掃描微量熱法研究稀腐植酸水溶液

A. N. Danilenko, E.E.Braudo, N.E.Pavlovskaya, E.I.Yushkova, I.L.Zhuravleva著

尹晗迪4譯

（1 俄羅斯科學院伊曼紐爾生化物理研究院 莫斯科 119991

2 俄羅斯奧廖爾州農(nóng)業(yè)大學 奧廖爾 302019

3 俄羅斯奧廖爾州立大學藥檢所 奧廖爾 302028

4 蘭州大學化學系 蘭州 730000)

掃描微量熱法研究稀腐植酸水溶液

A. N. Danilenko1, E.E.Braudo1, N.E.Pavlovskaya2, E.I.Yushkova3, I.L.Zhuravleva1著

尹晗迪4譯

（1 俄羅斯科學院伊曼紐爾生化物理研究院 莫斯科 119991

2 俄羅斯奧廖爾州農(nóng)業(yè)大學 奧廖爾 302019

3 俄羅斯奧廖爾州立大學藥檢所 奧廖爾 302028

4 蘭州大學化學系 蘭州 730000)

用反相柱色譜檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同時間的動物擾動堆肥堆制所獲得的腐植酸是由親水組分和疏水組分組成的，其中疏水組分大體上含有較低的帶電基團，這些帶電基團很可能是羧酸。在差示掃描量熱法測定腐植酸的稀溶液做出的熱容-溫度圖中發(fā)現(xiàn)了在約58 ℃時有一個轉(zhuǎn)折，這表明疏水基團水合作用的增加。我們還發(fā)現(xiàn)了在86～90 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)有一個熱容的突增，這可能是由于“膠束”內(nèi)部的疏水基團的水合作用，因為類似膠束結(jié)構(gòu)的疏水核有“脫玻作用”。這表明了隨著堆肥時間的增加，腐植酸疏水組分的相對含量和熱轉(zhuǎn)變的協(xié)同性也增加，它以熱容突增的形式表現(xiàn)出來，這很可能是因為“膠束”大小的增加。

腐植酸 疏水性 高效液相色譜 掃描微量熱法 熱容

腐殖質(zhì)是在有機碳死亡的轉(zhuǎn)化過程中形成的，存在于土壤、泥炭、煤、水庫等地。它可以區(qū)分為以下幾組：（1) 腐植酸（HuA)，只能溶于堿性溶劑中；（2) 吉馬多美朗酸，從用乙醇萃取腐植酸之后的潮濕殘余物（膠狀)中提取出來的；（3) 葉酸，可溶于水、堿或酸性溶液。有機殘余物轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)的過程被稱為腐殖化過程。這個過程是憑借生物體的參與和純粹的氧化、還原、水解、縮合等化學反應而實現(xiàn)的。腐殖質(zhì)是在生物體外具有最穩(wěn)定形態(tài)的碳有機化合物，它們的分子量組成從30 kDa到50 kDa，而葉酸則小于6 kDa。這兩種物質(zhì)在化學組成和分子質(zhì)量上是不均勻的。腐殖質(zhì)的主體是由酚類殘基構(gòu)成的，而外圍部分則由糖類和氨基酸殘基構(gòu)成。

直到現(xiàn)在，腐殖質(zhì)的準確化學結(jié)構(gòu)還未確定，僅僅有一些假設模型和結(jié)構(gòu)片段。然而，眾所周知，腐植酸在溶液中有著線圈構(gòu)象，被看成是有著不含水的疏水核和相對親水的外圍的“膠束”（類膠束結(jié)構(gòu))。但還缺少了稀溶液中“膠束”的部分熱力學函數(shù)的數(shù)據(jù)，特別要關注于與腐植酸的結(jié)構(gòu)和物理化學性質(zhì)有關的熱力學參數(shù)的研究。在這個工作中，我們研究了腐植酸的熱力學參數(shù)的改變和動物擾動堆肥的過程對“膠束”組成的改變。

1 試驗部分

動物堆肥的樣品是使用Staratel種蠕蟲的馬堆肥，動物堆肥時間分為1.5、3、和6個月（分別為樣品2、3、4)，用原始的馬堆肥作為對照（樣品1)。樣品需要在瓷研缽中徹底地研磨，并用3 mm孔徑的濾網(wǎng)過濾。在濾過的樣品中，取出5 g干燥至恒重（一式三份)用以測定其濕度。為了分離腐植酸，3份樣品都要稱重來收集5 g干物質(zhì)。腐植酸的分離和純化按照相關文獻中描述的方法進行。最后一步將腐植酸小球放入可濾過小于2 kDa的分子的透析袋，在蒸餾水中透析24 h。在裝有P2O5的真空干燥器中干燥腐植酸，將備好的樣品裝入燒杯，放入充滿氮氣的干燥器，儲存在4 ℃的冰箱中。

色譜法和量熱法研究所需的腐植酸溶液配制如下：稱取用上述方法制得的干燥腐植酸樣品各50 mg，在磁力攪拌下溶于5 mL 0.1 N的NaOH溶液。將此溶液置入可濾過小于2 kDa的分子的透析袋，在含有0.4 M NaCl，pH7.6的0.1 M磷酸鹽緩沖液中透析過夜。

色譜法研究所需的溶液可用和量熱法相同的方法制備，但需要用50 mM的pH7.6的磷酸鹽緩沖溶液進行透析。所得的腐植酸溶液的濃度是由干燥至恒重時鹽的余量來決定的。

腐植酸的色譜研究使用的是配備了可獲取和處理色譜數(shù)據(jù)的電腦的Gilson色譜儀，使用了Macrosphere C8，300A，250×4.6 mm色譜柱。分離腐植酸使用的流動相是：洗脫液A，10 mM，pH 7.6，含有6 mM四丁基溴化銨（TBAB)以及沒有TBAB的磷酸鹽緩沖液；洗脫液B，100%的含有6 mM四丁基溴化銨（TBAB)以及沒有TBAB的乙腈。色譜分析法用以下的方法進行：0～10 min用洗脫液A進行等度洗脫，10～30 min從100%的A到90%的B進行梯度洗脫，30～40 min用洗脫液B進行等度洗脫。洗脫液流速是1 mL/min，樣品體積是100 μL（c=1.0 mg/mL)。色譜峰的檢測使用了220 nm的紫外檢測器。

高靈敏度熱量測定使用了DASM-4A絕熱掃描微量熱計（莫斯科普希諾RAS生物儀器研究所)，工作單元體積為0.4672 cm3。每次實驗的熱容比都用焦耳倫茨效應進行校正，溫度掃描范圍從20 ℃到120 ℃，加熱速率為2 ℃/min，腐植酸溶液濃度為6 mg/mL。

2 結(jié)果與討論

圖1為樣品4的色譜圖（其他樣品的色譜圖類似)，分別用含離子對試劑四丁基溴化銨和不含它的洗脫液洗脫出來（分別為圖1b和1a)。不含四丁基溴化銨的色譜圖有兩個峰：峰1對應的是部分疏水腐植酸，因為它們被水從色譜柱中洗脫出來，保留時間較低；峰2對應的是用70%的乙腈洗脫出來的疏水腐植酸。在洗脫液中加入了四丁基溴化銨后，峰1消失了，同時，峰2的面積相應的增加了。這樣的現(xiàn)象為所有腐植酸樣品的共性。因此，有理由認為圖1a中峰1和2之間的差異主要是由腐植酸的離子化基團的含量決定?？紤]到實驗是在pH7.6的條件下進行，這個基團最有可能是羧基。根據(jù)相關文獻數(shù)據(jù)，大量的腐植酸中包含的這些基團的量為3～7 mM/g。值得注意的是，帶電基團同樣出現(xiàn)在疏水部分的腐植酸中（圖1a，峰2)，當在洗脫液中加入四丁基溴化銨后，疏水部分洗脫時間從28 min增加到了31 min，峰也變得對稱了（圖1b)。

圖1 腐植酸色譜圖(動物擾動堆肥0月)Fig.1 Chromatogram of humic acids (0 month of vermicomposting)

表1中我們列出了使用不含四丁基溴化銨的洗脫液洗脫時獲得的所有腐植酸樣品的色譜數(shù)據(jù)。可以看出，第二部分腐植酸的相對含量隨著動物擾動堆肥的時間增長而增加。這個事實連同在洗脫液中加入四丁基溴化銨時獲得的色譜數(shù)據(jù)證明了在動物擾動堆肥的過程中帶電基團的含量有下降的趨勢。

表1 腐植酸的高效液相色譜分析結(jié)果Tab.1 Results of analysis of humic acids by high performance liquid chromatography

在圖2中展示了與其他樣品隔絕的不同動物擾動堆肥時間的腐植酸樣品的熱分析圖。所有的熱分析圖都有相似的形式（未提供動物擾動堆肥1.5個月的熱分析圖)。在A-B段的熱分析圖中，熱容Cp隨著溫度的升高而增加，而從B點（約58 ℃)開始下降（B-C段)。換句話說，熱容與溫度的關系在A-B段溫度增量為正值（?Cp/?T＞0)，在B-C段為負值（?Cp/?T＞0)，這是具有高度疏水性的物質(zhì)的特征。就這樣，在大約58 ℃時，“膠束”發(fā)生了結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，而且伴隨著疏水基團水合作用的提高。

在C-D段，腐植酸的熱容在很窄的區(qū)間內(nèi)發(fā)生了猛增，表示這個轉(zhuǎn)變的熱力學參數(shù)（中轉(zhuǎn)變溫度，轉(zhuǎn)變區(qū)間，熱容突增量)不依賴于此區(qū)間的掃描速度0.5～4 ℃/min。在此基礎上，我們可以認為這個轉(zhuǎn)變過程程現(xiàn)平衡態(tài)。我們認為這個轉(zhuǎn)變反映了疏水基團形成“膠束”核的水合作用是由于微胞內(nèi)流動性的突增，也就是膠束的疏水核的脫玻作用。

經(jīng)歷了不同時間的動物擾動堆肥隔離堆制出的腐植酸轉(zhuǎn)變的熱力學特征列于表2?？梢钥闯?，動物擾動堆肥的過程不影響熱容突增量，然而轉(zhuǎn)變溫度隨著堆肥時間的增長而增加，轉(zhuǎn)變區(qū)間則隨著堆肥時間的增長而減小。后者意味著堆肥的過程中存在著轉(zhuǎn)變協(xié)同效應程度的增長，這明確地證明了“膠束”質(zhì)量的增加。

如前所述，“膠束”的熱躍遷可能與“膠束”疏水核的脫玻效應還有疏水基團的水合作用有關。的確，眾所周知，腐殖質(zhì)（腐植酸和葉酸)的脫玻效應的熱容突增不超過0.03 J/（g·K)。因此，我們所觀測到的熱容突增[0.6 J/（g·K)]幾乎全部是由于脫玻的“膠束”核的疏水基團的水和作用產(chǎn)生的。

圖3a，b為熱轉(zhuǎn)變區(qū)間的溫度和寬度對疏水組分在樣品中的含量所作的圖?？梢钥闯鰺徂D(zhuǎn)變溫度大致以指數(shù)形式隨著腐植酸疏水性的增加而增加。同時，轉(zhuǎn)變溫度區(qū)間的寬度（協(xié)同性的程度)隨著樣品疏水性的增加而減小。因此，隨著堆肥時間的增加，腐植酸疏水性增加，還伴隨著熱容突增的協(xié)同性的增長，這明顯是由于“膠束”質(zhì)量（更確切地說是動力學單元的平均數(shù))的增加。

圖2 不同動物擾動堆肥時間的腐植酸溶液的熱分析圖Fig.2 Thermograms of solutions of humic acids from vermicomposts of different time of vermicomposting

表2 腐植酸稀溶液的熱容突增參數(shù)Tab.2 Parameters of the jump in heat capacity of humic acids in dilute solution

圖3 在不同動物擾動堆肥時間堆制所得的腐植酸的“膠束”熱躍遷溫度(a)和溫度區(qū)間寬度(b)與疏水組分組成的相對含量(F2,%)之間的依存關系Fig.3 Dependences of temperature (a) and width of temperature interval (b) of thermal transition in “micelles” of humic acids in vermicomposts of different time of vermicomposting on the relative content in their composition of the hydrophobic fraction (F2, %)

3 結(jié)論

在不同時間動物擾動堆肥隔離堆制的腐植酸的稀溶液中，在86～90 ℃的溫度區(qū)間，發(fā)現(xiàn)了一個熱容的突增，明顯是以“膠束”核的疏水基團的水合作用為前提條件的。

動物擾動堆肥時間的增加導致腐植酸非極性組分含量的升高，其特點是電荷含量相對較低。除此之外，動物擾動堆肥時間的增加使熱容突增的溫度升高，其協(xié)同性也增加。

略)

譯自：Biophysics，2011，56(1)：47～50。

圖9 風化煤腐植酸對1號土壤中水穩(wěn)性團聚體的影響Fig.9 Effect of weathered coal humic acid on water stable aggregate in No. 1 soil

圖10 風化煤腐植酸對2號土壤中水穩(wěn)性團聚體的影響Fig.10 Effect of weathered coal humic acid on water stable aggregate in No. 2 soil

綜上，活化的風化煤腐植酸可以更好地促使分散的土壤顆粒團聚，形成團粒，增加土壤中水穩(wěn)性團粒的含量和穩(wěn)定性，改善通氣透水性。

3 結(jié)論與討論

腐植酸是含有多種含氧活性官能團的高分子有機膠體，在改良土壤結(jié)構(gòu)、培肥地力等方面起著重要作用[5]。本試驗結(jié)果表明，單施未活化的和活化的風化煤腐植酸對土壤中全氮含量無明顯效果，但可活化和釋放土壤中難溶性磷、礦物態(tài)鉀、緩效性鉀，使其轉(zhuǎn)化成速效磷和速效鉀，便于作物吸收和利用。其中，活化的風化煤腐植酸效果更好，可使土壤中速效磷增加24.80～130.87 mg/kg，速效鉀的含量增加43.01～113.19 mg/kg，使土壤中CEC增加8.87～9.49 cmol/kg、土壤水穩(wěn)性團聚體總量增加8.01%～18.84%，有益于土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化、累積和土壤肥力的提高，為植物生長提供必需的生態(tài)環(huán)境。

參考文獻

[ 1 ]李立華，趙墾田，邵貴順.土壤團粒結(jié)構(gòu)管理[J]. 吉林林業(yè)科技，2006，35（5)：11～12，25

[ 2 ]文娜，楊波濤.腐植酸肥料對土壤的改良作用及其測定方法[J]. 新疆化工，2007，（4)：18～19，15

[ 3 ]王曰鑫，栗麗.腐植酸對化學肥料的增效作用研究[J].腐植酸，2007，（2)：22～27

[ 4 ]侯高禮.土壤團粒結(jié)構(gòu)及其促進形成[J]. 西北園藝，2013，（1)：52～53

[ 5 ]王宏韜，馬獻發(fā)，張繼舟.腐植酸在土壤與肥料中的應用[J]. 黑龍江科學，2010，1（1)：59～62

A Study of Dilute Aqueous Solutions of Humic Acids by Scanning Microcalorimetry

A. N. Danilenko1, E.E.Braudo1, N.E.Pavlovskaya2, E.I.Yushkova3, I.L.Zhuravleva1write
Yin Handi4translate
(1 Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991
2 Orel State Agricultural University, Orel, 302019
3 Medical Institute, Orel State University, Orel, 302028
4 Department of Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou, 730000)

It has been found by reversed-phase chromatography that humic acids obtained from vermicomposts of different duration of vermicomposting consist of a hydrophilic and a hydrophobic fractions, the hydrophobic fraction having a substantially lower content of charged, probably carboxylic, groups. A change in the sign of the temperature dependence of the heat capacity of dilute aqueous solutions of humic acids at ～58 °C has been found by differential scanning microcalorimetry, which indicates an increase in the hydration of hydrophobic groups. A jump-wise increase in heat capacity in the temperature range from 86 to 90 °C was also found, which is perhaps due to hydration of hydrophobic groups in the interior of “micelles”, because of “devitrifcation” of the hydrophobic nucleus of micelle-like structures. It was shown that increasing the duration of vermicomposting leads to an increase in the relative content of the hydrophobic fraction of humic acids and in the cooperativity of the thermodynamic transition, which manifests itself as the jump of heat capacity, which probably results from the increase in the “micelle” size.

humic acids; hydrophobicity; high-performance liquid chromatography; scanning microcalorimetry; heat capacity

TQ314.1

A

1671-9212(2014)06-0032-05

2013-09-30

尹晗迪，女，1991年生，在讀碩士研究生。主要從事溶液化學研究。E-mail：yinhandi@126.com。