LED3A強(qiáng)化黑麥草對(duì)水體中Cu的耐性積累及提取效果研究

摘要：

通過水培試驗(yàn)考察了Cu脅迫下N-十二?；叶啡宜猁}（LED3A）對(duì)黑麥草生長(zhǎng)和抗氧化響應(yīng)、植株中Cu的亞細(xì)胞含量和分布變化，以及LED3A增效植物對(duì)Cu的提取效果.結(jié)果表明，LED3A施加量對(duì)黑麥草根和莖葉生物量影響不大;隨LED3A濃度升高，黑麥草植株超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性呈先增后減趨勢(shì)，而植株體內(nèi)超氧陰離子（O-2·）、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量呈先降后升趨勢(shì)，說明抗氧化防御系統(tǒng)被激活，利于清除活性氧（ROS）.LED3A能顯著促進(jìn)Cu在黑麥草體內(nèi)的吸收和積累，并影響Cu在細(xì)胞壁和液泡中的分布.Cu+LED3A（L10～L200）較L0顯著提高了黑麥草根和莖葉部的Cu含量，增幅分別為10.39%～44.25%和2.33%～18.81%，植株總Cu積累量相應(yīng)提高11.64%～37.79%.最佳LED3A處理下，Cu的去除率達(dá)到76.00%.LED3A可通過螯合誘導(dǎo)作用促進(jìn)黑麥草對(duì)Cu的吸收提取和耐性積累，有效提高植物對(duì)Cu的修復(fù)效率.

關(guān)鍵詞：LED3A；黑麥草；強(qiáng)化植物修復(fù)；Cu

中圖分類號(hào)：X 173;X 53""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：1001-988Ⅹ（2024）04-0035-07

Tolerant accumulation and extraction of Cu from contaminated

water by ryegrass under LED3A enhanced remediation

YAN Li-tian，DIAO Jing-ru，DONG Ge-jun，XIAO Qi-zan

（School of Environmental and Municipal Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，Gansu，China）

Abstract：This work examined the effects of N-dodecyl ethylenediamine triacetate（LED3A）" on ryegrass growth，antioxidative responses，Cu subcellular content and distribution，as well as the efficacy of LED3A-enhanced Cu extraction by plants.The results indicated that the application dosages of LED3A produce slight impact on ryegrass biomass.With the increase of LED3A concentration，the activities of superoxide dismutase （SOD），peroxidase（POD） and catalase（CAT） of ryegrass first increase and then decrease，while the contents of superoxide anion（O-2·），hydrogen peroxide（H2O2） and malondialdehyde（MDA） first decrease and then increase，due to enhancing its

antioxidant defense system，which facilitates the removal of reactive oxygen species（ROS） and reduces

oxidative stress.LED3A significantly promotes the uptake and accumulation of Cu in ryegrass and affects the distribution of Cu in cell walls and vesicles.Compared to L0，Cu+LED3A treatments（L10 to L200）result in an increase of Cu content in roots，stems and leaves by 10.39% to 44.25% and 2.33% to 18.81%，respectively.The total Cu accumulation of the plant is increased correspondingly by 11.64% to 37.79%.At the optimal dosage of LED3A，the removal efficiency of Cu is reached 76.00%.LED3A can promote the extraction and tolerance accumulation of Cu in ryegrass through chelation-induced mechanisms，and effectively increase the remediation efficiency of Cu by plants.

Key words：LED3A;ryegrass;assisted phytoremediation;Cu

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，礦產(chǎn)開采、金屬冶煉、農(nóng)藥施用和畜禽養(yǎng)殖等人為活動(dòng)使越來越多的Cu進(jìn)入環(huán)境造成污染.我國(guó)土壤Cu點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)2.1%［1］，工業(yè)排放污水中Cu濃度可達(dá)到1 000 mg·L-1［2］，嚴(yán)重威脅生態(tài)系統(tǒng)和人類健康.動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)作為主要的農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，所產(chǎn)生的Cu污染問題不容小覷.據(jù)報(bào)道，大型豬場(chǎng)和牛場(chǎng)養(yǎng)殖模式廢水中Cu含量為1.92～9.81 mg·L-1［3］，典型規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖排泄的豬糞和雞糞中Cu含量分別為10.7～1591 mg·kg-1和18.6～775 mg·kg-1［4］.畜禽養(yǎng)殖廢水中有機(jī)物濃度高、色度高、風(fēng)險(xiǎn)污染物多等因素加大了生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，也加劇了畜禽養(yǎng)殖廢水資源化利用難度［5］.因此，開展養(yǎng)殖業(yè)含Cu污水的修復(fù)治理研究具有重要意義.

重金屬污染的植物修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的綠色修復(fù)技術(shù)，主要原理是通過植物根系交換吸收和非代謝結(jié)合作用，使游離重金屬離子進(jìn)入根部，并利用共質(zhì)體途徑將其運(yùn)輸?shù)角o葉中，通過植物萃取去除重金屬污染物［6］.植物提取效率會(huì)受到其生長(zhǎng)適應(yīng)能力、生物量、抗逆耐性以及污染物含量等的影響，使植物修復(fù)技術(shù)往往存在修復(fù)周期長(zhǎng)、效率低等局限性.為了彌補(bǔ)植物修復(fù)技術(shù)的不足，人們利用螯合劑來強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染［7-9］.

目前，常用于強(qiáng)化植物修復(fù)的試劑中，合成螯合劑（乙二胺四乙酸EDTA、二乙烯三胺五乙酸DTPA等）增效性能好，但降解能力差、生物毒性大，具有潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)［10］，而可降解的天然螯合劑（如蘋果酸、檸檬酸）對(duì)植物修復(fù)重金屬污染的強(qiáng)化作用有限，難以實(shí)際應(yīng)用［11-12］.近幾年，EDTA的雙親性衍生物N-十二?；叶啡宜猁}（LED3A）在重金屬污染修復(fù)中的應(yīng)用受到了學(xué)者關(guān)注［13］，該試劑具有螯合配位能力強(qiáng)且易生物降解的特點(diǎn)［14］.前期研究表明，LED3A與Cd2+離子能夠形成穩(wěn)定可溶的配合物，誘導(dǎo)促進(jìn)植物對(duì)水體中Cd的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［15］.

為了進(jìn)一步研究LED3A聯(lián)合植物修復(fù)Cu污染水體的耐性積累及提取效果，文中以黑麥草（Lolium perenne L.）作為供試植物，通過水培試驗(yàn)，考查了LED3A對(duì)Cu脅迫下黑麥草生理生化指標(biāo)的影響，LED3A對(duì)黑麥草植株中Cu的分布、吸收積累及遷移轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并探討了LED3A螯合強(qiáng)化植物去除水體中Cu的效果和作用機(jī)制，以期為養(yǎng)殖廢水Cu污染問題提供植物修復(fù)新途徑及LED3A強(qiáng)化植物修復(fù)不同重金屬污染物的性能提供理論參考和對(duì)比依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試植物為寬葉型四倍體一年生黑麥草，品種為邦德，種子購(gòu)自河南華豐草業(yè)科技有限公司；培養(yǎng)液為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液.LED3A（純度95%，分子量482 g·moL-1），購(gòu)自杭州生物科技有限公司；Cu（SO4）·5H2O，HNO3，HF，HCl，氮藍(lán)四唑，核黃素等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司.

1.2 水培實(shí)驗(yàn)

挑選籽粒飽滿的黑麥草種子，經(jīng)10% H2O2溶液消毒10 min，去離子水清洗后浸種8 h，按照每份50粒均勻排列在育苗紙上（依定植籃底面裁剪），于恒溫培養(yǎng)箱中27 ℃避光催芽3 d，之后移入配有定植籃的培養(yǎng)瓶中，加入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液190 mL，室溫培育15 d，每日10000 lx光照14 h，定時(shí)補(bǔ)水，隨機(jī)調(diào)換位置，以保證長(zhǎng)勢(shì)一致，待幼苗具有完善根系后，用于后續(xù)強(qiáng)化提取實(shí)驗(yàn).

配置Cu含量為10 mg·L-1的1/2營(yíng)養(yǎng)液，添加一定量LED3A，使其濃度分別為0，10，25，50，100和200 mg·L-1，并調(diào)節(jié)pH至6.0，各處理用L10～L200標(biāo)記.將黑麥草幼苗根系洗凈后浸干水分，轉(zhuǎn)移至不同處理的溶液中，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，保持根部和溶液避光，適量補(bǔ)水以維持液面高度，12 d后對(duì)植物樣品進(jìn)行收割測(cè)定.

1.3 測(cè)定方法

對(duì)植物鮮樣的根和莖葉兩部分，分別稱量記錄.采用分光光度法（UV-1800）測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，以及丙二醛（MDA）、超氧陰離子（O-2·）和過氧化氫（H2O2）含量［16］.依據(jù)差速離心法（JW-2019HR冷凍離心機(jī)）分離植物組織的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，測(cè)定Cu的亞細(xì)胞分布［17］.以HNO3-HCl混酸（體積比4∶1）對(duì)植物樣品進(jìn)行消解（GH-X09微波消解儀）并測(cè)定Cu含量.植物根、莖葉樣品經(jīng)處理后，均采用原子吸收分光光度計(jì)（Varian 220FS，USA）測(cè)定Cu濃度.

黑麥草對(duì)Cu的積累量、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和去除率依據(jù)以下公式計(jì)算：

積累量=植物體內(nèi)Cu含量×植物生物量，

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=地上部Cu含量/根部Cu含量，

去除率=（全株總Cu積累量/水中Cu初始含量）×100%.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性差異檢驗(yàn)（Plt;0.05），Excel 2016和CorelDRAW進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制.圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；不同字母表示各處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，n=3）.

2 結(jié)果與分析

2.1 LED3A對(duì)黑麥草生物量的影響

生物量是衡量植物生長(zhǎng)和修復(fù)能力的一個(gè)重要指標(biāo)［18］.由表1可知，隨LED3A濃度的增加，黑麥草生物量先增后減，且根部生物量整體低于莖葉部，其中L25和L100處理的根和莖葉生物量分別達(dá)到最高值，較L0增加了12.01%和2.76%，而L50處理的總生物量最大，較L0增加了3.70%.可見，添加10～100 mg·L-1 LED3A作強(qiáng)化劑，對(duì)黑麥草均未表現(xiàn)出脅迫和毒害效應(yīng)，反而對(duì)其生長(zhǎng)略有促進(jìn)，且根部生物量增加較為明顯.Wenzel等［19］研究發(fā)現(xiàn)，EDTA和Cu共存能顯著提高甘藍(lán)型油菜的生物量，這與本研究結(jié)果相似.可能是LED3A促進(jìn)了植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，Cu-LED3A螯合物緩解了Cu對(duì)植物的毒性，從而改善了黑麥草的生長(zhǎng)狀況.雖然L200與L0處理相比，根部及總生物量略有下降，但植株整體均未表現(xiàn)出莖稈變細(xì)、植株發(fā)黃等現(xiàn)象，說明實(shí)驗(yàn)中LED3A的施用劑量對(duì)黑麥草的生長(zhǎng)無不良影響.

2.2 LED3A對(duì)黑麥草膜脂過氧化的影響

由圖1可知，單一Cu處理L0中，由于Cu能刺激脂氧合酶等活性升高，使細(xì)胞內(nèi)的O-2·和H2O2生成增加，導(dǎo)致活性氧升高［20］.添加LED3A可顯著降低黑麥草體內(nèi)的O-2·和H2O2含量（P＜0.05），且隨LED3A濃度的升高，整體呈先降后升趨勢(shì).其中，L50處理根和莖葉中O-2·含量均達(dá)到最低值， 相比于L0分別降低了15.00%和20.43%（圖1a）；而L50和L100處理下根和莖葉部H2O2含量分別達(dá)到最低值，較L0降低了28.34%和19.66%（圖1b）.可見，LED3A濃度為50 mg·L-1時(shí)對(duì)黑麥草的耐Cu調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，這是由于添加LED3A可誘使植物抗氧化酶活性增強(qiáng)，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，緩解活性氧引起的細(xì)胞膜脂過氧化，從而起到清除O-2·和H2O2的作用［21］.

圖1中根部O-2·含量顯著大于莖葉部， 這是因?yàn)楦底钕雀惺艿紺u脅迫，產(chǎn)生氧化信號(hào)，致使其O-2·含量高于莖葉部.而莖葉部H2O2含量明顯高于根部，則與螯合強(qiáng)化劑對(duì)植物根部CAT和POD含量的提高程度較大有關(guān)，由于CAT和POD是分解H2O2的兩種有效清除劑，可將更多的H2O2催化分解為H2O和O2，以維持H2O2的動(dòng)態(tài)平衡［22］；莖葉部存在較多的葉綠體、線粒體和過氧化物體等H2O2的產(chǎn)生器官，也是導(dǎo)致其H2O2含量高于根部的原因.

MDA是植物膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量常用于衡量細(xì)胞所受的氧化損害程度大小，可作為評(píng)價(jià)植物抗逆性強(qiáng)弱的有效指標(biāo)［23-24］.圖1c中，L10～L50處理能顯著降低黑麥草體內(nèi)MDA含量，根部MDA含量較L0處理有不同程度的降低，莖葉部差異不顯著.可能是LED3A將溶液中游離態(tài)重金屬轉(zhuǎn)化為絡(luò)合態(tài)重金屬，降低Cu的植物毒性，減輕對(duì)植株的傷害［25］.而處理L100～L200植株內(nèi)MDA增大，尤其是L200處理下膜脂過氧化程度明顯增大，說明200 mg·L-1 LED3A已過量.植株根部MDA含量明顯高于莖葉部，說明根部所受Cu脅迫傷害較大.可見，適宜濃度的LED3A能降低黑麥草體內(nèi)O-2·和H2O2含量，通過清除ROS來緩解Cu毒害，并抑制MDA的積累，從而減輕了細(xì)胞膜受傷害程度.

2.3 LED3A對(duì)黑麥草抗氧化酶活性的影響

在重金屬脅迫下，植物會(huì)產(chǎn)生ROS，引起脂質(zhì)過氧化，具體表現(xiàn)為植株中H2O2和MDA含量的累積，而植物中存在的抗氧化酶是減輕和修復(fù)ROS損傷的重要保護(hù)機(jī)制［26］.圖2中添加LED3A對(duì)Cu脅迫下黑麥草體內(nèi)抗氧化酶POD，SOD和CAT產(chǎn)生了激活效應(yīng)，隨著LED3A濃度的增大，黑麥草根和莖葉部3種酶活性總體呈先增后減的變化趨勢(shì)，且所有LED3A處理中不同抗氧化酶的活性均高于L0處理.其中，處理L50根和莖葉部

SOD較L0均存在顯著性差異，根和莖葉部L50（最高值）較L0分別提高了50.59%和55.94%.而處理

L100根部和莖葉部POD與CAT活性較L0分別增加了29.95%，22.52%和61.54%，17.78%，且根部3種酶活性均高于莖葉部，說明根在清除ROS時(shí)更具優(yōu)勢(shì).

LED3A可以通過螯合誘導(dǎo)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，促使黑麥草植株產(chǎn)生更多的POD，SOD和CAT，增強(qiáng)活性氧的清除效率，從而較好的維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕Cu脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷.LED3A濃度為200 mg·L-1時(shí)，由于MDA，O-2·和H2O2含量升高導(dǎo)致膜脂過氧化程度偏大，損傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，超過了抗氧化酶的防御調(diào)節(jié)范圍，使機(jī)體受損酶活性也隨之下降［27］.可見，SOD，POD和CAT三種酶活性協(xié)調(diào)一致，才能使ROS維持在一個(gè)較低水平，即在抗氧化酶之間達(dá)到適當(dāng)?shù)钠胶獠拍軐?duì)植株實(shí)現(xiàn)最佳的保護(hù)作用.總之添加LED3A后，黑麥草通過調(diào)控抗氧化酶活性仍保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài).

2.4 LED3A對(duì)黑麥草中Cu的亞細(xì)胞分布影響

細(xì)胞壁和液泡可作為植物細(xì)胞中重金屬含量較多的兩個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)［28］，即細(xì)胞壁固持和液泡區(qū)隔化作用是植物對(duì)重金屬脅迫的兩個(gè)主要抗性機(jī)制［29-30］.從表2可看出，有/無LED3A處理下，Cu在根細(xì)胞不同組分中的分配比例均為F1＞F2≥F3，細(xì)胞壁組分F1最高，占47.14%～62.33%；其次是細(xì)胞質(zhì)組分F2，占20.06%～28.32%；細(xì)胞器組分F3最少，占17.61%～24.54%，表明根部細(xì)胞中的Cu主要分布在細(xì)胞壁（F1）中.而莖葉中比例分配順序?yàn)镕2＞F1＞F3，可見，細(xì)胞質(zhì)（F2）是莖葉中Cu的主要分布場(chǎng)所，占比為47.14%～63.53%；其次為F1組分，占20.13%～37.42%；F3組分只占13.34%～16.52%.隨著LED3A添加量的增加，Cu在植物根和莖葉細(xì)胞內(nèi)不同組分的分配比例變化情況與L0處理相比結(jié)果不盡一致.根部F1呈顯著增加趨勢(shì)，F(xiàn)2和F3呈先增后減趨勢(shì)，說明根系主要依靠細(xì)胞壁的吸附作用以限制更多的Cu進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在Cu的固持和抗性積累中起到重要作用，該解毒機(jī)制可以保護(hù)原生質(zhì)體免受Cu毒害［31］.可見，加入LED3A使根系細(xì)胞壁對(duì)Cu的滯留作用增強(qiáng)［32］.隨著LED3A的加入使黑麥草莖葉F1和F3組分中Cu的比例下降，而F2組分中Cu的比例升高，這說明LED3A能提高Cu在黑麥草莖葉細(xì)胞質(zhì)中的積累，從而抑制Cu向葉綠體、線粒體和細(xì)胞核等細(xì)胞器組分中轉(zhuǎn)運(yùn)［33］.

2.5 LED3A對(duì)黑麥草提取Cu的影響

由表3可知，LED3A能顯著提高黑麥草根和莖葉部Cu濃度（P＜0.05），植株Cu濃度隨LED3A濃度增大呈逐漸增大趨勢(shì)，與L0相比，Cu+LED3A處理（L10～L200）根和莖葉部Cu濃度分別提高了10.39%～44.25%和2.33%～18.81%，且根部Cu含量顯著高于莖葉部.L200處理根和莖葉中Cu濃度分別達(dá)到最大值0.739和0.102 mg·g-1，是L0的1.45和1.19倍.黑麥草植株Cu積累量隨LED3A濃度增大呈先增后減趨勢(shì)，L10～L200處理較L0處理植株根、莖葉和總Cu積累量分別提高了16.87%～51.39%，3.23%～20.40%和11.64%～37.79%.根部和總Cu積累量的最大值均在L50處，分別為0.978和1.444 mg·pot-1，是L0處理的1.51和1.38倍；莖葉在L100處達(dá)到最大值，為0.484 mg·pot-1，是L0處理的1.20倍.LED3A能夠促進(jìn)Cu在污染水體-根部-地上部動(dòng)態(tài)平衡中的遷移，提高黑麥草對(duì)Cu的吸收累積，L50處理效果最佳，而高濃度LED3A（L200）雖能提高黑麥草根和莖葉部的Cu濃度，但由于根部生物量降低（表1），造成總Cu積累量有所降低.

LED3A降低了Cu從黑麥草根部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，所有LED3A處理Cu轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)較L0降低了7.14%～17.86%，處理間存在顯著差異（P＜0.05）.這是由于根部吸收Cu的速率明顯大于向地上轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，使大部分Cu積累于根部［15］.一方面是植物體內(nèi)沒有專一性的Cu離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)載體；另一方面是Cu的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)受植物蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度的影響，蒸騰速率增大才有利于促進(jìn)Cu離子通過載體蛋白和離子通道向地上部運(yùn)輸［34-35］.L10～L200處理下黑麥草對(duì)Cu的去除率和總Cu積累量分別在61.58%～76.00%和1.170～1.444 mg·pot-1之間，均高于L0處理，LED3A顯著強(qiáng)化了黑麥草對(duì)Cu的提取去除效率.

雖然L200處理下根和莖葉部Cu濃度最大，但轉(zhuǎn)移系數(shù)的明顯下降和生物量的減少影響了總Cu積累量，使其去除率較L50有所下降.重金屬常以螯合肽形式存在于植物細(xì)胞中，添加LED3A易與Cu形成Cu-LED3A絡(luò)合物被植物直接吸收，以維持細(xì)胞金屬離子的微量穩(wěn)定和緩解重金屬對(duì)植物的毒害，但添加過量LED3A會(huì)使細(xì)胞膜透性增強(qiáng)［36］，促使Cu進(jìn)入植株根部，可能引起重金屬的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生變化，Cu-LED3A絡(luò)合物沉積在細(xì)胞壁中解毒，減少了重金屬的跨膜運(yùn)輸，Cu向莖葉部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力也會(huì)受到限制.

3 結(jié)論

1）LED3A可促使黑麥草根部及總生物量略有提升，降低Cu脅迫下根和莖葉部活性氧含量，抑制MDA積累，提高抗氧化酶活性，以利于清除活性氧、減小細(xì)胞膜脂過氧化損傷，緩解Cu誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激.

2）細(xì)胞壁固持與液泡區(qū)隔化是黑麥草應(yīng)對(duì)Cu脅迫的重要耐性機(jī)制，LED3A作用下促進(jìn)了根部對(duì)Cu的吸收積累，并分配到細(xì)胞壁中固持解毒，而莖葉部則主要通過液泡區(qū)隔化發(fā)揮耐Cu功效.

3）LED3A能夠顯著提高黑麥草對(duì)Cu的去除性能，有效強(qiáng)化植物修復(fù)重金屬污染.Cu-LED3A絡(luò)合物沉積在根部細(xì)胞壁中解毒，減少了向莖葉部的轉(zhuǎn)運(yùn).最佳LED3A添加劑量下（L50），黑麥草總Cu積累量提高了37.79%，Cu的去除率達(dá)到76.00%.

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（責(zé)任編輯 陸泉芳）