侵染中國(guó)河北大豆的大豆花葉病毒的鑒定和全基因組序列分析

關(guān)鍵詞大豆花葉病毒；小RNA深度測(cè)序；基因組序列

大起源于我國(guó)，已有幾千年的種植歷史。由于其蛋白質(zhì)和油脂含量高，并含有異黃酮等功能性化合物，被用作糧食、油料及飼料。大豆在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到多種病原物的危害，其中大豆花葉病毒引起的大豆花葉病是世界上分布范圍廣泛、對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大的大豆病害之一。SMV也是我國(guó)三大大豆產(chǎn)區(qū)（東北、黃淮海、華南）最常見(jiàn)的大豆病害的病原。在自然條件下，受SMV侵染的感病大豆品種表現(xiàn)出花葉、褶皺和植株矮化等癥狀，并導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。SMV還可侵染大豆種子，導(dǎo)致種皮斑點(diǎn)及種子質(zhì)量下降，受病毒侵染的種子次年將成為主要的侵染源。

SMV為馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyuirus成員，其基因組為約9600個(gè)核苷酸組成的正義單鏈RNA，僅包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼11種成熟蛋白：P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、Nla-Pro、NIb和Cp。SMV可由蚜蟲(chóng)以非持久型方式傳播，還可以通過(guò)機(jī)械和種子傳播。SMV的寄主范圍非常窄，除大豆外，僅在西番蓮屬PassifLora、決明屬Senna、半夏屬和豇豆屬中有過(guò)自然感染的報(bào)道。

基于二代測(cè)序技術(shù)的小RNA測(cè)序（small RNAsequencing，sRNA-seq）于2009年出現(xiàn)，并首次被提出可以作為一種通用手段來(lái)檢測(cè)動(dòng)植物DNA或RNA病毒。該技術(shù)易于發(fā)現(xiàn)新病毒或新分離物，已被廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)。本研究利用小RNA深度測(cè)序方法在表現(xiàn)病癥的大豆葉片上檢測(cè)到6株SMV分離物，并通過(guò)分段克隆方法，獲得了SMV全基因組序列并進(jìn)行了同源性分析，這些為SMV的深入研究提供基礎(chǔ)，為SMV病害防控提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

大豆樣品于2022年8月采集自河北省盧龍縣農(nóng)戶自營(yíng)的大豆田塊，根據(jù)癥狀分成6組，每組混合作為一個(gè)樣品，編號(hào)為Gm1～Gm6，癥狀表現(xiàn)為，Gm1：葉肉黃綠相間；Gm2：葉肉黃綠相間并伴有褶皺；Gm3：葉肉密布褪綠黃點(diǎn)；Gm4：葉片嚴(yán)重皺縮、葉邊緣下卷、畸形；Gm5：葉片黃綠相間、皺縮、畸形；Gm6：葉片有凸起、嚴(yán)重褶皺、畸形（圖1）。

1.2植物總RNA的提取

采用小量總RNA提取試劑盒（簡(jiǎn)石生物）提取大豆葉片樣本的總RNA，使用NanoDrop微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（Thermo Scientific）測(cè)定濃度。

1.3小RNA文庫(kù)建立、測(cè)序及分析

文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及原始數(shù)據(jù)整理由北京奧維森基因科技有限公司完成。質(zhì)量合格的總RNA樣品采用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫(kù)，隨后使用Agilent 2100系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)qPCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，對(duì)不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后，利用Il-lumina NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。采用有參考基因組寄主病毒siRNA分析流程進(jìn)行候選病毒評(píng)估。

1.4病毒全長(zhǎng)基因組序列的獲取

根據(jù)小RNA深度測(cè)序結(jié)果及參考基因組序列，分別針對(duì)每個(gè)樣品設(shè)計(jì)5組特異性引物（Gm-SMV-F1/R1～F5/R5）用于擴(kuò)增病毒的中間序列，并設(shè)計(jì)2組引物（5-F/R和3-F/R）用于擴(kuò)增病毒的5'端和3'端序列（表1），以大豆葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠純化，克隆至pCE2 TA/Blunt-Zero載體（南京諾唯贊），利用通用引物M13F/M13R檢測(cè)陽(yáng)性克隆并測(cè)序。將獲得的序列進(jìn)行拼接得到病毒的全長(zhǎng)基因組序列。

1.5病毒基因組序列分析以及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用軟件Snapgene繪制病毒的基因組結(jié)構(gòu)；使用BLAST（blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast/）對(duì)獲得的病毒分離物序列進(jìn)行同源序列檢索；利用SDT軟件對(duì)得到的病毒分離物序列、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鄰近地區(qū)的SMV分離物以及部分其他馬鈴薯Y病毒屬分離物序列進(jìn)行比對(duì)；使用MEGA11.0進(jìn)行進(jìn)化分析，采用neighbor joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap設(shè)置為1000。

2結(jié)果與分析

2.1大豆葉片小RNA深度測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)6個(gè)大豆感病樣品進(jìn)行小RNA深度測(cè)序，獲得11357732～13370921條reads，除雜、拼接后獲得897～1621個(gè)contigs，經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的病毒序列進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定樣品感染病毒種類(lèi)（表2）。測(cè)序結(jié)果初步表明，河北大豆病葉混合樣品中可能只含有SMV病毒。

2.2病毒全長(zhǎng)基因組序列及結(jié)構(gòu)分析

擴(kuò)增的病毒基因組片段（圖2a）經(jīng)測(cè)序、拼接后得到9588nt（SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5）和9584nt （SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6）的病毒基因組序列各3條，上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)OR514681～OR514686。經(jīng)過(guò)BLAST分析發(fā)現(xiàn)SMV-Gml、SMV-Gm3和SMV-Gm5（登錄號(hào)：OR514681～OR514683）與SMV江蘇分離物（登錄號(hào)：MH919386）的基因組核苷酸序列的相似性較高，為98.06%～98.07%; SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6（登錄號(hào)：OR514684～（）R514686）與SMV韓國(guó)分離物（登錄號(hào)：FJ640954）的基因組核苷酸序列的相似性較高，為98.48%-98.51%。本研究獲得的SMV河北分離物的基因組均具有典型的馬鈴薯Y病毒屬基因組結(jié)構(gòu)特征，在基因組的第132位至第9332位核苷酸處存在1個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，編碼1個(gè)由3 067個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白（分子量349.74～350.24kD）。該多聚蛋白能夠加工成為10個(gè)成熟的蛋白質(zhì)，從N端到C端依次為：35.1～35.2kD的P1蛋白（132-1058nt）、52. 2～52.4kD的HC-Pro蛋白（1059-2429nt）、40.1kD的P3蛋白（2430-3470nt）、5.8kD的6KI蛋白（3471-3626nt）、71.2～71.4kD的CI蛋白（3627-5528nt）、6.1 kD的6K2蛋白（5529-5687nt）、22.1kD的VPg蛋白（5688-6257nt）、27.7 kD的NIa-Pro蛋白（6258-6986 nt）、59.6kD的NIb蛋白（6987-8537nt）和29.8～29.9kD的CP蛋白（8538-9332nt），并在P3蛋白內(nèi)移碼產(chǎn)生的1個(gè)26.6kD的P3N-PIPO蛋白（2430-3112nt）（圖2b）。

2.3SMV分離物與其他馬鈴薯Y病毒屬分離物的同源性分析

選取我國(guó)不同省份、日本和韓國(guó)的SMV分離物以及部分鄰近省份的其他馬鈴薯Y病毒屬分離物，利用SDT軟件兩兩比較這些病毒分離物與SMV6個(gè)分離物的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列以及編碼蛋白的氨基酸序列的同源性。結(jié)果表明，河北分離物SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5（登錄號(hào)：OR514681～OR514683）與SMV江蘇分離物（登錄號(hào)：MH919386）的核苷酸序列相似性較高，為98.1%，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的SMV河北分離物（登錄號(hào)：KR065437gt;的核苷酸序列相似性為92.6%-92.7%。其編碼蛋白的氨基酸序列（登錄號(hào)：WNY15496～WNY15498）分別與不同地區(qū)來(lái)源的SMV分離物具有較高的相似性：P1和6K2與山西（登錄號(hào)：AGR55588.1）和江蘇分離物（登錄號(hào)：AYR17245.1）相似性最高，為97.7%～100%，其中P1與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的SMV河北分離物（登錄號(hào)：ALF99870.1）的P1蛋白的相似性為66.3%～67.0%; HC-Pro和VPg與山西分離物相似性較高，為99.5%～100%；P3和P3N-PIPO與浙江分離物（登錄號(hào)：CAC86162.1）相似性較高，為98.6%-100%;6K1與浙江、山西和黑龍江分離物（登錄號(hào)：AKN90466.1）相似性最高，為100%; CI和NIa-Pro與江蘇分離物相似性較高，為99.4%～100%;NIb和CP與江蘇和浙江的分離物相似性較高，為99.2%～99.6%。

本研究獲得的河北分離物SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6（登錄號(hào)：OR514684～OR514686）與SMV韓國(guó)分離物（登錄號(hào)：FJ640954）相似性較高．達(dá)98.5%，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的SMV河北分離物（登錄號(hào)：KR065437）相似性為92.3%-92.4%。SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6編碼蛋白的氨基酸序列（登錄號(hào)：WNY15499～WNY15501）除NIa-Pro外，均與SMV韓國(guó)分離物（登錄號(hào)：ACU98939.1）具有較高相似性，為98.4%～100%，NIa-Pro則與北京（登錄號(hào)：QLL99540.1）、黑龍江、浙江和日本分離物（登錄號(hào)：BBG28435.1）相似性最高，為100%，而Pl與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的SMV河北分離物（ALF99870.1）的Pl蛋白的相似性為65.4%～65.7%。本研究獲得的SMV河北分離物與我國(guó)其他地區(qū)及日本、韓國(guó)的SMV分離物核苷酸序列均具有92%以上的相似性，而與鄰近省份其他種類(lèi)馬鈴薯Y病毒屬分離物相似性均低于80%。

通過(guò)比較本研究獲得的各分離物的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5和SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6之間差異相對(duì)較大的蛋白為6K2和P3，差異率分別為3.8%和3.7%～4.3%。兩組分離物在6K2蛋白序列上存在2個(gè)氨基酸的差異（圖3a），且在P3蛋白的C端出現(xiàn)較大差異（圖3b）。為明確該病毒分離物的系統(tǒng)進(jìn)化情況，利用上述進(jìn)行同源性比較的病毒分離物基因組全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。從圖中可以看出，本研究獲得的河北分離物SMV-Gml/SMV-Gm3/SMV-Gm5與SMV江蘇分離物具有較近的遺傳距離，并與江蘇、浙江和山西的SMV分離物聚為一小簇；而SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6與SMV韓國(guó)分離物具有較近的遺傳距離并聚為一小簇，所有SMV分離物聚為一大簇，與來(lái)自鄰近省份的其他馬鈴薯Y病毒屬分離物均有較遠(yuǎn)的遺傳距離。

3結(jié)論與討論

本研究利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)從河北大豆樣品中鑒定到SMV，按照國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（In-ternational Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）關(guān)于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬的劃分標(biāo)準(zhǔn)，病毒全長(zhǎng)基因組的核苷酸序列一致性低于76%即可劃分為新種。本研究測(cè)定的SMV-Gml～SMV-Gm6分離物的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列與GenBank中登錄的SMV分離物一致性最高為98.06%～98.51%，高于76%標(biāo)準(zhǔn)，因此，SMV-Gm1～SMV-Gm6是SMV的6個(gè)變體。值得一提的是，雖然Gm1、Gm5和Gm6樣品中通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)能夠檢測(cè)到CMV的RNA1片段，但是卻沒(méi)有CMV的RNA2和RNA3斤段。RT-PCR擴(kuò)增也沒(méi)有在這些大豆樣品中檢測(cè)到CMV的RNA2和RNA3。與此一致的是，之前的報(bào)道表明，CMV的RNAI能夠整合到大豆基因組中，產(chǎn)生大量針對(duì)CMV RNA1的小RNA，從而可能傳遞對(duì)CMV的抗性。所以，我們檢測(cè)到的CMV RNA1來(lái)源的小RNA可能是整合到寄主DNA后轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)生的小RNA，而不是CMV病毒侵染產(chǎn)生的小RNA。

本研究鑒定到的6個(gè)SMV河北分離物中，SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5序列之間相似性最高，且與江蘇省分離物（登錄號(hào)：MH919386）的相似性達(dá)到98.06%-98.07%，而SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6之間相似性最高，且與韓國(guó)分離物（登錄號(hào)：FJ640954）相似性達(dá)到98.48%～98.51%；氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SMV-Gm1、SMV-Gm3和SMV-Gm5的氨基酸序列分別與不同地區(qū)的SMV分離物有較高的相似性；而SMV-Gm2、SMV-Gm4和SMV-Gm6的氨基酸序列則主要與SMV韓國(guó)分離物有較高相似性。但本研究獲得的SMV分離物的PI蛋白與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的SMV河北分離物的P1蛋白相似性?xún)H為65.4%～67.0%，文獻(xiàn)報(bào)道表明，SMV容易與其他病毒復(fù)合侵染而發(fā)生重組，推測(cè)本研究獲得的SMVP1蛋白是由SMV和菜豆普通花葉病毒（bean common mosaic vlrus，BCMV）在P1編碼區(qū)重組而來(lái)。

本研究中參與鑒定的6個(gè)樣品在癥狀上存在一定程度的差異，通過(guò)比較各分離物的氨基酸序列，我們發(fā)現(xiàn)6K2蛋白和P3蛋白的C端在兩組樣品SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5和SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6之間存在較大差異。報(bào)道表明，6K2蛋白可參與病毒復(fù)制、運(yùn)動(dòng)和癥狀的形成，而P3蛋白的C端可決定癥狀差異，推測(cè)這可能是導(dǎo)致田間大豆植株癥狀差異的部分因素。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5與浙江、江蘇和山西SMV分離物聚為一小簇，且與黑龍江和日本的分離物遺傳距離較近，而SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6僅與韓國(guó)分離物聚為一小簇，表明SMV-Gm1/SMV-Gm3/SMV-Gm5的基因型在我國(guó)分布范圍較廣，而SMV-Gm2/SMV-Gm4/SMV-Gm6的基因型可能由韓國(guó)傳播而來(lái)。