馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)的馬鈴薯防御反應(yīng)

關(guān)鍵詞馬鈴薯塊莖蛾；馬鈴薯；防御酶；次生代謝物；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

馬鈴薯是我國(guó)四大主要糧食作物之一。中國(guó)是世界上重要的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，馬鈴薯產(chǎn)量占世界馬鈴薯總產(chǎn)量的1／3。馬鈴薯塊莖蛾已經(jīng)成為影響馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。馬鈴薯塊莖蛾屬鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae，又名煙草潛葉蛾，馬鈴薯麥蛾，是茄科作物的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。在田間，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲主要侵入茄屬作物的葉、莖和葉柄。在馬鈴薯的儲(chǔ)存過程中，馬鈴薯塊莖蛾成蟲將卵產(chǎn)在塊莖表面，集中在裂縫或去皮的馬鈴薯塊莖上。該蟲在我國(guó)南方馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，尤其是在云南、四川、貴州等地區(qū)該害蟲發(fā)生極為嚴(yán)重，且隨著氣候的變化該蟲可能會(huì)擴(kuò)散到其他馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)。

在植物一昆蟲相互作用、協(xié)同進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出了復(fù)雜的防御策略來(lái)抵御植食性昆蟲的侵害。植物在受到外來(lái)脅迫時(shí)會(huì)啟動(dòng)誘導(dǎo)型防御機(jī)制。這種防御機(jī)制一般有3種途徑：1）產(chǎn)生黃酮、單寧、生物堿或者揮發(fā)性化合物（ HIPVs）等次生代謝物質(zhì)來(lái)直接殺死害蟲。2）產(chǎn)生抗氧化酶或防御相關(guān)酶，如多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等防御蛋白來(lái)減弱或抑制昆蟲自身消化食物的能力。3）降低植物本身的營(yíng)養(yǎng)水平（如氨基酸、糖類）使昆蟲得不到足夠生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲死亡。研究表明，不同品種棉葉被二斑葉螨Tet-ranychus urticae取食后，其CAT、PPO的酶活力均顯著高于未取食對(duì)照組。美國(guó)白松木蠹象Pis-sodes strobi攻擊巨云杉莖中的萜烯合成酶（TPS）轉(zhuǎn)錄物強(qiáng)烈增加。吳芳等研究表明，隨著薊馬數(shù)量的增加，供試苜蓿品種的黃酮、單寧和木質(zhì)素含量均顯著高于對(duì)照，但PPO酶活性卻有所降低。種群密度20頭／株的食葉害蟲樟葉蜂Mesoneura ruf’onota在取食樟樹1d后會(huì)顯著降低葉片總酚和總糖含量；上述研究表明，從植物葉片中防御蛋白、次生代謝物和營(yíng)養(yǎng)成分等物質(zhì)的含量變化來(lái)探究作物應(yīng)對(duì)蟲害的生理防御機(jī)制一直是研究的主要趨勢(shì)和切人點(diǎn)，這對(duì)預(yù)防和指導(dǎo)蟲害防治具有重要的科學(xué)價(jià)值。不過，目前的研究多集中在植物應(yīng)對(duì)蟲害產(chǎn)生防御物質(zhì)成分的評(píng)估，對(duì)昆蟲取食后植物在時(shí)間動(dòng)態(tài)上的響應(yīng)機(jī)制及不同防御物質(zhì)的協(xié)同與權(quán)衡研究較少。

本研究以馬鈴薯和馬鈴薯塊莖蛾為研究體系，設(shè)置盆栽模擬試驗(yàn)，探究3個(gè)馬鈴薯品種被塊莖蛾取食后其防御酶、次生代謝物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，為明確昆蟲與植物的互作關(guān)系及塊莖蛾的綜合防治提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種：‘青薯9號(hào)’‘合作88’‘米拉’。

供試蟲源：馬鈴薯塊莖蛾在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲生理實(shí)驗(yàn)室隔離飼養(yǎng)（溫度27℃，相對(duì)濕度80%-90%）所建立的種群。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1馬鈴薯種植、接蟲處理及取樣

選取大小一致、健康無(wú)病蟲害侵染的種薯單盆單薯種植在直徑20cm．高30cm的塑料盆中。每個(gè)品種設(shè)置塊莖蛾取食（PTM）和空白對(duì)照（CK）兩個(gè)處理，每處理設(shè)置8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，因此每個(gè)品種種植48盆。為避免其他昆蟲取食和植株之間的相互影響，每盆之間間隔1m并用防蟲網(wǎng)覆蓋，放在溫室中培養(yǎng)，溫度（27±2）℃，相對(duì)濕度（75±10）%，光周期L∥D=12h∥12h，定期按同樣的標(biāo)準(zhǔn)澆水施肥，待植株長(zhǎng)到5片完全展開葉，分別在3個(gè)品種馬鈴薯的5片完全展開葉上，人工接種馬鈴薯塊莖蛾2日齡初孵幼蟲2頭（塊莖蛾幼蟲接種前饑餓處理5h），此為塊莖蛾取食處理（PTM）?？瞻讓?duì)照（CK）植物不作任何處理。分別在塊莖蛾取食0、3、6、12、24、48、72、96h時(shí)從CK和塊莖蛾取食的植株上選取大小和葉齡一致的葉片約1.0g裝入自封袋中，做好標(biāo)記迅速放人液氮中冷凍以備后續(xù)生理指標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)處理每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)重復(fù)樣本分別從3株相同處理的馬鈴薯植株上獲得。

1.2.2生理指標(biāo)測(cè)定

總氨基酸含量、萜烯合成酶（TPS）活性和類黃酮（flavonoids）含量采用ELISA（雙抗夾心法）試劑盒（96T，購(gòu)自江蘇科特生物科技有限公司）測(cè)定。過氧化氫酶（CAT）活性、多酚氧化酶（PPO）活性和單寧含量采用微板法試劑盒（96T，購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司）測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019記錄和整理數(shù)據(jù)。采用SPSS27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。雙因素方差（Two-way ANOVA）分析處理方式（取食和不取食）、取樣時(shí)間及其交互作用對(duì)不同馬鈴薯品種葉片生理指標(biāo)的影響。單因素方差分析（One-wayANOVA）及多重比較檢驗(yàn)同一處理下不同取樣時(shí)間的影響及其差異顯著性。t檢驗(yàn)分析同一取樣時(shí)間下2種處理方式的差異顯著性。GraphPadPrism 9.5軟件作圖，顯著水平設(shè)置為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯塊莖蛾取食對(duì)不同品種馬鈴薯葉片防御酶活性的影響

2.1.1對(duì)過氧化氫酶（CAT）活性的影響

從圖1可以看出，取樣時(shí)間和處理方式對(duì)3個(gè)品種馬鈴薯葉片的過氧化氫酶活性均有顯著或極顯著影響。隨著取食時(shí)間的增加，3個(gè)馬鈴薯品種葉片的CAT活性均呈現(xiàn)升高一降低一升高的變化趨勢(shì)。從CAT活性的增降率（表1）看，與對(duì)照相比，除了‘米拉’被馬鈴薯塊莖蛾取食24h和96h的CAT活性顯著低于對(duì)照（圖1c），其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CAT活性均呈正增長(zhǎng)?！嗍?號(hào)’和‘合作88’被取食后各時(shí)間點(diǎn)CAT活性均呈正增長(zhǎng)（圖1a，b）。相對(duì)于未取食對(duì)照，‘青薯9號(hào)’‘合作88’和‘米拉’的平均增長(zhǎng)率分別是123.68%、138.06%和28.95%，表明3個(gè)品種受蟲害脅迫后過氧化氫酶的活性整體呈升高趨勢(shì)，且‘合作88，變化最明顯，‘青薯9號(hào)’次之，‘米拉’變化最小。

2.1.2對(duì)多酚氧化酶（PPO）活性的影響

從圖2中可以看出，‘青薯9號(hào)’和‘合作88'整體上都呈現(xiàn)升高一降低一升高的變化趨勢(shì)，而‘米拉’則是先升高后降低的趨勢(shì)（圖2）。取樣時(shí)間和處理方式對(duì)‘合作88'和‘米拉’葉片多酚氧化酶（PPO）的活性有顯著影響?！嗍?號(hào)’中馬鈴薯塊莖蛾取食葉片的PPO活性在取食6h時(shí)顯著高于0h，同時(shí)也是PPC）活性的最大峰值，為1369.73△OD/（min·g）；其他時(shí)間點(diǎn)各處理之間的PPO活性無(wú)顯著差異，但均顯著低于取食6h處理。與對(duì)照（CK）相比，僅有取食6h和12h兩個(gè)處理分別顯著高于CK，其他處理與對(duì)照間則無(wú)顯著差異（圖2a）。取樣時(shí)間對(duì)‘青薯9號(hào)’酶活性的影響不顯著。

被取食‘合作88’的PPO活性隨時(shí)間的變化情況（圖2b）與‘青薯9號(hào)’相似。而在‘合作88’品種上的PPO活性變化情況（圖2b）顯示，取樣時(shí)間與處理方式對(duì)其酶活性有顯著影響。

從PPO活性增降率表（表1）看，與未被塊莖蛾取食的對(duì)照相比，‘青薯9號(hào)’‘合作88’和‘米拉’在取食后的3～96 h內(nèi)PPO活性均呈正增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率分別為89.41%、192.89%、110.23%。這表明蟲取食后的3～96h內(nèi)，‘合作88’的PPO活性變化最明顯，‘青薯9號(hào)’變化最小。

2.1.3對(duì)萜烯合成酶（TPS）活性的影響

從圖3可以看出，取樣時(shí)間和處理方式都對(duì)3個(gè)馬鈴薯品種的TPS酶活性產(chǎn)生了極顯著影響。3個(gè)品種的TPS活性變化整體上均呈升高一降低一升高的變化趨勢(shì)，且塊莖蛾取食葉片的TPS活性均從3h開始上升，‘青薯9號(hào)’‘合作88’均在24h達(dá)到峰值。與空白對(duì)照相比，‘青薯9號(hào)’在馬鈴薯塊莖蛾取食3、12、24h和48h處的TPS活性顯著升高（圖3a）；‘合作88’塊莖蛾取食處理3、6、12、24h和96h后的酶活性顯著升高（圖3b）；而在‘米拉’，只有馬鈴薯塊莖蛾取食處理48 h和96h顯著升高（圖3c）。從TPS活性的增降率表（表1）中可以看出，與空白對(duì)照相比，‘青薯9號(hào)’平均增長(zhǎng)率為42.08%。而‘合作88’在取食脅迫48h和72h處呈負(fù)增長(zhǎng)外，其余時(shí)間點(diǎn)均呈正增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率為46.21%?！桌谌∈趁{迫24h后呈負(fù)增長(zhǎng)外，其余時(shí)間點(diǎn)均呈正增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率為19.08%。這表明，馬鈴薯塊莖蛾取食后，葉片中TPS酶活性整體呈上升趨勢(shì)，‘合作88’的酶活性變化略高于‘青薯9號(hào)’‘米拉’的酶活性變化最小。

2.2馬鈴薯塊莖蛾取食對(duì)不同品種馬鈴薯葉片總氨基酸（營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）含量的影響

從圖4可見，3個(gè)品種中，取樣時(shí)間和處理方式都對(duì)葉片的總氨基酸（T-AA）含量產(chǎn)生了極顯著影響?！献?8’和‘青薯9號(hào)’整體呈現(xiàn)下降一升高一下降一升高的波動(dòng)式變化趨勢(shì)，而‘米拉’的總氨基酸含量呈現(xiàn)升高一降低一升高的趨勢(shì)。‘青薯9號(hào)’中，除了0h和12h，其余各時(shí)間點(diǎn)下馬鈴薯塊莖蛾取食處理的葉片總氨基酸含量相比于空白對(duì)照處理均顯著降低（圖4a）?！献?8’被取食3、6、12、48h和72h時(shí)葉片總氨基酸含量顯著低于空白對(duì)照（圖4b）。除了24h，‘米拉’葉片中的馬鈴薯塊莖蛾取食處理后的總氨基酸含量（T-AA）都顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照處理（圖4c）。從總氨基酸（T-AA）含量的增降率（表1）中可以看出，與未被塊莖蛾取食的葉片相比，‘米拉’遭受蟲脅迫后的總氨基酸含量均呈負(fù)增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率為-17.53%。與對(duì)照相比，‘青薯9號(hào)’和‘合作88’分別在12h和96h的總氨基酸（T-AA）含量呈正增長(zhǎng)，其余時(shí)間點(diǎn)均呈負(fù)增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率分別為-16.63%和-25.25%。這表明塊莖蛾取食都顯著造成了各個(gè)品種中總氨基酸（T-AA）含量的下降，其中‘合作88’下降最明顯，‘米拉’次之，‘青薯9號(hào)’整體下降幅度最小。

2.3馬鈴薯塊莖蛾取食對(duì)不同品種馬鈴薯葉片次生代謝物的影響

2.3.1對(duì)單寧含量的影響

從圖5中可以看出，處理方式和取樣時(shí)間均對(duì)葉片單寧含量的變化起到了極顯著影響?！嗍?號(hào)’中，3、12、24、48、72h和96h的塊莖蛾取食葉片的單寧含量顯著高于對(duì)照葉片（圖5a）。除0h和48h外，‘合作88’其余各時(shí)間點(diǎn)的塊莖蛾處理后的單寧含量都顯著高于空白對(duì)照（圖5b）?！桌?，與未被取食的空白對(duì)照相比，6h和72h的塊莖蛾取食處理后的單寧含量與空白對(duì)照處理無(wú)顯著差異，24h取食處理顯著低于對(duì)照，其余時(shí)間點(diǎn)均顯著高于空白對(duì)照（圖5c）。

從單寧含量的增降率表（表1）中可以看出，與未被取食的空白對(duì)照相比，只有‘米拉’的24h和72h呈負(fù)增長(zhǎng)，其余時(shí)間點(diǎn)均呈正增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率為81.31%?！嗍?號(hào)’和‘合作88’各時(shí)間點(diǎn)的單寧含量相比空白對(duì)照而言均呈正增長(zhǎng)，兩者的增長(zhǎng)率分別為96.47%和81.18%。這表明，塊莖蛾取食會(huì)引起3個(gè)品種馬鈴薯葉片單寧含量的增加，‘青薯9號(hào)’的單寧含量整體增幅最多，‘米拉’和‘合作88’的單寧含量平均增加量相當(dāng)。

2.3.2對(duì)類黃酮含量的影響

從圖6可以看出，取樣時(shí)間和處理方式都對(duì)3個(gè)馬鈴薯品種葉片的類黃酮含量產(chǎn)生了極顯著影響?！嗍?號(hào)’和‘合作88’中所有時(shí)間點(diǎn)塊莖蛾取食處理的類黃酮含量顯著高于同一時(shí)間的空白對(duì)照處理（圖6a，b）?！桌?、3h和96h塊莖蛾取食葉片處理的類黃酮含量相比空白對(duì)照無(wú)顯著差異，72h時(shí)顯著低于空白對(duì)照，其余時(shí)間點(diǎn)顯著高于空白對(duì)照處理（圖6c）。從類黃酮含量的增降率表（表1）中可以看出，與空白對(duì)照相比，‘青薯9號(hào)’和‘合作88’的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈正增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率分別為103.59%和103.57%。與空白對(duì)照相比，‘米拉’除了72、96h呈負(fù)增長(zhǎng)外，其余時(shí)間點(diǎn)都呈正增長(zhǎng)，平均增長(zhǎng)率為27.26%。這表明馬鈴薯塊莖蛾取食葉片后，會(huì)導(dǎo)致其類黃酮含量升高，‘青薯9號(hào)’和‘合作88’的增長(zhǎng)率最大，‘米拉’最小。

3結(jié)論與討論

本研究綜合考察了馬鈴薯塊莖蛾取食和不取食下3個(gè)馬鈴薯品種葉片防御酶活性和代謝物含量在時(shí)間上的動(dòng)態(tài)變化。總體來(lái)看，除了取樣時(shí)間（FT）對(duì)‘青薯9號(hào)’葉片的PPO酶活性沒有顯著影響外，其余處理中取樣時(shí)間和處理方式都對(duì)3個(gè)品種的各個(gè)指標(biāo)產(chǎn)生了顯著或極顯著的影響。

過氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)常見的抗氧化酶之一。本研究中3個(gè)品種被取食后CAT的平均活性與對(duì)照相比均升高，這與二斑葉螨侵?jǐn)_不同品種棉葉后其CAT活性升高的結(jié)果一致。馬鈴薯塊莖蛾取食葉片后，其CAT活性升高可能是為了清除線粒體電子傳遞、脂肪酸氧化以及光呼吸等過程中產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2），從而減輕活性氧自由基對(duì)植物造成的傷害。‘合作88’的CAT平均增加率最高，‘米拉’相比另兩個(gè)品種，其平均增長(zhǎng)率要低得多。一方面可能是由于‘合作88’對(duì)塊莖蛾取食最敏感，體內(nèi)CAT活性變化最劇烈，可能是CAT活性具有品種特異性，具體原因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。植物損傷的直接后果是細(xì)胞分隔被破壞，使PPO在氧氣存在的情況下，催化酚類化合物轉(zhuǎn)化為醌，醌具有與植物蛋白共價(jià)結(jié)合的能力，這種結(jié)合導(dǎo)致親核氨基酸的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)能力下降，從而抵御病蟲為害。本研究中‘合作88’的PPO活性平均增長(zhǎng)最高，且早在3h時(shí)就表現(xiàn)出塊莖蛾取食與對(duì)照的差異，而‘青薯9號(hào)’和‘米拉’分別在6h和12h才有顯著差異。PPO的過量表達(dá)在一定程度上能夠增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害的抗性。上述結(jié)果說明‘合作88’對(duì)塊莖蛾抗性要強(qiáng)于‘青薯9號(hào)’和‘米拉’。萜烯合成酶（TPS）是植物生物合成萜烯揮發(fā)物的關(guān)鍵酶。萜烯類化合物往往與植物一植食性昆蟲和植物一環(huán)境的相互作用和防御作用有關(guān)。萜烯合成酶的活性變化在一定程度上也可以反映植物受病蟲害侵?jǐn)_的程度。在本研究中，3個(gè)品種被塊莖蛾取食后其TPS活性均升高，‘合作88’平均增長(zhǎng)率略高于‘青薯9號(hào)’‘米拉’最低，說明‘合作88’抵抗馬鈴薯塊莖蛾的能力較強(qiáng)。目前植物與昆蟲互作有關(guān)TPS活性測(cè)定的研究較少，但TPS基因的研究很多，如大豆的（E，E） -a-法尼烯合酶基因GmAFS在大豆地上和地下器官中分別對(duì)線蟲和昆蟲具有防御作用。因此TPS基因的高表達(dá)可能使TPS轉(zhuǎn)錄物增加，從而使酶活性升高。

寄主植物的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)草食昆蟲的寄主選擇、取食、產(chǎn)卵等行為有著重要的影響作用。本研究中3個(gè)馬鈴薯品種被塊莖蛾取食后總氨基酸含量均下降，‘合作88，的平均下降率最大，‘青薯9號(hào)’和‘米拉’下降率相當(dāng)。研究表明松樹在思茅松毛蟲為害脅迫下，隨著受害程度的加重松針內(nèi)黃酮、單寧、總酚含量呈上升趨勢(shì)，可溶性糖、多糖、蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這和我們的結(jié)果是一致的。低濃度的葉片蛋白通常會(huì)導(dǎo)致食草動(dòng)物的生長(zhǎng)速度降低，這是植物抵御外來(lái)人侵的自我保護(hù)機(jī)制之一。

次生代謝物會(huì)對(duì)植食性昆蟲產(chǎn)生忌避、拒食甚至致死作用，可干擾其體內(nèi)酶活性，抑制其生長(zhǎng)發(fā)育等。單寧是一類多功能的天然酚類生物分子，其主要作用是保護(hù)植物免受昆蟲和真菌的侵害。類黃酮會(huì)在植物遭遇更加極端或持久性的脅迫時(shí)不斷合成積累，部分深入整合到脂質(zhì)雙層中，保護(hù)脂質(zhì)和膜蛋白免受氧化損傷；部分轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿中清除活性氧并抑制其生成。有關(guān)植物與昆蟲互作中次生代謝物的研究很多，如烏桕Triadica sebifera葉片遭受到紅胸律點(diǎn)跳甲Aphthonornorpha collaris為害日寸，其葉片的單寧含量顯著增加。在線蟲感染植物根的過程中類黃酮被誘導(dǎo)，與易感植物品種相比，在抗性植物中被誘導(dǎo)的程度更高。本研究中3個(gè)馬鈴薯品種被塊莖蛾取食后，單寧和類黃酮含量與對(duì)照相比均顯著升高，‘青薯9號(hào)’單寧的平均增長(zhǎng)率大于‘合作88’和‘米拉’，‘合作88'和‘米拉’的單寧平均增長(zhǎng)率相當(dāng)。而對(duì)于類黃酮，‘青薯9號(hào)’和‘合作88’的平均增長(zhǎng)率相當(dāng)，都遠(yuǎn)大于‘米拉’的類黃酮平均增長(zhǎng)率。由此看來(lái)，‘青薯9號(hào)’內(nèi)次生代謝物對(duì)塊莖蛾取食的敏感度更高，變化更劇烈。