源于Halomonas sp.抗草甘膦EPSPS的克隆、鑒定及應(yīng)用

關(guān)鍵詞 抗除草劑作物； 抗草甘膦5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成酶； 草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶； 雙抗除草劑作物；基因聚合

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）03-0158-09

草甘膦和草銨膦是全球廣泛使用的2 種滅生性除草劑，具有高效、低毒、廣譜等優(yōu)點(diǎn)。前者通過競爭性抑制植物莽草酸途徑關(guān)鍵酶5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS；EC 2.5.1.19），導(dǎo)致植物芳香族氨基酸合成受阻而死亡［1］；后者通過抑制谷氨酰胺合成酶（GS；EC 6.3.1.2）活性，導(dǎo)致植物氨同化受阻而死亡［2］。滅生性的特點(diǎn)制約了這2 種優(yōu)良除草劑在農(nóng)作物中的直接應(yīng)用，然而通過轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代生物育種手段，培育耐除草劑作物新品種，可以有效地解決這一問題。

全球超過20 a 的產(chǎn)業(yè)化實(shí)踐充分證明，耐除草劑（herbicide tolerant，HT）作物對于農(nóng)業(yè)節(jié)能減排、增產(chǎn)增收、環(huán)境保護(hù)均具有重要的貢獻(xiàn)［3-5］。近年來，我國進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因玉米大豆產(chǎn)業(yè)化試點(diǎn)研究表明，耐除草劑性狀表現(xiàn)突出，除草效果95% 以上，轉(zhuǎn)基因玉米大豆可增產(chǎn)5.6% 至11.6%（http：//www.moa. gov. cn/ztzl/ymksn/xhsbd/202308/t20230825_6435073.htm）。此外，我國正面臨糧食生產(chǎn)集約化、輕簡化、機(jī)械化轉(zhuǎn)型需求，而HT 作物育種及產(chǎn)業(yè)化將為這一轉(zhuǎn)型提供支撐。

挖掘具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且性能優(yōu)異的耐除草劑基因資源，是HT 作物培育與產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。我國在耐草甘膦基因資源方面有一定積累，克隆了多個(gè)新的草甘膦耐受基因，主要包括2 種類型：一種為對草甘膦耐受的EPSPS 合酶，如Deinococcus radioduran來源的G10evo?EPSPS［6］、Pseudomonas fluorescens來源的G2?EPSPS［7］、源于Pseudomonas stutzeri 的GR79?EPSPS［8］ 和源于Isoptericola variabilis 的IV?EPSPS［9］；另外一種為能夠?qū)Σ莞熟⑦M(jìn)行修飾或降解的脫毒酶，包括gat 和GlypO［8， 10］。

耐草甘膦性狀長期主導(dǎo)HT 作物，草甘膦的長期廣泛使用導(dǎo)致抗性雜草的進(jìn)化和漫延，成為HT 作物應(yīng)用的新挑戰(zhàn)［11］。EPSPS 基因?qū)＠饕莆赵诿仙蕉?、拜耳、先鋒、先正達(dá)等4 家巨頭公司（https：//patentscope.wipo.int/），相比之下我國在EPSPS 基因資源上匱乏，核心專利較少。當(dāng)前，我國大力推進(jìn)生物育種產(chǎn)業(yè)化研究，科學(xué)推進(jìn)抗除草劑及抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高性能抗除草劑基因，是開展抗除草劑作物育種研究與產(chǎn)業(yè)化的根本前提。

通過基因聚合策略，培育耐不同除草劑的HT 作物，進(jìn)而通過不同除草劑的輪用來應(yīng)對抗性雜草，可有效地解決這一挑戰(zhàn)。此外，復(fù)合抗性HT 作物與復(fù)合除草劑聯(lián)用，對于控制田間已有抗性雜草至關(guān)重要。草銨膦除了具有與草甘膦類似的廣譜、低毒優(yōu)點(diǎn)外，還具有見效快的優(yōu)勢。近年來，伴隨著精草銨膦酶促合成的工藝日趨完善，成本逐年降低，草銨膦價(jià)格將很快媲美草甘膦。因此，培育草甘/銨膦多抗除草劑作物具有廣闊的應(yīng)用前景。

鑒于此，本研究在挖掘新的草甘膦耐受基因的同時(shí)，基于自切割肽介導(dǎo)的多順反子表達(dá)策略［12］，構(gòu)建了一個(gè)高抗草甘膦/草銨膦的基因，實(shí)現(xiàn)了“一個(gè)基因，兩種抗性”，旨在進(jìn)一步挖掘新的草甘膦抗性基因，為耐草甘/銨膦“ 雙抗”作物的育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌（E. coli）DH5α、E. coli ZD11（epsps 基因缺陷型菌株）、E. coli BL21（DE3）和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 保存于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)酶分子工程實(shí)驗(yàn)室。草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Repat）為實(shí)驗(yàn)室前期克隆。

1.2 抗性菌株篩選鑒定及分析

將實(shí)驗(yàn)室保藏的海洋菌株活化后接種于含有200 mmol/L 草甘膦的2216E 培養(yǎng)基（青島日水生物科技有限公司）平板進(jìn)行初篩；初篩的菌株單菌落進(jìn)一步劃線接種到含有0、100、200、300 mmol/L 草甘膦的M9 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，篩選到1 株能在300 mmol/L高草甘膦濃度條件下生長的菌株；提取該菌株基因組DNA 并送至上海派諾森生物有限公司進(jìn)行測序分析。

1.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因組序列信息，利用Snapgen 4.3.6設(shè)計(jì)引物fHoEPSPS-F 和fHoEPSPS-R 擴(kuò)增該菌株EPSPS基因（fHoEPSPS）的ORF，引物序列信息見表1。以pGEX-6p-1 為表達(dá)載體，通過同源重組法，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-fHoEPSPS。

1.4 fHoEPSPS、mfHoEPSPS、mHoEPSPS 及融合基因RLH表達(dá)載體構(gòu)建

通過PCR 介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)，設(shè)計(jì)引物Muta‐Ho-F 和MutaHo-R 將fHoEPSPS 的第384 位G 突變?yōu)锳，構(gòu)建pGEX-6p-mfHoEPSPS 重組質(zhì)粒。通過設(shè)計(jì)互為同源臂的引物mHo-F、mHo-R，以pGEX-6p-mfHoEPSPS 為模板，擴(kuò)增除PDT 基因的部分，利用ClonExpress MultiS 一步法重組試劑盒（諾唯贊，南京）構(gòu)建不含PDT 的pGEX-6p-mHoEPSPS 重組質(zhì)粒。

利用帶有載體同源臂的引物Repat-F 和LinkerLP4/2A 同源臂引物Repat-R 擴(kuò)增Repat 基因，利用引物L(fēng)P4/2A-F 和帶有mHoEPSPS 同源臂的LP4/2A-R 引物擴(kuò)增Linker LP4/2A，利用引物mHoEPSPS-F 和帶有載體同源臂的引物mHoEPSPS-R 擴(kuò)增mHoEPSPS 基因，引物序列信息見表1。分別回收相應(yīng)的PCR 產(chǎn)物，將回收得到的3 種PCR 產(chǎn)物混合作為擴(kuò)增模板，引物選擇Repat-F、mHoEPSPS-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到RLH 片段，產(chǎn)物回收后與EcoRⅠ和BamHⅠ線性化的載體pGEX-6p-1 混合，利用 Clon‐Express MultiS 一步法重組試劑盒構(gòu)建pGEX-6p-RLH 重組質(zhì)粒。

1.5 fHoEPSPS、mfHoEPSPS 及mHoEPSPS 蛋白表達(dá)與純化

將pGEX-fHoEPSPS、pGEX-mfHoEPSPS 和pGEX-mHoEPSPS 轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3），挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到10 mL 含有100μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。以1% 的接種量轉(zhuǎn)接至500 mLLB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)OD600達(dá)0.6 時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為 0.1 mmol/L，18 ℃ ，180r/min 誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。誘導(dǎo)完成后，7 500 r/min 離心10 min 收集菌體，用預(yù)冷的HEPES 緩沖液（pH 7.0）洗滌菌體，離心去上清液，洗滌2 遍，再用100 mL 新鮮HEPES 緩沖液充分懸浮菌體，用低溫高壓破碎儀（JNBIO JN-3000PLUS，廣州聚能納米生物科技股份有限公司）破碎細(xì)胞，收集細(xì)胞破碎液后12 000r/min、4 ℃離心60 min，收集上清液，進(jìn)行GST 親和層析純化［13］。

1.6 草甘/銨膦抗性驗(yàn)證

將含有pGEX-6p-fHoEPSPS、pGEX-6p-mfHo?EPSPS、pGEX-6p-mHoEPSPS、pGEX-6p-RLH、pGEX-6p-Repat 質(zhì)粒的菌株E. coli ZD11接種至含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，于37 ℃過夜培養(yǎng)，洗滌2 遍除去LB 營養(yǎng)成分，調(diào)整菌體濃度OD600 至1.0，按2%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接于含有不同濃度（0、100、200 mmol/L）草甘/銨膦的液體M9 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。用Bioscreen 全自動(dòng)生長曲線分析儀檢測菌株的生長狀況，設(shè)置測定時(shí)間為2 d，培養(yǎng)溫度為37 ℃。

1.7 fHoEPSPS、mfHoEPSPS、mHoEPSPS 抑制動(dòng)力學(xué)分析

半抑制劑量（IC50）能直觀反映出酶對抑制劑的耐受性。設(shè)置20 μL 的反應(yīng)體系：2 μL 1 mmol/L 莽草酸-3-磷酸（S3P，Sigma，上海），2 μL 1 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP，Sigma，上海），2 μL 純酶，加不同濃度梯度（10?5、10?4、10?3、10?2、10?1、100、101mmol/L）的草甘膦（Sigma，上海），加用HEPES 緩沖液補(bǔ)足到 20 μL。28 ℃反應(yīng) 4 min，加入800 μL 孔雀石綠溶液，1 min 后加入100 μL 34% 檸檬酸三鈉溶液，室溫放置30 min 后，取200 μL 于96 孔板中，用預(yù)熱的酶標(biāo)儀測定OD660 值。所得數(shù)據(jù)利用GraphpadPrism 8 進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合與IC50計(jì)算。

1.8 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與除草劑抗性驗(yàn)證

為分析基因mHoEPSPS 及RLH 在植物中除草劑抗性水平，本研究將mHoEPSPS 及RLH 基因按照煙草密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化合成（由武漢金開瑞生物工程有限公司合成）。以優(yōu)化合成的序列為模板利用引物對（mHoEPSPS-F 和mHoEPSPS-R）擴(kuò)增mHoEPSPS 基因；利用引物對（RLH-F 和RLHR）擴(kuò)增RLH 基因，PCR 產(chǎn)物分別回收后，與KpnⅠ和 BamH Ⅰ線性化的載體pCAMBIA1300 混合，利用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 通過同源重組，分別構(gòu)建煙草轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300-mHo?EPSPS 和pCAMBIA1300-RLH。以‘巖煙97’為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法，分別構(gòu)建含mHo?EPSPS 和RLH 的轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana benthami?ana）。提取具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化體的葉片組織DNA，利用潮霉素抗性基因特異性引物hpt557-F 和hpt557-R（表1）進(jìn)行PCR，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性苗。

野生型和轉(zhuǎn)基因株系溫室生長至6～9 葉期時(shí)，用2%（商業(yè)推薦劑量為0.5%）的農(nóng)達(dá)（41% 草甘膦異丙胺鹽）噴施處理轉(zhuǎn)mHoEPSPS 煙草；轉(zhuǎn)RLH 煙草葉片分別噴灑2% 的農(nóng)達(dá)和40% 草甘膦·草銨膦復(fù)合除草劑（濟(jì)南兄弟作物科學(xué)有限公司），7 d 后觀察并記錄植株的生長與藥害情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性菌株篩選鑒定及測序

本研究通過菌株抗性篩選獲得1 株能在含有300 mmol/L 草甘膦培養(yǎng)基中生長的菌株（圖1A），擴(kuò)增其16S rRNA 基因并進(jìn)行測序分析與序列比對，鑒定該菌株屬于鹽單胞菌屬（Halomonas sp.）。

提取菌株總DNA，進(jìn)行測序分析，根據(jù)全基因組測序結(jié)果及注釋，獲得了草甘膦靶酶EPSPS（fHo?EPSPS）的基因結(jié)構(gòu)信息，該基因長度為2 202 bp，GC 含量60%，可編碼733 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量理論大小為78.25 ku，與已報(bào)道的EPSPS 蛋白分子質(zhì)量有較大差異。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N 端融合了預(yù)苯酸脫水酶（PDT），由272 個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為29.45 ku；C 端含有EPSPS 結(jié)構(gòu)域，包括461 個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為48.80 ku（圖1B）。fHoEPSPS 基因上下游分別為磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶、核糖體蛋白S1。

為評價(jià)該酶序列新穎性，考慮到fHoEPSPS 中PDT 結(jié)構(gòu)域會(huì)對多序列比對結(jié)果產(chǎn)生影響，選擇將fHoEPSPS 中不包含PDT 的部分（命名為HoEPSPS）與已報(bào)道的4 類EPSPS 進(jìn)行多序列比對，利用軟件MEGA 6 構(gòu)建進(jìn)化樹，分析不同酶的序列一致性，結(jié)果如圖1C 所示。HoEPSPS 在分類上屬于II 型EPSPS，與CP4-EPSPS、Iv-EPSPS、G2-EPSPS 及G10-EPSPS 的一致性較低，分別為：41.47%、22.09%、22.49%、22.49%，表明fHoEPSPS 是一個(gè)新型草甘膦耐受酶。

2.2 fHoEPSPS及其突變體的純化及抗性比較

對比fHoEPSPS和其他4類EPSPS氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)他們均具有1個(gè)保守motif：-₃₈₂N₃₈₃S₃₈₄G₃₈₅T₃₈₆A₃₈₇M-。前期研究結(jié)果表明，該motif 中的甘氨酸殘基與草甘膦的抗性密切相關(guān)［14］。因此，本研究設(shè)計(jì)fHoEPSPS中384位G到A的點(diǎn)突變（mfHoEPSPS），以進(jìn)一步提高fHoEPSPS對草甘膦的抗性水平。

本研究首先純化fHoEPSPS 及mfHoEPSPS 蛋白，由圖2A、B 可知，純化得到條帶單一蛋白，且分子量在70～100 ku，與理論分子質(zhì)量78.2 ku 大小一致。利用純化的酶，測定了二者半抑制濃度 IC₅₀，結(jié)果顯示，fHoEPSPS 與mfHoEPSPS 的 IC₅₀ 分別為4.83mmol/L 和 47.74 mmol/L（圖3），表明384 位G 到A的突變能急劇提高酶對草甘膦耐受性。為了分析N端的PDT 對mfHoEPSPS 草甘膦耐受性的影響，將mfHoEPSPS 中PDT 進(jìn)行缺失，得到了不含PDT 的mHoEPSPS（圖2C）。結(jié)果顯示，mHoEPSPS 的IC₅₀為92.30 mmol/L，比野生型fHoEPSPS 高19 倍，比mfHoEPSPS 高1.9 倍（圖3）。以上結(jié)果表明，N 端的PDT 不利于酶對草甘膦的耐受性。

2.3 雙抗基因RLH構(gòu)建與抗性驗(yàn)證

將筆者所在實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的草銨膦抗性基因Re?pat 置換掉其N 端的PDH 編碼區(qū)，添加自切割的linkerLP4/2A，構(gòu)建融合基因RLH，以期實(shí)現(xiàn)“一個(gè)基因，兩種抗性”。由圖4 可知，草銨膦抗性基因Repat與草甘膦抗性基因mHoEPSPS 通過linker LP4/2A序列連接。

為了驗(yàn)證融合基因功能，本研究將RLH 亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，轉(zhuǎn)化E. coli ZD11 感受態(tài)細(xì)胞，對其草甘/銨膦抗性進(jìn)行驗(yàn)證。由圖5 可知，RLH 重組菌株草甘膦抗性良好，在各個(gè)草甘/銨膦濃度條件下表現(xiàn)出的生長水平與單基因mHoEPSPS或Repat 相當(dāng)。在高濃度的草甘/銨膦（200 mmol/L）壓力下，RLH 重組菌與單基因重組菌生長能力幾乎一致，表明2 個(gè)基因的融合并未影響各自的抗除草劑功能。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草抗性驗(yàn)證

將mHoEPSPS 和RLH 基因插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300，獲得煙草轉(zhuǎn)化載體（圖6A、B）。以‘ 巖煙97’為受體，通過葉盤轉(zhuǎn)化法，獲得了轉(zhuǎn)mHoEPSPS 和RLH 的煙草。選擇生長健壯的陽性株系，在6～9 葉期時(shí)，進(jìn)行除草劑處理。由圖6C、D可知，用0.5% 的農(nóng)達(dá)處理野生型WT 株系，7 d 后植株萎蔫、死亡。轉(zhuǎn)mHoEPSPS 株系在1.6% 的農(nóng)達(dá)處理后，生長狀態(tài)良好，在2% 的農(nóng)達(dá)處理時(shí)出現(xiàn)萎蔫、枯黃現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)RLH 基因株系在2% 的農(nóng)達(dá)處理時(shí)，其生長只受到輕微抑制。在草甘膦·草銨膦復(fù)合除草劑處理時(shí)，WT 株系在0.1% 的劑量處理后，出現(xiàn)了萎蔫、枯黃現(xiàn)象。轉(zhuǎn)RLH 基因株系在0.3% 的草甘膦·草銨膦復(fù)合農(nóng)藥處理后，整體植株不失綠且生長良好，在0.5% 的草甘膦·草銨膦處理時(shí)，老葉出現(xiàn)少許黃化，但植株仍然可以正常生長（圖6E），表明RLH 轉(zhuǎn)基因煙草能夠賦予煙草抗3～5 倍推薦劑量草甘膦·草銨膦復(fù)合除草劑。

3 討論

EPSPS廣泛存在植物、細(xì)菌及真菌中。植物來源的EPSPS 普遍對草甘膦敏感，而某些微生物尤其是細(xì)菌中EPSPS 對草甘膦具有抗性，成為抗草甘膦基因資源的主要來源。長期以來，人們更多的是關(guān)注土壤微生物來源抗草甘膦EPSPS 的克隆［15-17］，而海洋環(huán)境蘊(yùn)藏微生物資源，其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境決定了基因的多樣性和功能的特異性。因此，本研究嘗試從海洋菌中篩選新的具有高草甘膦抗性的EPSPS 基因。首先，利用含不同濃度草甘膦的人工海水培養(yǎng)基2216E，對筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的海洋菌株進(jìn)行了抗性篩選，獲得了1 株高耐受草甘膦菌株。通過16S rRNA 測序鑒定，明確該菌株為鹽單胞菌屬?？紤]到目前未有該菌株高抗草甘膦EPSPS 的報(bào)道，進(jìn)一步對該菌株進(jìn)行全基因組測序分析，獲得了EPSPS 基因。發(fā)現(xiàn)不同于目前報(bào)道的大多數(shù)單功能EPSPS，來源于Halomonas sp.的EPSPS的N端存在一個(gè)預(yù)苯酸脫水酶（PDT）結(jié)構(gòu)域，以雙功能酶的形式表達(dá)。

通過多序列比對發(fā)現(xiàn)去掉PDT 部分的酶（Ho‐EPSPS）與CP4-EPSPS 序列一致性僅為41.47%，與其他商業(yè)化應(yīng)用的EPSPS 序列一致性小于30%，是一個(gè)新型的草甘膦耐受酶。全長酶fHoEPSPS 和HoEPSPS 均能在E. coli 細(xì)胞中可溶性表達(dá)。序列分析表明，fHoEPSPS 同樣含有在EPSPS 中廣泛存在的motif：-₃₈₂N₃₈₃S₃₈₄G₃₈₅T₃₈₆A₃₈₇M-，該motif 中的甘氨酸殘基與草甘膦抗性相關(guān)［14］。因此，本研究將₃₈₄G 突變?yōu)?sub>384A，獲得mfHoEPSPS?？剐苑治霰砻?，mfHoEPSPS 賦予大腸桿菌更高草甘膦抗性，顯著高于fHoEPSPS。考慮到PDT 結(jié)構(gòu)域?qū)PSPS功能是非必需的，而且用于轉(zhuǎn)基因育種會(huì)增加外源蛋白的數(shù)量，增大安全評估的成本，本研究將mfHo‐EPSPS 中的PDT 缺失，獲得mHoEPSPS。mHoEPSPS表現(xiàn)出最高的IC₅₀，意味著具有更高的草甘膦耐受性。因此，本研究在煙草中測試了mHoEPSPS 對草甘膦的耐受能力與育種應(yīng)用潛力，結(jié)果顯示超表達(dá)mHoEPSPS 植株能夠耐受3 倍推薦劑量的草甘膦農(nóng)藥，表明mHoEPSPS 基因具有一定的育種價(jià)值。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步通過定向進(jìn)化策略，提高該基因?qū)Σ莞熟⒌目剐运健?/p>

抗草甘膦作物長期主導(dǎo)耐除草劑作物產(chǎn)業(yè)，然而全球耐草甘膦雜草多達(dá)58 種，且有逐年增加的趨勢，對耐草甘膦作物的持續(xù)發(fā)展提出了挑戰(zhàn)；而已報(bào)道的草銨膦抗性雜草目前只有6 種［18］。長期單一的使用某一種除草劑必然會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)抗性雜草的產(chǎn)生，因此，培育雙抗草甘/銨膦作物，通過輪換使用草甘/銨膦除草劑可有效應(yīng)對草甘膦抗性雜草的挑戰(zhàn)。本研究利用“LP4-2A 自切割肽”將前期開發(fā)的高抗草銨膦酶Repat 與mHoEPSPS 進(jìn)行融合，創(chuàng)制了雙抗草甘/銨膦酶RLH。LP4-2A 序列為S-NAADEVATQLLNFDLLKLAGDVESNPG-P，該序列已被廣泛證實(shí)在植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生S-N 之間及G-P 之間的雙位點(diǎn)自切割，高效釋放其兩端連接蛋白［19-21］。草銨膦抗性Repat 主要在植物細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用［21-22］，而草甘膦抗性的EPSPS 需要定位在葉綠體中發(fā)揮功能［23］，理論上需要RLH 具有較高的自切割活性，因此本研究選擇LP4-2A 為自切割linker。超表達(dá)RLH 的煙草能夠耐受 3～5 倍推薦劑量草甘膦·草銨膦復(fù)合除草劑，推測RLH 在植物細(xì)胞內(nèi)能夠高效切割，釋放的酶各自正確定位并發(fā)揮功能。在后續(xù)的研究中，可以進(jìn)一步通過表達(dá)定位和Westernblot 分析，來驗(yàn)證RLH 的切割效率與功能特點(diǎn)。

本研究利用自切割肽介導(dǎo)的基因堆疊策略，構(gòu)建了抗2 種除草劑的單基因。目前不同抗除草劑基因堆疊的主要策略為使用多個(gè)表達(dá)框進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，存在載體構(gòu)建繁瑣，重復(fù)表達(dá)元件遺傳不穩(wěn)定，不同蛋白的表達(dá)比例可能失衡等弊端。本研究的2 個(gè)抗性基因只需要一個(gè)表達(dá)框，即可實(shí)現(xiàn)1∶1 的穩(wěn)定表達(dá)，具有明顯的優(yōu)勢，這為其他抗除草劑基因的堆疊提供了借鑒。另外，超表達(dá)RLH 的煙草能夠耐受3～5 倍，較高的抗性水平意味著RLH 具有較大的應(yīng)用潛力。在后續(xù)研究中，可以在不同作物中測試其抗性水平，進(jìn)而利用該基因培育抗草甘/銨膦的耐除草劑作物。

（責(zé)任編輯：葛曉霞）