was ranged from 99% to 100% with the average male rate being 99.54%，which was higher than that of the GIFT population（56.34%）.The results showed that the male ratio of the three genetically all-male populations could meet the needs of all-male tilapia culture，and the growth rate of genetic all-male C was the fastest，which could be used as the main combination for the large-scale breeding of all-male tilapia fry，and had high promotion value.

Key words： Oreochromis niloticus； all-male; super male; growth; male rate