兩種林木植原體病害的分子鑒定

關(guān)鍵詞植原體；沙棘；油松；16S rRNA：tuf基因；RFLP分析

2021年-2022年在沙棘主產(chǎn)區(qū)山西呂梁的沙棘Hippophae tharnnoides上出現(xiàn)了一種疑似植原體引起的病害，該癥狀與胡建忠等描述的內(nèi)蒙古沙棘生態(tài)工程區(qū)發(fā)生的沙棘縮葉病的癥狀極為相似。主要癥狀為新梢頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的幼葉變形卷縮，后逐漸向莖擴(kuò)展，造成莖扭曲。他們認(rèn)為該病害是由植原體引起，但未對(duì)其病原進(jìn)行鑒定。2022年9月，在北京延慶冬奧園區(qū)內(nèi)，部分油松Pi-nus tabul-iformis出現(xiàn)了針葉變短變小，分枝過(guò)度生長(zhǎng)，側(cè)枝形成球狀結(jié)構(gòu)等癥狀。該癥狀與裸子植物上的植原體病害的癥狀極為相似，當(dāng)植原體侵染松科植物后常常造成叢枝、側(cè)枝形成球狀結(jié)構(gòu)、針葉短小和植株生長(zhǎng)遲緩等癥狀。目前發(fā)現(xiàn)至少有4個(gè)16Sr亞組的植原體可侵染松屬植物并引起叢枝病害。Schneider等首次證實(shí)德國(guó)和西班牙等地表現(xiàn)出典型叢枝癥狀的歐洲赤松是由植原體引起，并將其作為16Sr XXI組的候選種。Sliwa等發(fā)現(xiàn)波蘭歐洲赤松上的植原體病害也是由該種引起。此外，研究者陸續(xù)從多種松屬植物上發(fā)現(xiàn)多個(gè)亞組的植原體。例如，Valiunas等認(rèn)為侵染矮赤松和歐洲赤松的植原體屬于16Srl-A亞組。Babaei等報(bào)道了引起土耳其松叢枝病的16SrⅥ-A亞組植原體。Ivanauskas等則報(bào)道了歐洲赤松上的16Sr XCl-C和亞組植原體，并證實(shí)蚜蟲可攜帶16Sr亞組的植原體。但截至目前，我國(guó)尚未有松科植物上的植原體相關(guān)病害的報(bào)道。

植原體phytoplasma，原稱類菌原體（mycoplas-ma-like organism，MLO），隸屬于細(xì)菌界Bacteria柔膜菌綱Mollicutes，是一類無(wú)細(xì)胞壁、非螺旋結(jié)構(gòu)的原核生物。植原體專性寄生在韌皮部，難以在體外人工培養(yǎng)，因此無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)形態(tài)等傳統(tǒng)方法進(jìn)行分類和鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，血清學(xué)、核酸雜交技術(shù)和PCR技術(shù)等越來(lái)越多地應(yīng)用在植原體的鑒定和檢測(cè)領(lǐng)域。目前主要依據(jù)16SrRNA基因序列同源性和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment

length polymorphism， RFLP）分析對(duì)植原體進(jìn)行組和亞組的劃分，通過(guò)與所有已知植原體16S rRNA基因的F2nR2序列進(jìn)行比較來(lái)確定組別。當(dāng)相似系數(shù)（F）≤0.85，劃分為一個(gè)新的植原體16Sr組；當(dāng)0.850.97，則被劃分為已有16Sr亞組的不同株系或變種。此外，由于16SrRNA基因序列的高度保守性，常利用熱不穩(wěn)定延伸因子（elongation factor Tu）基因（tuf）、核糖體蛋白（ribosomal protein）基因（rp）及分泌蛋白（secretion proteins）基因（secY）等，進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，進(jìn)行亞組的準(zhǔn)確鑒定。

本研究利用熒光顯微觀察技術(shù)，16S rRNA基因和tuf基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，以及16S rRNA基因的虛擬RFLP分析，對(duì)引起沙棘和油松病害的病原（疑似植原體）進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，并明確其分類地位。研究結(jié)果將為這兩種植物的植原體相關(guān)病害的快速分子檢測(cè)和制定有效防控措施提供科學(xué)的參考資料。

1材料與方法

1.1材料

供試植物：幼葉變形皺縮的沙棘枝條和健康枝條采集于山西朔州（2022年6月）。出現(xiàn)叢枝癥狀的油松枝條和健康枝條采集于北京延慶冬奧森林公園（2022年9月）。樣品保存于北京林業(yè)大學(xué)森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的-80℃超低溫冰箱。

主要試劑：2×CTAB、2%2－巰基乙醇、苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、異丙醇、75%乙醇、l×TE、超純水、2×Power Taq PCR Master Mix。試劑購(gòu)于北京酷來(lái)搏科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1感病植株韌皮部組織的熒光顯微鏡觀察

材料固定：將感病植株的嫩莖切成0.5cm的莖段，放入5%的戊二醛固定液中，于4℃冰箱內(nèi)固定2h以上待用。切片：從固定液中取出莖段，用清水沖洗后，用0.1mol/l。磷酸緩沖液（pH 7.0）沖洗3次，使用Leica CM1950冰凍切片機(jī)包埋切片（厚20um）。DAPI染色：將切片浸泡在1.0ug/mLDAPI染色劑中染色5～10min。熒光顯微觀察：將染好色的切片放置在載玻片上，加蓋玻片后用吸水紙將四周液體吸干，放置在Leica DM 2500熒光顯微鏡下觀察（參數(shù)：透射光365nm，阻濾光420nm，WU紫光激發(fā)）。

1.2.2感病植株總DNA提取及PCR擴(kuò)增

切取發(fā)病部位及健康植株的幼嫩枝條，經(jīng)液氮速凍后充分研磨。采用CTAB法提取植物樣品的總DNA，溶解于50uL1×TE溶液，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

利用巢式PCR分別擴(kuò)增16S rRNA和tuf基因。其中，擴(kuò)增16S rRNA的第一輪引物對(duì)為P1/P7，第二輪引物對(duì)為R16F2n/R16R2；擴(kuò)增tuf基因的第一輪引物對(duì)為fTuf1/rTufl，第二輪引物對(duì)為fTufu/rTufu（表1）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。將植物總DNA作為模板用于第一輪PCR。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCRMix12.5uL，DNA模板1.0uL，ddH）O9.5UL，上、下游引物（10umol/L）各1.0uL。

擴(kuò)增16SrRNA基因的第一輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min; 94℃變性45s，53℃退火1min，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。第二輪PCR反應(yīng)程序：將退火溫度改為50℃，延伸時(shí)間改為1min 30s，其余程序及體系與第一輪PCR反應(yīng)相同。擴(kuò)增tuf基因的第一輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min; 95℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。第二輪PCR將退火溫度改為48℃，延伸時(shí)間改為1min，其余程序及體系與第一輪PCR相同。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋30倍用作第二輪PCR的模板。

1.2.3測(cè)序分析

利用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將明亮單一條帶的巢式PCR產(chǎn)物交由北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化、克隆及序列測(cè)定。利用SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，并在National Cen-ter for Biotechnology

Information（NCBI）中進(jìn)行Blast同源性分析。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

選取植原體16Sr組及各亞組的代表菌株，并以Acholeplasrna laidLacwii作為外群。利用MEGA7.0軟件，分別構(gòu)建基于16S rRNA和tuf基因的NJ（neighbor joining）系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)置為1000，樹圖分支節(jié)點(diǎn)處僅顯示高于50%的自展值。

1.2.516S rRNA基因的虛擬RFLP分析

通過(guò)植原體在線分類鑒定軟件iPhyClassifier（https：∥plantpathology. ba. ars. usda. gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier. cgi），利用17種限制性內(nèi)切酶對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行虛擬RFLP分析。

2結(jié)果與分析

2.1感病沙棘和油松的癥狀

感病沙棘的頂梢新葉扭曲皺縮，發(fā)病嚴(yán)重的小葉形成圓圈狀，簇生于頂端，并逐漸向下方的枝葉擴(kuò)展。感病油松的針葉變短小、過(guò)度分枝、部分嫩枝枯死，側(cè)枝形成球狀結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2韌皮部組織DAPI染色觀察

經(jīng)DAPI染色后，感病沙棘的嫩莖橫切片中，可觀察到韌皮部附近有特異的藍(lán)色熒光亮斑，熒光亮度強(qiáng)弱不同，呈不均勻分布狀。而健康沙棘的嫩莖的韌皮部未觀察到特異性藍(lán)色熒光亮斑（圖2）。此外，發(fā)病油松嫩莖的韌皮部未發(fā)現(xiàn)特異性藍(lán)色熒光亮斑，推測(cè)可能原因?yàn)橛退身g皮部的植原體含量過(guò)低。

2.316S rRNA和tuf基因PCR鑒定結(jié)果

巢氏PCR擴(kuò)增16S rRNA和tuf基因的電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：感病沙棘和油松均分別獲得約1.2kb和800bp的擴(kuò)增條帶。片段大小與泡桐植原體陽(yáng)性對(duì)照的大小一致，且健康植物組織DNA及以超純水為模板的陰性對(duì)照，均未擴(kuò)增出特異性條帶。因此，可初步確定沙棘葉片皺縮和油松叢枝均是由植原體侵染引起。

2.4植原體16SrRNA基因片段的序列分析

16SrRNA基因序列分析顯示，引起沙棘葉片皺縮的植原體含有1250個(gè)核苷酸，G+C的含量為46.88%。BLAST同源性比對(duì)顯示，其與16Srl組（aster yellows group，翠菊黃化組）植原體的序列相似性達(dá)99%以上。其中，與16Srl-D亞組的泡桐植原體株系相似性最高，達(dá)99.92%。與16SrL的水稻橙葉病植原體株系相似性為99.68%，與桑萎縮植原體序列相似性為99.76%，而與其他已知的100條16Sr工組序列的相似性均在99.60%以上。因此，認(rèn)為引起沙棘葉片皺縮的植原體應(yīng)歸屬于16Srl組。

引起油松叢枝的植原體16S rRNA序列含有1288個(gè)核苷酸，G+C的含量為47.44%。BLAST同源性比對(duì)顯示，其與16Sr工組各植原體的序列相似性達(dá)99%以上。其中，與16Srl-D亞組的狗尾草叢枝植原體株系相似性最高，達(dá)99.52%，與16Srl組的毛金竹叢枝病、泡桐叢枝植原體株系的相似性為99.44%，在相似性最高的近100條16Srl組序列中，與水稻橙葉病植原體株系的相似性最低（99.28%）。因此，認(rèn)為引起油松叢枝的植原體也屬于16Srl組。

2.5系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，引起沙棘葉片皺縮的植原體與16SrI-D亞組的泡桐叢枝植原體（OP107515.1）聚于同一進(jìn)化分支（圖3）。進(jìn)一步對(duì)其tuf基因與翠菊黃化植原體各亞組代表進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示：其與16SrI-D亞組的棣棠叢枝植原體（JN033200）和泡桐叢枝植原體（KP662171）聚于同一個(gè)進(jìn)化分支（圖4）。綜上，引起沙棘葉片皺縮的植原體隸屬于翠菊黃化組植原體（16Srl組），與16SrI-D亞組親緣關(guān)系最近。

16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：引起油松叢枝的植原體與16SrI-D亞組的Capsicu-rn annuzrrnleaf phytoplasma株系（FJ263617.1）和狗尾草叢枝病株系（FJ263625.1）處于同一進(jìn)化分支（圖5）。進(jìn)一步與翠菊黃化植原體各亞組代表進(jìn)行tuf基因序列分析，結(jié)果顯示：其與16SrI-D亞組的棣棠叢枝植原體（JN033200）和泡桐叢枝植原體（KP662171）聚于同一個(gè)獨(dú)立進(jìn)化分支（圖6）。綜上，引起油松叢枝的植原體也屬于翠菊黃化組植原體（16SrI組），與16SrI-D亞組親緣關(guān)系最近。

2.6虛擬RFLP圖譜與相似性系數(shù)分析

利用iPhyClassifier在線軟件，對(duì)兩種植原體的16SrRNA基因序列進(jìn)行了虛擬RFLP分析。結(jié)果表明：引起沙棘葉片皺縮的植原體的虛擬RFLP圖譜與16SrI-D組中的泡桐叢枝植原體（OP107515.1）相似系數(shù)為1.00，并且17種酶的電子酶切圖譜完全一致（圖7）。與16SrI-B的洋蔥黃化植原體組相似系數(shù)為0.98，與其他亞組的相似系數(shù)均低于0.97。該結(jié)果也與系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致，因此引起沙棘葉片皺縮的植原體屬于16SrI-D組。引起油松叢枝的植原體的虛擬RFLP圖譜與16SrI-D組中的狗尾草叢枝株系（FJ263625.1）相似系數(shù)為1.00，17種酶的電子酶切圖譜完全一致（圖8）。與16SrI-B的洋蔥黃化植原體組相似系數(shù)為0.98，與其他亞組相似系數(shù)均低于0.97。該結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致，因此引起油松叢枝的植原體屬于16SrI-D組。

但是，比較引起沙棘葉片皺縮的植原體和油松叢枝的植原體的虛擬凝膠圖譜，發(fā)現(xiàn)存在DraI、兩個(gè)酶切位點(diǎn)的差異（圖9）。

3結(jié)論與討論

本研究通過(guò)韌皮部熒光顯微觀察，結(jié)合16SrRNA和tuf基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，首次明確了沙棘葉片皺縮病和油松叢枝病均是由植原體引起的病害，并對(duì)其病原進(jìn)行了準(zhǔn)確的分子鑒定，認(rèn)為兩種植原體均屬于16SrI-D亞組，分別與泡桐叢枝植原體和狗尾草叢枝植原體的相似性最高。

植原體不具有寄主?；?，可通過(guò)昆蟲傳播，造成多種寄主感病。高瑞發(fā)現(xiàn)引起玫瑰叢枝病的植原體與泡桐叢枝植原體高度相似（99.7%），同屬于16SrI-D亞組。因此認(rèn)為玫瑰叢枝植原體可能是從與其僅相隔數(shù)米的泡桐叢枝病株上傳播過(guò)去的。王潔等從泡桐叢枝病樹周圍的7種其他植物中均檢測(cè)到植原體，且其16SrRNA基因序列與泡桐叢枝植原體高度相似。因此認(rèn)為這7種植物可能是泡桐叢枝病植原體的自然寄主或因昆蟲傳播偶爾被感染。杜銀銀對(duì)國(guó)槐帶化植原體的16SrRNA、rp和tuf等3個(gè)基因進(jìn)行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA基因的序列與泡桐叢枝植原體的相似性最高，達(dá)99.79%，因此認(rèn)為國(guó)槐帶化植原體是泡桐叢枝植原體的相關(guān)株系。本研究首次報(bào)道了由16SrI-D組植原體引起的油松叢枝病，認(rèn)為該植原體是狗尾草叢枝植原體的相關(guān)株系，并首次明確了引起沙棘葉片皺縮的植原體屬于泡桐叢枝植原體相關(guān)株系。二者均屬于植原體16SrI-D亞組，且二者的序列差異較小，僅存在Dra I、Mse I兩個(gè)差異酶切位點(diǎn)。因此，未來(lái)還需通過(guò)多基因序列分析，深入研究這2個(gè)植原體的遺傳變異規(guī)律。

本研究中，對(duì)發(fā)病油松韌皮部提取的DNA進(jìn)行普通PCR（利用植原體通用引物P1/P7）時(shí)，未檢測(cè)到植原體，熒光顯微觀察也未發(fā)現(xiàn)熒光亮點(diǎn)。但是，最終通過(guò)巢式PCR檢測(cè)到了油松叢枝植原體。推測(cè)是因?yàn)楦胁∮退傻捻g皮部所含的植原體濃度偏低。該結(jié)果與前人研究相符，認(rèn)為植原體在韌皮部中的分布具有不確定性和不均一性，造成其在植株體內(nèi)的濃度較低。Schneider等利用巢式PCR檢測(cè)到了歐洲赤松上的植原體，但并未在電鏡下觀察到。他認(rèn)為：裸子植物的篩孔較?。ㄟh(yuǎn)小于雙子葉植物的篩孔），可能會(huì)阻礙植原體的傳播。Sliwa等未通過(guò)普通PCR檢測(cè)到松樹相關(guān)植原體，而利用巢式PCR從5份DNA樣品中獲得了特定植原體DNA條帶。Kaminska等在對(duì)發(fā)病當(dāng)年的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過(guò)普通PCR和巢式PCR分別檢測(cè)到約15%和30%的供試松樹受到植原體感染。而到了次年，只通過(guò)巢式PCR檢測(cè)到了植原體。因此，植原體在裸子植物體內(nèi)的傳播和定殖方式，可能與雙子葉植物中不同。在松樹相關(guān)植原體的檢測(cè)中常常推薦使用巢式PCR。與普通PCR相比，巢式PCR可大大提高植原體檢測(cè)的靈敏度。未來(lái)在對(duì)裸子植物植原體病害進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)，將應(yīng)用靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的分子檢測(cè)技術(shù)，如LAMP、RPA等技術(shù)開展。

目前，全球共報(bào)道植原體有34個(gè)分組，正式命名有52種。其中，16SrI組植原體的寄主范圍廣泛，是多樣性最高的植原體類群I。在我國(guó)已報(bào)道的林木植原體病害中，也以16Sr工組的成員危害最嚴(yán)重，例如泡桐叢枝病等。但該亞組各種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、遺傳變異規(guī)律尚不清楚。關(guān)于沙棘植原體病害，目前僅我國(guó)內(nèi)蒙古、山西呂梁地區(qū)有報(bào)道。沙棘，作為水土保持、防沙治沙的優(yōu)良樹種，是山西、內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅等地極為重要的經(jīng)濟(jì)林木。因此，沙棘植原體病害的大面積暴發(fā)，將對(duì)未來(lái)的沙棘產(chǎn)業(yè)造成極大的損害。此外，油松是我國(guó)特有鄉(xiāng)土針葉樹種，在我國(guó)適生區(qū)達(dá)300萬(wàn)km2，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前我國(guó)尚未有其他松樹植原體病害的報(bào)道，在本研究中首次發(fā)現(xiàn)的油松植原體病害，為其他松樹植原體病害的早期檢測(cè)提供研究思路。未來(lái)我們將繼續(xù)開展沙棘植原體和油松植原體的快速分子檢測(cè)技術(shù)研究，為這兩種重要林木植原體病害的早期檢測(cè)和防治奠定基礎(chǔ)。

植原體病害主要由葉蟬、木虱等昆蟲進(jìn)行傳播。因此，防治植原體病害，需積極防治媒介昆蟲。目前，關(guān)于沙棘和油松植原體病害的傳播媒介尚不清楚。未來(lái)還需對(duì)這兩種植原體病害發(fā)生流行規(guī)律與田間介體昆蟲的密度、帶毒率、遷飛率等關(guān)系進(jìn)行深入研究，明確介體昆蟲在病害擴(kuò)散流行中的作用。此外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植原體的分類體系及株系間和亞組間的劃分會(huì)進(jìn)一步完善。這些研究將有助于理解寄主范圍廣泛的植原體的遺傳進(jìn)化和變異規(guī)律，也會(huì)為深入了解植原體與寄主（中間寄主，尤其越冬寄主），以及昆蟲介體的互作關(guān)系、為防治沙棘和油松植原體病害奠定更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。